Summary
Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.
Abstract
Les lipides sont des molécules amphipathiques structurellement diverses qui sont insolubles dans l’eau. Les lipides sont des facteurs essentiels à l’organisation et à la fonction des membranes biologiques, du stockage et de la production d’énergie, de la signalisation cellulaire, du transport vésiculaire des protéines, de la biogenèse d’organelle et de la mort cellulaire réglementée. Parce que la levure naissante Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire favorable à des analyses moléculaires approfondies, son utilisation comme un organisme modèle a aidé à découvrir des mécanismes reliant le métabolisme des lipides et le transport intracellulaire à des processus biologiques complexes dans les cellules eucaryote. La disponibilité d’une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise des grandes classes de lipides au sein d’une cellule de levure est cruciale pour obtenir des connaissances approfondies sur ces mécanismes. Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires principaux de S. cerevisiae. La méthode LC-MS/MS décrite est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de nombreuses espèces (y compris différentes formes isobariques ou isomériques) dans chacune des 10 classes de lipides. Cette méthode est sensible et permet l’identification et la quantitation de certaines espèces lipidiques à des concentrations aussi basses que 0,2 pmol/L. La méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des lipidomes des cellules entières de levure et de leurs organites purifiés. L’utilisation d’additifs alternatifs de phase mobile pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray dans cette méthode peut augmenter l’efficacité de l’ionisation pour certaines espèces lipidiques et peut donc être utilisée pour améliorer leur identification et leur quantitation.
Introduction
Un ensemble de preuves indique que les lipides, l’une des principales classes de biomolécules, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus vitaux au sein d’une cellule eucaryote. Ces processus comprennent l’assemblage de bilayers lipidiques qui constituent la membrane plasmatique et les membranes entourant les organites cellulaires, le transport de petites molécules à travers les membranes cellulaires, la réponse aux changements de l’environnement extracellulaire et la transduction intracellulaire du signal, la production et le stockage de l’énergie, l’importation et l’exportation de protéines confinées à différents organites, le trafic vésicular des protéines dans le système endomémbrane et la sécrétion de protéines, et plusieurs modes de la cellule de mort réglementée1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La levure en herbe S. cerevisiae, un organisme eucaryote unicellulaire, a été utilisé avec succès pour découvrir certains des mécanismes sous-jacents aux rôles essentiels des lipides dans ces processus cellulaires vitaux4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae est un organisme modèle précieux pour découvrir ces mécanismes parce qu’il est favorable à la biochimie complète, génétique, biologique cellulaire, biologique chimique, biologique du système biologique, et microfluidique dissection analyses21,22,23,24,25. D’autres progrès dans la compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme lipidique et le transport intracellulaire contribuent à ces processus cellulaires vitaux nécessite des technologies sensibles de spectrométrie de masse pour la caractérisation quantitative du lipidome cellulaire, la compréhension de la complexité moléculaire lipidome, et l’intégration de lipidomiques quantitatifs dans une plate-forme multidisciplinaire de biologie des systèmes1,2,3,26, 27,28,29,30.
Les méthodes actuelles pour la lipidomique quantitative de masse assistée par spectrométrie des cellules et des cellules de levure d’autres organismes eucaryotes ne sont pas suffisamment polyvalentes, robustes ou sensibles. En outre, ces méthodes actuellement utilisées sont incapables de différencier diverses espèces de lipides isobariques ou isomériques les unes des autres. Ici, nous décrivons une méthode polyvalente, robuste et sensible qui permet l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires majeurs de S. cerevisiae.
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Protocol
1. Préparation de supports stériles pour la culture de la levure
- Préparer 90 ml d’un milieu VP complet qui contient 1% (w/v) extrait de levure et 2% (w/v) bactopeptone.
- Préparer 90 ml d’un milieu synthétique minimal de la BNNB contenant 0,67 % (w/v) base d’azote de levure sans acides aminés, 20 mg/L L-histidine, 30 mg/L L-leucine,30 mg/L L-lysine et 20 mg/L uracil.
- Répartir 90 ml du support total YP également en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soit 45 ml chacun).
- Répartir 90 ml du milieu synthétique minimal YNB en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soit 45 ml chacun).
