Summary
אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.
Abstract
ליפידים הם מולקולות אמפיפתיים מגוונות האינן משונות במים. שומנים הם תורמים חיוניים לארגון ולתפקוד של ממברנות ביולוגיים, אחסון אנרגיה וייצור, איתות סלולרי, הובלה והעברה של חלבונים, ארגונית biogenesis, מוסדרות מוות תאים. בגלל שמרים להתחש סכביסים cerevisiae ס הוא חד חד-תאי איקריוטים לניתוח מולקולרי יסודית, השימוש בו כאורגניזם מודל עזר לחשוף מנגנונים המקשרים חילוף החומרים ליפיד ותחבורה תאיים לתהליכים ביולוגיים מורכבים בתוך תאים איקריוטית. הזמינות של שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה הכמותית האיתנה, הרגישה והמדויקת של מחלקות שומנים גדולות בתוך תא שמרים, חיונית לקבלת תובנות עמוקות במנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתמש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה מאסיבית (LC-MS/MS) עבור ניתוח כמותי של שומנים סלולריים מרכזיים של S. cerevisiae. שיטת LC-MS/MS המתוארת היא מגוונת ואיתנה. היא מאפשרת זיהוי וקוונפיקציה של מינים רבים (כולל צורות isobaric או איזואריק שונים) בתוך כל אחד 10 שיעורי השומנים. שיטה זו היא רגישה ומאפשרת זיהוי וכימות של כמה מינים שומנים בריכוזים נמוך כמו 0.2 pmol/μL. השיטה הוחלה בהצלחה על הערכת כיפות של תאי שמרים שלמים והאורגלים הטהרה שלהם. השימוש בתוספים אלטרנטיביים בשלב הנייד עבור הספקטרומטר ההמוני הגדול בשיטה זו יכול להגביר את יעילות האינון עבור מינים מסוימים של השומנים, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לשפר את הזיהוי והכמת שלהם.
Introduction
גוף של ראיות מציין כי שומנים, אחת המחלקות הגדולות של biomolecules, לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים חיוניים רבים בתוך תא איקריוטית. תהליכים אלה כוללים את ההרכבה של bilayers השומנים המהווים את קרום פלזמה וממברנות המקיפים אורגלים סלולריים, הובלה של מולקולות קטנות על פני ממברנות התא, תגובה שינויים בסביבה החילוץ והתמרה האות תאיים, הדור והאחסון של אנרגיה, ייבוא וייצוא של חלבונים מוגבלים אורגלים שונים, סחר בסמים של חלבונים בתוך מערכת endomembrane הפרשת חלבון, ומספר מצבים של מוות תא מוסדר1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10
שמרים שלהניצנים, האורגניזם איקריוטית, בהצלחה בשימוש כדי לחשוף חלק מהמנגנונים המשמשים את התפקידים החיוניים של שומנים בתהליכים סלולריים חיוניים אלה4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,12/10/4, 19 ,16,17,18,19,20. ס. cerevisiae ס הוא אורגניזם מודל יקר לחשיפת מנגנונים אלה משום שהוא מוכן לטיפול מקיף ביוכימיים, גנטי, תא ביולוגי, ביולוגי כימי, מערכת ביולוגית, וניתוח מיקרופלואידיג21,22,23,24,25. התקדמות נוספת בהבנת מנגנונים שדרכם מטבוליזם השומנים והתחבורה התאיים תורמים לתהליכים הסלולריים החיוניים הללו מחייב טכנולוגיות מורכבות של ספקטרומטר המסה עבור האפיון הכמותי של lipidome הסלולר, הבנת המורכבות המולקולרית של lipidome ושילוב lipidomics כמותי לתוך פלטפורמת רב תחומיתשל מערכותביולוגיה1,2 27,28,29,30.
שיטות נוכחיות של המיקרופרומטריה כמותית בסיוע lipidomics של תאים שמרים ותאים של אורגניזמים אחרים איקריוטית אינם מספיק רב-תכליתי, חזק, או רגיש. יתר על כן, אלה שיטות בשימוש כרגע אינם יכולים להבדיל מינים שונים isobaric או איזואריק השומנים אחד מהשני. כאן נתאר שיטה רב-תכליתית, איתנה ורגישה המאפשרת שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים (LC-MS/MS) לניתוח כמותי של שומנים סלולאריים מרכזיים של S. cerevisiae ס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה סטרילית לשמרים מפני שמרים
- להכין 90 mL של מדיום מלאה YP המכיל 1% (w/v) תמצית שמרים 2% (w/v) bactopeptone.
- הכינו 90 mL של בינוני סינתטי מינימלי YNB המכיל 0.67% (w/v) שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו, 20 מ"ג/L l-histidine, 30 מ"ג/l l-leucine, 30 מ"ג/l ל-ליזין, ו 20 מ"ג/l uracil.
- חילוק 90 mL של מדיום מלאה YP באופן שווה לתוך 2 250 mL Erlenmeyer אייר צלוחיות (כלומר, 45 mL כל אחד).
- חלוקת 90 mL של המדיום הסינתטי YNB מינימלי לתוך 2 250 mL Erlenmeyer מבחנות (כלומר, 45 mL כל אחד).
- להפעיל את מבחנות עם מדיה YP ו-YNB ב 15 psi/121 ° צ' עבור 45 דקות לפני השימוש.
2. זן שמרים
- השתמש בסוג פראי זן BY4742 (Matα His3Δ1 Leu2Δ0 Lys2Δ0 ura3Δ0).
3. שמרים culturing במדיום YP מלאה עם גלוקוז
- אוטוקלב a 20% (w/v) פתרון מניות של גלוקוז ב 15 psi/121 ° צ' עבור 45 דקות לפני השימוש.
- להוסיף 5 מ ל סטרילי 20% (w/v) מניות פתרון של גלוקוז לכל אחד שני מבחנות Erlenmeyer אייר המכיל את המדיום YP סטרילי עבור ריכוז סופי של 2% גלוקוז (w/v).
- השתמש לולאה מיקרוביולוגית כדי לחסן תאים של זן סוג פראי BY4742 לתוך כל אחד שני מבחנות Erlenmeyer אייר המכיל את מדיום YP עם גלוקוז.
- תרבות התאים לילה ב 30 ° צ' עם הסיבוב רועד ב 200 סל ד.
- . קח מעיל של תרבות שמרים השתמש במיציטומטר כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי שמרים לכל mL של התרבות.
4. העברת שמרים לתוך והוא במדיום הסינתטי מינימלי YNB עם גלוקוז
- להוסיף 5 מ ל סטרילי 20% (w/v) מניות פתרון של גלוקוז לכל אחד שני מבחנות Erlenmeyer אייר המכיל את המדיום YNB סטרילי לריכוז הסופי של 2% גלוקוז (w/v).
- השתמש בצנרת סטרילית כדי להעביר את הנפח של תרבות שמרים לילה המכיל את המספר הכולל של 5.0 x 107 תאים לתוך כל אחד מבחנות erlenmeyer אייר המכיל את המדיום ynb עם גלוקוז.
- תרבות התאים לפחות 24 שעות (או יותר, אם הניסוי דורש) ב 30 ° צ' עם הסיבוב רועד ב 200 סל ד.
5. הכנת ריאגנטים, עבדה אספקה וציוד להפקת שומנים בדם
- הכן את הפרטים הבאים: 1) כיתה גבוהה (> 99.9%) כלורופורם 2) כיתה גבוהה (> 99.9%) מתנול 3) 28% (v/v) הידרוקסידי הפתרון אמוניום הידרוקסיד במים טהורים; 4) חרוזי זכוכית (שטופים חומצה, 425-600 μM); 5) מערבולת עם מתאם הולם; 6) 15 מ"ל מהירות גבוהה זכוכית צנטריפוגה צינורות עם טפלון מרופדת בקבוקים; 7) 17:1 ו 2:1 תערובות של כלורופורם ו מתנול; 8) כלורופורם/מתנול (2:1) תערובת עם 0.1% אמוניום הידרוקסיד (v/v); 9) הפתרון ABC (155 מילימטר אמוניום ביקרבונט, pH = 8.0); 10) תערובת של תקני השומנים הפנימיים שהוכנו בתערובת 2:1 של כלורופורם ו מתנול כפי שמצוין בטבלה 1; ו -11) 2 מ"ל מדגם זכוכית מבחנות עם מכסי מרופדת polyטטרפלואורואתילן להפקת של שומנים סלולריים.
6. הכנת ריאגנטים, labware, וציוד עבור LC
- הכינו את הפרטים הבאים: 1) איטונטטריל/2-פרופנול/ננו-טהור מים (65:35:5) תערובת; 2) מערבולת עם מתאם הולם; 3) מsonicator אולטרה סאונד; 4) מבחנות זכוכית עם תוספות לצלחת; 5) מערכת LC מצויד במשאבה בינארית, מסיג גבול ומדגם אוטומטי; 6) טור סי18-שלב הפוך (2.1 מ"מ; 75 מ"מ; גודל הנקבוביות 130 Å; טווח של 1-11) משולב למערכת טרום-עמודה; 7) תערובת A: אספניטריל/מים (60:40); ו-8) תערובת ב: איזופנול (90:10).
7. השומנים החילוץ מתאי שמרים
- . קח מעיל של תרבות שמרים השתמש ב-הומוציטוטומטר או במדידה OD600 כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים שמרים לכל mL של התרבות.
- קח נפח של תרבות שמרים המכילה מספר כולל של 5.0 x 107 תאים (3.3 יחידות OD600). מניחים את הנפח הזה של התרבות לצינור מקורר 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
- לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
- להוסיף 1.5 mL של מים קרים ננו-טהור ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
- הוסף 1.5 mL של פתרון ABC קר הקרח ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט את הגלולה תא ניתן לאחסן ב-80 ° צ' לפני חילוץ השומנים.
- , להתחיל בחילוץ השומנים. להפשיר את הגלולה על הקרח
- השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-200 μL של מים קרים-ננו-זכים. העבר את ההשעיה התא ל 15 mL-כוח גבוה בורג הצינור העליון צנטריפוגה עם כובע מרופדת polyטטרפלואורואתילן. הוסף את הפרטים הבאים לצינור זה: 1) 25 μL של תערובת של תקני השומנים הפנימיים המוכנים בתערובת כלורופורם/מתנול (2:1); 2) 100 μL של 425-600 מיקרומטר מזכוכית שנשטפו בחומצה; ו 3) 600 μL של כלורופורם/מתנול (17:1) תערובת.
- מערבולת הצינור במהירות גבוהה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לשבש את התאים.