- Autoclavez les flacons avec les médias YP et YNB à 15 psi/121 oC pendant 45 minutes avant utilisation.
2. Souche de levure
- Utilisez la souche de type sauvage BY4742(MATmd his3 '1 leu2 '0 lys2 '0 ura3 '0).
3. Levure de culture dans le milieu complet de YP avec le glucose
- Autoclave une solution de stock de 20% (w/v) de glucose à 15 psi/121 oC pendant 45 minutes avant utilisation.
- Ajoutez 5 ml de la solution stérile de 20 % (w/v) de glucose à chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu stérile de YP pour une concentration finale de 2 % de glucose (w/v).
- Utilisez une boucle microbiologique pour inoculer les cellules de la souche de type sauvage BY4742 dans chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu YP avec du glucose.
- Culture les cellules pendant la nuit à 30 oC avec secousses de rotation à 200 tr/min.
- Prenez un aliquot de la culture de levure. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules de levure par ml de culture.
4. Transférer la levure et les cultiver dans le milieu synthétique minimal de la BNS avec du glucose
- Ajoutez 5 ml de la solution stérile de 20 % (w/v) de glucose à chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu stérile de YNB à une concentration finale de 2 % de glucose (w/v).
- Utilisez une pipette stérile pour transférer un volume de la culture de levure de nuit qui contient le nombre total de 5,0 x 107 cellules dans chacune des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu YNB avec du glucose.
- Culture les cellules pour au moins 24 h (ou plus, si l’expérience l’exige) à 30 oC avec secousses de rotation à 200 tr/min.
5. Préparation des réactifs, des laboratoires et de l’équipement pour l’extraction des lipides
- Préparer ce qui suit: 1) de haute qualité (-gt;99.9%) chloroforme; 2) de haute qualité (99,9%) méthanol; 3) 28 % (v/v) solution d’hydroxyde d’ammonium dans l’eau nano-pure; 4) perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 m); 5) un vortex avec adaptateur approprié; 6) 15 mL tubes à centrifugeuse en verre à grande vitesse avec bouchons doublés de polytetrafluoroethylène; 7) 17:1 et 2:1 mélanges de chloroforme et de méthanol; 8) un mélange chloroforme/méthanol (2:1) avec 0,1% d’hydroxyde d’ammonium (v/v); 9) solution ABC (155 mM d’ammonium bicarbonate, pH à 8,0); 10) un mélange de normes lipidiques internes préparées dans un mélange de chloroforme et de méthanol tel qu’indiqué dans le tableau 1; et 11) flacons d’échantillon de verre de 2 ml avec des bouchons doublés de polytetrafluoroethylène pour l’extraction des lipides cellulaires.
6. Préparation des réactifs, des laboratoires et de l’équipement pour LC
- Préparer ce qui suit : 1) acetonitrile/2-propanol/nano-pure water (65:35:5) mélange; 2) un vortex avec adaptateur approprié; 3) un sonicateur à ultrasons; 4) flacons de verre avec inserts pour une plaque de puits; 5) un système LC équipé d’une pompe binaire, d’un degasser et d’un autosampler; 6) une colonne en phase inverse C18 (2,1 mm; 75 mm; taille de pores 130 euros; gamme de pH de 1-11) couplée à un système de pré-colonne; 7) mélange A : acétonitrile/eau (60:40); et 8) mélange B: isopropanol/acetonitrile (90:10).
7. Extraction lipidique des cellules de levure
- Prenez un aliquot de la culture de levure. Utilisez un hémocytomètre ou mesurez600 OD pour déterminer le nombre total de cellules de levure par ml de culture.
- Prenez un volume de culture de levure qui contient un nombre total de 5.0 x 107 cellules (3.3 unités OD600). Placez ce volume de culture dans un tube de microcentrifuge préchilled de 1,5 mL.
- Récoltez les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
- Ajouter 1,5 ml d’eau nano-pure glacée et laver les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
- Ajouter 1,5 ml de solution ABC glacée et laver les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant. La pastille cellulaire peut être stockée à -80 oC avant l’extraction des lipides.
- Pour commencer l’extraction des lipides, décongeler la boulette de cellules sur la glace.