- מערבולת הצינור במהירות נמוכה עבור 1 h ב RT כדי להקל על החילוץ של שומנים.
- מודדת את המדגם עבור 15 דקות על הקרח כדי לקדם את משקעים החלבון ואת הפרדת השלבים מימית ואורגני אחד מהשני.
- צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x g עבור 5 דקות ב-RT. זה צעד צנטריפוגה מאפשר להפריד את השלב העליון מימית מן השלב האורגני התחתון, אשר מכיל את כל שיעורי השומנים.
- השתמש בצפטה זכוכית בורוסיליקט כדי להעביר את השלב האורגני התחתון (~ 400 μL) לעוד 15 מ"ל בורג זכוכית מחוזק גבוה בראש צנטריפוגה עם כובע מרופד פוליטטאואתילן. אין לשבש את חרוזי הזכוכית או שלב המים העליון במהלך העברה. לשמור על השלב האורגני התחתון תחת הזרם של גז חנקן.
- הוסף 300 μL של כלורופורם-מתנול (2:1) התערובת לשלב העליון מימית הנותרים כדי לאפשר חילוץ של ספינגוליפידים ו-PA, PS, PI, ו-CL. מערבולת הצינור במרץ עבור 5 דקות ב RT.
- צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x g עבור 5 דקות ב-RT.
- השתמש בזפטה זכוכית בורוסיליקט כדי להעביר את השלב האורגני התחתון (~ 200 μL) נוצר לאחר צנטריפוגה לשלב אורגני שנאסף בשלב 7.13.
- השתמש בזרימת גז חנקן כדי לאדות את הממס בשלבים האורגניים המשולבים. סגור את הצינורות המכילים את הסרט השומנים תחת הזרימה של גז חנקן. אחסן את הצינורות האלה ב-80 ° c.
8. הפרדת שומנים שחולצו על ידי LC
- הוסף 500 μL של acetonitrile/2-propanol/ננו-טהור מים (65:35:5) תערובת לצינור המכיל את הסרט ליפיד שהתקבל בשלב 7.16. מערבולת צינור 3x עבור 10 s ב RT.
- נושא את התוכן של הצינור כדי אולטראסוניות sonication עבור 15 דקות. מערבולת צינור 3x עבור 10 s ב RT.
- קח 100 μL של מדגם מהצינור והוסף אותו לבקבוקון זכוכית עם הוספה המשמשת לצלחת. לחסל את בועות האוויר בתוך הכנס לפני שהוא הצועד לתוך הצלחת.
- השתמש במערכת LC להפריד בין מינים שומנים בדם בשלב ההפוך סי18 עמודה CSH מצמידים למערכת טרום העמודה (ראה טבלת חומרים). במהלך ההפרדה, יש לשמור על הטור ב55 ° c ובקצב הזרימה של 0.3 mL/min. לשמור את המדגם בצלחת wellplate
- השתמש בשלבים הניידים המורכבים מתערובת A (60:40 (v/v)) ותערובת B ((v) ו-"תרכובת" 90:10 (ב-v). למצב חיובי של זיהוי יוני אב שנוצר באמצעות מקור היונים אלקטרונון (ESI), במצב ESI (+), השלבים הניידים A ו-B מכילים אמוניום בריכוז הסופי של 10 מ"מ. עבור מצב שלילי של זיהוי יונים הורים, המצב ESI (-), השלבים הניידים A ו-B מכילים מסוג אמוניום אצטט בריכוז הסופי של 10 מ"מ.
- השתמש באמצעי אחסון מדגם של 10 μL עבור ההזרקה הן במצב ESI (+) והן ב-ESI (-).
- הפרד מין שומנים במינים שונים על ידי LC באמצעות הדרגה הבאה של LC: 0-1 דקות 10% (שלב ב'); 1-4 דקות 60% (שלב ב'); 4-10 דקות 68% (שלב ב'); 10-21 97% (שלב ב'); 21-24 דקות 97% (שלב ב'); 24-33 דקות 10% (שלב ב').
- הפעל כדורי סרק כדוגמה הראשונה, בין כל ארבע דגימות, וכדוגמה האחרונה. הפחת את הרקע כדי לנרמל נתונים.
- מייצג הכולל יון chromatogram מן LC/MS נתונים של שומנים שחולצו מתאים של סוג פראי זן BY4742 מוצג באיור 1.
9. ניתוח ספקטרומטרי מסה של שומנים מופרדים על ידי LC
- השתמש ספקטרומטר מסה מצויד HESI (מחומם לתרסיס ionization) מקור יון לנתח שומנים שהיו מופרדים על ידי LC. השתמש בהגדרות המפורטות בטבלה 2.
- השתמש במנתח התמרת פורייה כדי לזהות יוני אב (MS1) ברזולוציה של 60,000 ובטווח ההמוני של 150-2000 Da.
- השתמש בהגדרות המפורטות בטבלה 3 כדי לזהות יונים משניים (MS2).
10. זיהוי וכימות של שיעורי שומנים ומינים שונים על ידי עיבוד של נתונים גולמיים מ-LC-MS/MS
- לראות את הטבלה של חומרים עבור תוכנה לבצע זיהוי וכימות של שומנים שונים מקבצי LC-MS/ms raw. תוכנה זו משתמשת במסד הנתונים הגדול ליפיד, המכיל יותר מ-1,500,000 יונים ליפידים (MS1) ויוני הקטעים החזוי שלהם (MS2). התוכנה משתמשת גם MS1 פסגות עבור כימות השומנים ו MS2 עבור זיהוי השומנים. כרומאטוגרמה ייצוגית של שני צורות איזואריק פוספוליזה (34:0) שיש להם אותו ערך m/z אבל זמני שמירה שונים, כמו גם MS1 וMS2 ספקטרה שלהם, מוצגים באיור 2, איור 3, איור 4, בהתאמה.
- חיפוש קבצים גולמיים של LC-MS המכילים נתוני סריקה מלאה MS1 נתונים ונתוני MS2 התלויים בנתונים עבור חומצות שומן בחינם (FFA), קרדיאוליפין (קלרנית), פיטוגראמיד (PHC), פיטוספיליגוסין (מחשב הבית), זרחן (PE), פוספולידיליגליל (PG), פוספטרדיליינילינטול (PI), פוספדיליסרין (PS), וטריקלגלילרול (תג) שיעורי השומנים באמצעות הסובלנות m/z של 5 דפים לדקה עבור יוני מקודמי ו-10 דפים לדקה עבור יוני מוצרים. פרמטרי חיפוש אחרים מוצגים בטבלה 4. בצע את ההוראות המופיעות במדריך למשתמש של התוכנה. הזהויות של תקני השומנים הפנימיים ומינים שומנים בדם עם הרכב חומצת שומן יוצא דופן צריך להיות מאומת ידנית.
- כדי לזהות בקוונטייט שונים שיעורי השומנים ומינים בעזרת חלופות חופשיות מקור פתוח עבור תוכנת החיפוש ליפיד, השתמש במנתח נתונים ליפיד (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), Mzmine 2 (http://mzmine.github.io/), או xcms (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) תוכנה כדי לעבד נתונים גולמיים מ-LC-ms/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה שלנו להערכה כמותית של שומנים סלולריים מרכזיים בתוך תא שמרים בעזרת LC-MS/MS היה רב-תכליתי וחסון. זה איפשר לנו לזהות ולכמת 10 שיעורים שונים ליפיד בתאי S. cerevisiae ס תרבותי במדיום הסינתטי מינימלי ynb מכיל בתחילה 2% גלוקוז. שיעורי השומנים הללו כוללים חומצות שומן בחינם (FFA), קלרנית, פיטוגראמיד (PHC), פיטוספילסין, מחשב, PE, PG, PI, PS ו-TAG (שולחן משלים 1). מינים מולקולריים רבים של כל אחד מהשיעורים הללו זוהו וכוללו באמצעות שיטת LC-MS/MS זו (טבלה משלימה 1).
שיטת LC-MS/MS שלנו היה גם רגיש. אכן, היא אפשרה זיהוי וכימות של מינים מולקולריים של שומנים בריכוזים נמוך כמו 0.165 pmol/μL (לראות נתונים עבור phytoceramide בטבלה 5). מגבלה זו של כימות שונה עבור שיעורי השומנים השונים במגוון רחב של ריכוזים (שולחן 5).
חשוב מכך, השיטה שלנו מאפשרת זיהוי וכימות של צורות איזואוארית או איזואריק שונות של שומנים. צורות איזואוארית של שומנים הם מינים השומנים עם המסה הנומינלית זהה (כלומר, סכום של ההמונים של האיזוטופים הנפוצים ביותר) אבל שונות הגושים המדויקים31. צורות איזואריק של שומנים הם מינים שומנים בדם עם אותה נוסחה מולקולרית אך עם מבנה כימי שונה31. לדוגמה, השימוש בשיטת LC-MS/MS המצוין בין PHC (16:0_26:0) והמחשב המיני של מיני השומנים isobaric (16:0_26:0): למרות שיש להם את אותו ערך מסה נומינלי של 650, הגושים המדויקים שלהם הם 650.6457 ו 650.4755, בהתאמה. יתר על כן, זו שיטת LC-MS/MS הנבדל בין שני זוגות של מינים השומנים של איזואריק עם הנוסחה המולקולרית זהה אבל מבנה כימי שונה: 1) PC (18:0_18:1) ו-PC (20:0_18:1), עם נוסחה מולקולרית (C44H87N1O8P1) ומסה מדויקת (788.6163); ו-2) PE (16:0_16:0) ו-PE (14:0_16:0), עם הנוסחה המולקולרית (C37H75N1O8P1) ומסה מדויקת (692.5224).
שיטת LC-MS/MS שלנו ניתן להשתמש כדי להגביר את היעילות של אינון עבור שומנים של כל המחלקות, ובכך לשפר את זיהוי וכימות של שומנים סלולריים הגדולות. שיפור כזה יכול להיות מושגת על ידי שימוש אלטרנטיבי השלב תוספים ניידים לטרשת נפוצה (שולחן 6). אלה שלבים חלופיים כוללים אמוניום formate, אמוניום formate עם חומצה פורמית, אצטט אמוניום, אמוניום אצטט עם חומצה אצטית, ואצטט אמוניום עם חומצה formate. כל אחד התוספים החלופיים האלה השלב הנייד יכול לשמש הן בשלב רגיל ו-LC-שלב הפוכה עמודות (שולחן 6).