- Réutilisez la pastille cellulaire dans 200 l’eau nano-pure glacée. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse en verre de haute résistance de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ajouter ce qui suit à ce tube : 1) 25 l de mélange de normes lipidiques internes préparées dans le mélange chloroforme/méthanol (2:1) ; 2) 100 l de 425-600 perles de verre lavées à l’acide; et 3) 600 l de mélange chloroforme/méthanol (17:1).
- Vortex le tube à grande vitesse pendant 5 minutes à température ambiante (RT) pour perturber les cellules.
- Vortex le tube à basse vitesse pendant 1 h à RT pour faciliter l’extraction des lipides.
- Incuber l’échantillon pendant 15 min sur la glace afin de favoriser les précipitations protéiques et la séparation des phases aqueuses et organiques les unes des autres.
- Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3.000 x g pendant 5 min à RT. Cette étape de centrifugation permet de séparer la phase aqueuse supérieure de la phase organique inférieure, qui contient toutes les classes de lipides.
- Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (400 ll) à un autre tube de centrifugeuse en verre de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ne perturbez pas les perles de verre ou la phase aqueuse supérieure pendant un tel transfert. Maintenir la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté.
- Ajouter 300 L de mélange chloroforme-méthanol (2:1) à la phase aqueuse supérieure restante pour permettre l’extraction de sphingolipids et PA, PS, PI et CL. Vortex le tube vigoureusement pendant 5 min à RT.
- Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3.000 x g pendant 5 min à RT.
- Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (200 ll) formée après centrifugation à la phase organique recueillie à l’étape 7.13.
- Utilisez le flux de gaz azoté pour évaporer le solvant dans les phases organiques combinées. Fermez les tubes contenant le film lipidique sous l’écoulement du gaz azoté. Conservez ces tubes à -80 oC.
8. Séparation des lipides extraits par LC
- Ajouter 500 L d’acétyl/2-propanol/nano-pur water (65:35:5) mélange à un tube contenant le film lipidique obtenu à l’étape 7.16. Vortex le tube 3x pour 10 s à RT.
- Soumettez le contenu du tube à la sonication par ultrasons pendant 15 min. Vortex le tube 3x pour 10 s à RT.
- Prenez 100 L d’un échantillon du tube et ajoutez-le à une fiole de verre avec un insert utilisé pour une plaque de puits. Éliminez les bulles d’air dans l’insert avant de le arpenter dans le puits.
- Utilisez un système LC pour séparer différentes espèces lipidiques sur une colonne CSH en phase inverse C18 couplée à un système pré-colonne (voir Tableau des matériaux). Pendant la séparation, maintenez la colonne à 55 oC et à un débit de 0,3 ml/min. Conserver l’échantillon dans la plaque de puits à RT.
- Utilisez les phases mobiles qui se composent du mélange A (acetonitrile/eau [60:40 (v/v)]) et du mélange B (isopropanol/acetonitrile [90:10 (v/v)]). Pour un mode positif de détection des ions parentés créés à l’aide de la source d’ions d’ionisation électrospray (ESI), le mode ESI(MD), les phases mobiles A et B contiennent un format d’ammonium à la concentration finale de 10 mM. Pour un mode négatif de détection des ions parentaux, le mode ESI (-), les phases mobiles A et B contiennent de l’acétate d’ammonium à la concentration finale de 10 mM.
- Utilisez un volume d’échantillon de 10 L pour l’injection dans le mode ESI et ESI (-).
- Séparer différentes espèces lipidiques par LC à l’aide du gradient LC suivant : 0-1 min 10% (phase B); 1-4 min 60% (phase B); 4-10 min 68% (phase B); 10-21 97% (phase B); 21-24 min 97% (phase B); 24-33 min 10% (phase B).
- Exécuter les blancs d’extraction comme premier échantillon, entre tous les quatre échantillons, et comme dernier échantillon. Soustrayez l’arrière-plan pour normaliser les données.
- Un chromatogramme total représentatif d’ions provenant de données LC/MS sur les lipides extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742 est indiqué dans la figure 1.
9. Analyse spectrométrique de masse des lipides séparés par LC
- Utilisez un spectromètre de masse équipé d’une source d’ion ionaire HESI (électrospray) pour analyser les lipides qui ont été séparés par LC. Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 2.
- Utilisez l’analyseur de transformation Fourier pour détecter les ions parent (MS1) à une résolution de 60 000 et dans la plage de masse de 150-2 000 Da.
- Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 3 pour détecter les ions secondaires (MS2).
10. Identification et quantitation de différentes classes et espèces de lipides par le traitement des données brutes de LC-MS/MS
- Consultez le Tableau des matériaux pour les logiciels pour effectuer l’identification et la quantitation de différents lipides à partir de fichiers bruts LC-MS/MS. Ce logiciel utilise la plus grande base de données lipidique, contenant plus de 1,5 million de précurseurs d’ions lipidiques (MS1) et leurs ions fragmentés prévus (MS2). Le logiciel utilise également des pics MS1 pour la quantitation des lipides et MS2 pour l’identification des lipides. Un chromatogramme représentatif de deux formes de phosphatidylserine isomerique (34:0) qui ont la même valeur m/z, mais des temps de rétention différents, ainsi que leurs spectres MS1 et MS2, sont indiqués dans la figure 2, figure 3, et la figure 4, respectivement.
- Rechercher gratuitement des acides gras LC-MS contenant des données MS1 et des données MS2 dépendantes des données (non stéérisées), cardiolipin (CL), phytoceramide (PHC), phytosphingosine (PHS), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), et triacylglycerol (TAG) classes lipidiques en utilisant une tolérance m/z de 5 ppm pour les ions précurseurs et 10 ppm pour les ions de produit. D’autres paramètres de recherche sont indiqués dans le tableau 4. Suivez les instructions fournies dans le manuel d’utilisation du logiciel. Les identités des normes lipidiques internes et des espèces lipidiques avec la composition inhabituelle d’acide gras doivent être vérifiées manuellement.
- Pour identifier et quantifier différentes classes et espèces de lipides à l’aide d’alternatives open-source librement disponibles pour le logiciel lipidique de recherche, utilisez l’analyseur de données lipidiques (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), MZmine 2 (http://mzmine.github.io/), ou XCMS (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)logiciel pour traiter les données brutes de LC-MS/MS.
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Representative Results
Notre méthode pour une évaluation quantitative des lipides cellulaires principaux dans une cellule de levure avec l’aide de LC-MS/MS était polyvalente et robuste. Il nous a permis d’identifier et de quantifier 10 différentes classes de lipides dans les cellules de la Cérévisiae de S. cultivées dans le milieu minimal synthétique de YNB contenant initialement 2% de glucose. Ces classes de lipides comprennent les acides gras gratuits (non stérilisés) (FFA), CL, phytoceramide (PHC), phytosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI, PS, et TAG (Tableau supplémentaire 1). De nombreuses espèces moléculaires de chacune de ces classes ont été identifiées et quantifiées à l’aide de cette méthode LC-MS/MS(tableau supplémentaire 1).
Notre méthode LC-MS/MS était également sensible. En effet, il a permis l’identification et la quantitation d’espèces moléculaires de lipides à des concentrations aussi basses que 0,165 pmol/L (voir les données sur le phytoceramide dans le tableau 5). Cette limite de quantitation diffère pour différentes classes de lipides au sein d’un large éventail de concentrations(tableau 5).
Fait important, notre méthode a permis l’identification et la quantification de différentes formes isobariques ou isomériques de lipides. Les formes isobariques de lipides sont des espèces lipidiques avec la même masse nominale (c.-à-d., la somme des masses des isotopes les plus abondants) mais les masses exactes différentes31. Les formes isomériques de lipides sont des espèces lipidiques avec la même formule moléculaire, mais avec une structure chimique différente31. Par exemple, l’utilisation de notre méthode LC-MS/MS qui distingue les CSP (16:0-26:0) et les espèces de lipides isobariques PC (16:0-10:0): bien qu’ils aient la même valeur de masse nominale de 650, leurs masses exactes sont 650.6457 et 650.475, respectivement. De plus, cette méthode LC-MS/MS a fait la distinction entre deux paires d’espèces de lipides isomériques ayant la même formule moléculaire mais une structure chimique différente : 1) PC (18:0-18:1) et PC (20:0-16:1), avec formule moléculaire (C44H87N1O8P1) et masse exacte (788.6163); et 2) PE (16:0-16:0) et PE (14:0-18:0), avec la formule moléculaire (C37H75N1O8P1) et la masse exacte (692.5224).