יתרון נוסף של שיטת LC-MS/MS שלנו מורכב ביכולת להשתמש בשתי שיטות שונות לפיצול של יונים מקודמי (MS1) של שומנים לתוך מוצרים MS2. שתי שיטות אלה הם האנרגיה הגבוהה המושרה דיסוציאציה (HCD) ו-התנגשות הנגרמת דיסוציאציה (CID)32. מצאנו כי שיטת CID הוא מועיל אם נעשה שימוש בשילוב עם התוסף אמוניום אצטט שלב עבור ESI (-) מצב של MS, כמו בתנאים אלה הוא מאפשר עלייה ביעילות של פיצול יון MS1 ליפיד למוצרים MS2 עבור PHC, קלרנית, FFA, PE, PG, PI, ו-PS (שולחן 7). לעומת זאת, שיטת HCD היא חיובית אם נעשה שימוש בשילוב עם תוסף אמוניום formate השלב הנייד עבור ESI (+) מצב של MS, כמו בתנאים אלה הוא מאפשר עלייה ביעילות של MS1 ion השומנים לתוך מוצרים MS2 עבור PC, האלפים ו-TAG (שולחן 8).
איור 1: הכולל יון כרומאטוגרם (TIC) מתוך כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטר מסה (LC/MS) נתונים של שומנים שחולצו מתאים של זן סוג פראי BY4742. TIC של שומנים מופרדים על ידי LC על עמודה בשלב הפוך csh סי18 וזוהה על ידי MS של יוני הורים שנוצרו באמצעות מצב שלילי התרסיס יינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כרומוטוגרמה של שתי צורות פוספוליאיסרין (34:0) בעלי אותו ערך m/z (m-H) של 762.5294 אך זמני שמירה שונים של 7.65 דקות ו-8.49 min. השומנים חולצו מתאים של זן סוג פראי BY4742 ומופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית על העמודה בשלב ההפוך CSH סי18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: MS1 ספקטרום של שני מינים הזרחן איזואריק (34:0) כי יש את אותו ערך m/z (m-H) של 762.5294 אבל זמני שמירה שונים של 7.65 דקות ו-8.49 min. השומנים חולצו מתאים של זן סוג פראי BY4742, מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית על הפוך השלב האחורי csh סי18 (כפי שמוצג באיור 2) וזוהה על ידי הספקטרומטר ההמוני של הורה (MS1) יונים שנוצרו באמצעות במצב שלילי התרסיס יינון. (א) הספקטרום הMS1 של טופס פוספולידיסרין (34:0) עם ערך m/z (m-H) של 762.5294 וזמן ההחזקה של 7.65 דקות. (ב) הספקטרום הMS1 של טופס פוספולידיסרין (34:0) עם ערך M/z (m-H) של 762.5294 וזמן ההחזקה של 8.49 דקות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: MS2 ספקטרום של שני מינים הזרחן איזואריק (34:0) שיש להם אותו ערך m/z (m-H) של 762.5294 אבל זמני שמירה שונים של 7.65 דקות ו-8.49 min. השומנים חולצו מתאים של זן סוג פראי BY4742, מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית על הפוך בשלב ההפוך CSH סי18 (כפי שמוצג באיור 2) וזוהה על ידי ספקטרומטר המוני של MS1 יונים (כפי שמוצג באיור 3). יונים משניים (MS2) זוהו לאחר מכן על ידי ספקטרומטר מסה. (א) הספקטרום הMS2 של טופס פוספולידיסרין (34:0) עם ערך m/z (m-H) של 762.5294 וזמן ההחזקה של 7.65 דקות. אובדנו של סרין moiety הפיק יון עם ערך m/z (M-H) של 675.6149. (ב) הספקטרום הMS2 של טופס פוספולידיסרין (34:0) עם ערך m/z (m-H) של 762.5294 וזמן ההחזקה של 8.49 דקות. אובדנו של סרין moiety הפיק יון עם ערך m/z (M-H) של 675.8843. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מצב איתור | מחלקת ליפיד | הרכב זנב הידרופובי | ערך m/z מחושב | ריכוז (pmoles/μl) |
| שלילי | צראמיד | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| שלילי | קרדיאוליפין | 14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| שלילי | חומצת שומן חופשית | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| שלילי | פוספולידילטהולמין | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| שלילי | פוספולידיליגלירול | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| שלילי | פוספולידילייניטול | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| שלילי | פוספולידיסרין | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| חיובי | פוספולידיליולין | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| חיובי | פיטוספירגוסינוס | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| חיובי | טריקלגליצרול | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
טבלה 1: הרכב של תערובת של תקני השומנים הפנימיים. תקני השומנים הפנימיים הוכנו בתערובת כלורופורם/מתנול (2:1). מצב הזיהוי מתייחס למצב חיובי או שלילי של זיהוי יונים של הורים באמצעות ספקטרומטר המסה של אורדרראפ וולאוס המצויד במקור היון (ESI). ערכי m/z המחושבים הם עבור הספיחה של שומנים.
| FTMS + רזולוציה p | 60000 |
| מגוון מסה (דלתון) | 150-2000 |
| סוג מקור יונים | מיכל הייסי |
| טמפ ' קפילר (° צ') | 300 |
| טמפרטורת מקור (° c) | 300 |
| נדן זרימת גז | 10 |
| זרם גז עזר | מיכל 5 |
| מתח קוטביות חיובי (kV) | 3 |
| מתח קוטביות שלילי (kV) | 3 |
| זרם מקור (μA) | 100 |
שולחן 2: הגדרות ספקטרומטר המסה של האורדרראפ השתמשו כדי לנתח שומנים שהופרדו על ידי LC. קיצורים: FTMS + p = מבוססי פורייה מבוססת הספקטרומטר המסה במצב ESI (+); HESI = אינון מחומם לרסס.
| קוטביות | חיובי | שלילי |
| סוג הפעלה | אנרגיה גבוהה הנגרמת על-ידי התנגשות-דיסוציאציה | התנגשות-הנגרמת-דיסוציאציה |
| נדרש אות מינימלי | 5000 | 5000 |
| רוחב בידוד | 2 | 2 |
| אנרגיית התנגשות מנורמלת | 55 | 35 |
| מצב חיוב ברירת מחדל | 2 | 2 |
| זמן ההפעלה | 0.1 | 10 |
| הרזולוציה של FTMS + C | 7500 | |
| 5 הפסגות האינטנסיביות ביותר נבחרו עבור ms/ms |
שולחן 3: הגדרות ספקטרומטר המסה של אורלדרראפ המשמשות לזיהוי יונים משניים (MS2). קיצור: FTMS + C = מבוסס על המרה פורייה המבוססת על הספקטרומטר במצב ESI (+).
| זיהוי | |
| מסד | אורדרראפ |
| זיהוי שיא | זיכרון איזוטופ (מופעל) |
| האפשרות ' חיפוש ' | חיפוש מוצר אורדרראפ |
| סוג חיפוש | מוצר |
| סוג ניסוי | מדים-משגב |
| הסובלנות קודמן | 10 עמודים לדקה |
| עמידות למוצר | גבוהה-אנרגיה המושרה-התנגשות-דיסוציאציה [ESI (+) מצב]: 20 עמודים לדקה |
| התנגשות-הנגרמת-דיסוציאציה [ESI (-) מצב]: 0.5 Daltons | |
| כימות | |
| ביצוע כימות | על |
| ז/ז סובלנות | -5.0; + 5.0 |
| סוג הסובלנות | ppm |
| סנן | |
| מסנן דירוג עליון | על |
| מסנן צומת ראשי | פסגת איזומר הראשי |
| m-סף נקודות | מיכל 5 |
| c-סף ציון | 2 |
| עדיפות FFA | על |
| מסנן איכות מזהה | A: מעמד השומנים & כל חומצות שומן מזוהים לחלוטין |
| ב: מחלקת השומנים & כמה חומצות שומן מזוהות | |
| ג: מעמד ליפיד או פא מזוהים | |
| D: השומנים שזוהו על ידי יוני קטעים אחרים (H2O, וכו ') | |
| מחלקת ליפיד | |
| אנרגיה גבוהה-המושרה-התנגשות-דיסוציאציה [ESI (+) מצב] | מחשב, תג |
| התנגשות-הנגרמת-דיסוציאציה [ESI (-) מצב] | CER, קלרנית, FFA, PE, PG, PI, PS |
| יונים | |
| אנרגיה גבוהה-המושרה-התנגשות-דיסוציאציה [ESI (+) מצב] | + H; + NH4; + Na |
| התנגשות-הנגרמת-דיסוציאציה [ESI (-) מצב] | H 2H -הוראות המשך |
טבלה 4: הפרמטרים לחיפוש המשמשים לזיהוי מחלקות השומנים שונים ומינים בעזרת תוכנת זיהוי ליפיד "חיפוש ליפיד" (V 4.1). קיצורים: CER = ceramide; קלרנית = קרדיו, מספר שתיים; FFA = חומצת שומן חופשית (לא מעשית); מחשב = פוספולידיליולין; PE = זרחן; PG = פוספלגליליצרול; PI = זרחן התיכון; נ. ב. הפודיליסרין; תג = triacylגליצרול.
טבלה 5: הריכוזים הנמוכים ביותר של המינים המולקולריים של שיעורי השומנים השונים שניתן לזהות ולכמת בעזרת שיטת LC-ms/ms שלנו. הערכה של הריכוז כימות הנמוך ביותר עבור כל מחלקה השומנים מבוססת על אזורי שיא MS עבור התקן הפנימי שלה (אלה באזורים הפסגה MS וריכוזים סטנדרטיים השומנים מוצגים מודגש) ואת הטופס המולקולרי המייצג שלה נוכח הריכוז הנמוך ביותר לזיהוי. נתונים מוצגים כערכים ממוצע של שני ניסויים עצמאיים, עבור כל אחד מהם שלושה משכפל טכני בוצעו. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
| תקן ליפיד | מצב ESI | שרדה | AmF/פא | אמאק | AmAc/AA | אמאק/פא |
| PHC | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| קלרנית | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| FFA | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| PE | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| PG | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| PI | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| PS | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| מחשב | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| בבריכה | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| תג | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
טבלה 6: ההשפעות של תוספים השלב הנייד האלטרנטיבי לטרשת נפוצה על היעילות של אינון לשומנים של מחלקות שונות. ליפידים שונים הופרדו זה מזה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משלב הפוך. תקני השומנים המסחריים השייכים לכיתות שונות של שומנים נקראים בטבלה 1. The ESI (-) או ESI (+) מצב של אינון שימש MS בנוכחות תוספים שונים שלב הסלולר. אחוז היינון עבור כל תקן השומנים מוצג כערך ממוצע משלוש משכפל טכני. עבור כל השומנים, אחוזי היינון חושבו בהתבסס על אזור הפסגה של MS. ערך של יעילות האינון הגבוהה ביותר עבור כל השומנים מוצג בהדגשה. קיצורים: AmF = אמוניום; AmF/FA = אמוניום באמצעות חומצה פורמית; AmAc = אמוניום אצטט; AmAc/AA = אמוניום אצטט עם חומצה אצטית; AmAc/FA = אמוניום אצטט עם חומצה פורמית; קלרנית = קרדיו, מספר שתיים; FFA = חומצת שומן חופשית (לא מעשית); מחשב = פוספולידיליולין; PE = זרחן; PG = פוספלגליליצרול; PHC = פיטופין; מזגוג = פיטוספיגולוסינוס; PI = זרחן התיכון; נ. ב. הפודיליסרין; תג = triacylגליצרול.
| תקן ליפיד | מצב ESI | שרדה | אמאק |
| PHC | - | 75 | 83.8 |
| קלרנית | - | 70.9 | 79.3 |
| FFA | - | 76.1 | 74.5 |
| PE | - | 98 | 95 |
| PG | - | 64 | 75.9 |
| PI | - | 79.3 | 82.5 |
| PS | - | 71.5 | 84.8 |
| מחשב | + | 52.3 | 60.5 |
| בבריכה | + | 78.4 | 75.2 |
| תג | + | 65.7 | 69.7 |
טבלה 7: ההשפעה של שיטת הדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID) על היעילות של יונים מקודמי (MS1) פיצול. תקני השומנים המסחריים השייכים לכיתות שונות של שומנים נקראים בטבלה 1. The ESI (-) או ESI (+) במצב של אינון שימש עבור MS, בנוכחות מכשיר אמוניום (AmF) או אמוניום אצטט (Amf) תוסף שלב נייד. אחוז היונים השומנים הMS1 שהיו מפוצלים למוצרי MS2 מוצג כערך ממוצע משלוש משכפל טכני. עבור כל שומנים בדם, אחוזי היינון חושבו בהתבסס על אזור הפסגה MS2. ערך של האחוז הגבוה ביותר של יוני MS1 השומנים שהיו מפוצלים מוצג מודגש עבור כל השומנים (להשוות עם הנתונים המוצגים בטבלה 8). ערך זה הוא הגבוה ביותר אם היעילות של היווצרות יון מוצרים MS2 הוא הגבוה ביותר. קיצורים: CL = קרדיופינים; FFA = חומצת שומן חופשית (לא מעשית); מחשב = פוספולידיליולין; PE = זרחן; PG = פוספלגליליצרול; PHC = פיטופין; מזגוג = פיטוספיגולוסינוס; PI = זרחן התיכון; נ. ב. הפודיליסרין; תג = triacylגליצרול.
| תקן ליפיד | מצב ESI | שרדה | אמאק |
| PHC | - | 68.4 | 65.4 |
| קלרנית | - | 74.3 | 75.2 |
| FFA | - | 84.2 | 81.2 |
| PE | - | 85.1 | 73.1 |
| PG | - | 68.4 | 67.1 |
| PI | - | 58.7 | 55.8 |
| PS | - | 67.4 | 68.5 |
| מחשב | + | 92.5 | 65.3 |
| בבריכה | + | 87.1 | 75.1 |
| תג | + | 91.4 | 84.9 |
טבלה 8: ההשפעה של שיטת הדיסוציאציה האנרגטית (HCD) בעלת אנרגיה גבוהה, על מנת לייעל את הפיצול של יונים מקודמי (MS1). תקני השומנים המסחריים השייכים לכיתות שונות של שומנים נקראים בטבלה 1. The ESI (-) או ESI (+) במצב של אינון שימש עבור MS, בנוכחות מכשיר אמוניום (AmF) או אמוניום אצטט (Amf) תוסף שלב נייד. אחוז היונים השומנים הMS1 שהיו מפוצלים למוצרי MS2 מוצג כערך ממוצע משלוש משכפל טכני. עבור כל שומנים בדם, אחוזי היינון חושבו בהתבסס על אזור הפסגה MS2. ערך של האחוז הגבוה ביותר של יוני MS1 השומנים שהיו מפוצלים מוצג מודגש עבור כל השומנים (להשוות עם הנתונים המוצגים בטבלה 7). ערך זה הוא הגבוה ביותר אם היעילות של היווצרות יון מוצרים MS2 הוא הגבוה ביותר. קיצורים אחרים: CL = קרדיופינים; FFA = חומצת שומן חופשית (לא מעשית); מחשב = פוספולידיליולין; PE = זרחן; PG = פוספלגליליצרול; PHC = פיטופין; מזגוג = פיטוספיגולוסינוס; PI = זרחן התיכון; נ. ב. הפודיליסרין; תג = triacylגליצרול.
טבלה משלימה 1: רשימה של מינים מולקולריים של 10 מחלקות השומנים שונים מזוהה וכימות בתאי S. cerevisiae ס בעזרת שיטת LC-MS/ms שלנו. שיעורי השומנים הללו כוללים חומצות שומן בלתי משותות (FFA), קרדיואוליפין (קלרנית), פיטוגראמיד (PHC), פיטוספיליסין, פוספטרדיוליכולין (מחשב), פוספטרדיקליליטהאמין (PE), פוספולידיגלילצרול (PG), פוספולידיליליניטול (PI), פוספוליאיסרין (PS), ו-triacylol (תג). תאי cerevisiae ס היו מתורבתים במדיום הסינתטי ynb מינימלי מכיל בתחילה 2% גלוקוז. אליבטים של תאים שמרים עבור חילוץ השומנים ו-LC-MS/MS ניתוח של שומנים שחולצו התגלו בימים 1, 2, 3, 4, 6, 8, ו 10 של culturing. כל המינים השומנים של כל מחלקה השומנים שזוהו בתאי שמרים התאושש בימים שונים של culturing מוצגים. כמה מינים אלה השומנים היו נוכחים רק בסדר כרונולוגי התאים הצעירים שמרים התאושש בימים 1-4 של culturing, אחרים רק כרונולוגי הישן תאים שמרים התאושש בימים 6-10 של culturing, ואילו כמה היו נוכחים הן בסדר היום בסדר שמרים צעירים וישנים. אזור הפסגה MS הגבוהה ביותר עבור כל מיני השומנים של כל מחלקה ליפיד מזוהה ביום מסוים של culturing מוצג. סטנדרטים השומנים של שיעורי השומנים השונים ששימשו עבור כימות של מינים אחרים בתוך מחלקה זו ליפיד מוצגים בצבע אדום. ערכי m/z המחושבים הם עבור הספיחה של שומנים. קיצור: ESI (-) = המצב ESI (-) של MS; ESI (+) = מצב ESI (+) של MS. נתונים מוצגים כערכים ממוצע של שני ניסויים עצמאיים, עבור כל אחד מהם שלושה משכפל טכני בוצעו. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אמצעי הזהירות הבאים חשובים ליישום המוצלח של הפרוטוקול המתואר כאן:
1. כלורופורם ומתנול רעילים. הם מחלצים ביעילות חומרים שונים ממשטחים, כולל פלסטלינה, מעבדה ועור. לכן, לטפל אלה ממיסים אורגני עם זהירות על ידי הימנעות השימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כלורופורם ו/או מתנול, באמצעות פיפטות זכוכית בורוסיליקט עבור שלבים אלה, ושטיפה אלה הפיפטות עם כלורופורם ו מתנול לפני השימוש.
2. במהלך הפקת השומנים על ידי מתנול/כלורופורם (17:1) תערובת, השימוש בצינור זכוכית בורוסיליקט כדי להעביר את השלב האורגני התחתון (~ 400 μL) ל 15 mL-כוח גבוהה בורג הראש צנטריפוגה הצינור עם כובע מרופדת polyטטרפלואורואתילן. אין לשבש את חרוזי הזכוכית או שלב המים העליון במהלך העברה. לשמור על השלב האורגני התחתון תחת הזרם של גז חנקן.
3. במהלך ההכנה לדוגמה ל-LC-MS/MS, חשוב לחסל את כל בועות האוויר בבקבוקונים זכוכית לפני החדרת הבקבוקונים לתוך צלחת wellplate
4. כדי להשיג מסיסות מלאה של אמוניום formate ו אמוניום אצטט בשלבים ניידים A ו-B לפני הפרדה השומנים על ידי LC, לפזר כל מלח ב 500 μL של מים ננו-טהור לפני ערבוב הפתרון עם השלב הנייד ו sonicating עבור 20 דקות.
5. אין לאחסן את הסרט השומנים שנוצר לאחר אידוי הממס לתקופה ארוכה של זמן לפני הריצה. אנו לאחסן את הסרט ב-80 ° c עבור לא יותר משבוע לפני המסת אותו בתוך acetonitrile/2 propanol/ננו-טהור מים (65:35:5) תערובת ולאחר מכן לחשוף את השומנים כדי LC-MS/MS.
שיטת LC-ms/ms המתוארת כאן היא טכניקה רב-תכליתית, איתנה ורגישה להערכה כמותית של מינים רבים של השומנים המרכיבים את lipidome הסלולר של שמרים או כל אורגניזם איקריוטית אחרים. השיטה מאפשרת זיהוי וכימות של מינים שונים של isobaric או איזואריק השומנים, מאפשר להשתמש בתוספים השלב הנייד החלופי עבור הגברת ESI כדי לקדם את אינון השומנים ולעשות זיהוי שומנים וכימות יעיל יותר, והוא יכול להשתמש הן hcd ו CID שיטות לפיצול או הפעלה של MS1 ל
אנו משתמשים בשיטה זו LC-MS/MS כדי ללמוד שינויים בגיל הקשורים התאים הסלולר והאורגוניים במהלך הזדקנות כרונולוגי של שמרים מראה. אנו מעסיקים גם שיטה זו כדי לחקור כמה הזדקנות-עיכוב גנטית, תזונתיים, והתערבויות תרופתי השפעה הרכב השומנים של התא השלם של cerevisiae ס ואת האורגלים השונים שלה. בגלל צדדיות שלה, חוסן, ורגישות, זו שיטת LC-ms/MS ניתן להשתמש בהצלחה עבור הערכה כמותית של ליפירוטים הסלולר והאורגאוטיים באורגניזמים איקריוטית ברחבי phyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לחברים הנוכחיים ולשעבר של מעבדת טיטורנקו לדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של המסה ספקטרומטריה והמרכז לגנומיקה מבנית ופונקציונלית (הן באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים יוצאי דופן. מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482) ו האוניברסיטה האוניברסיטאי קונקורדיה קרן (CC0113). ק היה נתמך על ידי פרס הצטיינות באוניברסיטת קונקורדיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