Notre méthode LC-MS/MS peut être utilisée pour augmenter l’efficacité de l’ionisation des lipides de toutes les classes, améliorant ainsi l’identification et la quantitation des lipides cellulaires majeurs. Une telle amélioration peut être réalisée en utilisant d’autres additifs de phase mobile pour l’ESI MS(tableau 6). Ces phases alternatives incluent le format d’ammonium, le format d’ammonium avec l’acide formic, l’acétate d’ammonium, l’acétate d’ammonium avec l’acide acétique, et l’acétate d’ammonium avec l’acide formique. Chacun de ces additifs de phase mobile alternatifs peut être utilisé pour les colonnes LC en phase normale et en phase inverse(tableau 6).
Un autre avantage de notre méthode LC-MS/MS consiste à utiliser deux méthodes différentes pour la fragmentation des ions précurseurs (MS1) des lipides dans les produits MS2. Ces deux méthodes sont la dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) et la dissociation induite par les collisions (CID)32. Nous avons constaté que la méthode CID est bénéfique si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile d’acétate d’ammonium pour le mode ESI (-) de LAM, car dans ces conditions, elle permet une augmentation de l’efficacité de la fragmentation de l’ion lipidique MS1 en produits MS2 pour les produits PHC, CL, FFA, PE, PG, PI et PS(tableau 7). En revanche, la méthode HCD est favorable si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile formate d’ammonium pour le mode ESI (MD) de LAS, car dans ces conditions, elle permet une augmentation de l’efficacité de la fragmentation de l’ion lipidique MS1 en produits MS2 pour PC, PHS et TAG(tableau 8).
Figure 1 : L’ion chromatogramme total (TIC) provenant des données de chromatographie/spectrométrie de masse liquide (LC/MS) des lipides extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742. Le TIC des lipides séparés par LC sur une colonne en phase inverse CSH C18 et détecté par la SP des ions parent qui ont été créés en utilisant le mode d’ionisation électrospray négatif. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Un chromatogramme de deux formes de phosphatidylserine isomérique (34:0) qui ont la même valeur m/z (M-H) de 762,5294 mais des temps de rétention différents de 7,65 min et 8,49 min. Les lipides ont été extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742 et séparés par la chromatographie liquide sur une colonne en phase inverse CSH C18. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Spectre MS1 de deux espèces de phosphatidylserine isomérique (34:0) qui ont la même valeur m/z (M-H) de 762.5294 mais des temps de rétention différents de 7,65 min et 8,49 min. Les lipides ont été extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742, séparés par la chromatographie liquide sur une colonne en phase inverse CSH C18 (comme indiqué dans la figure 2) et détecté par spectrométrie de masse des ions parent (MS1) qui ont été créés en utilisant le mode d’ionisation électrospray négatif. (A) Le spectre MS1 d’une forme de phosphatidylserine (34:0) avec la valeur m/z (M-H) de 762.5294 et le temps de rétention de 7,65 min. (B) Le spectre MS1 d’une forme de phosphatidylserine (34:0) avec la valeur m/z (M-H) de 762.5294 et le temps de rétention de 8.49 min. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Spectre MS2 de deux espèces de phosphatidylserine isomérique (34:0) qui ont la même valeur m/z (M-H) de 762.5294 mais des temps de rétention différents de 7,65 min et 8,49 min. Les lipides ont été extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742, séparés par chromatographie liquide sur une colonne en phase inverse CSH C18 (comme indiqué dans la figure 2) et détectés par spectrométrie de masse des ions MS1 (comme indiqué dans la figure 3). Des ions secondaires (MS2) ont ensuite été détectés par spectrométrie de masse. (A) Le spectre MS2 d’une forme de phosphatidylserine (34:0) avec la valeur m/z (M-H) de 762.5294 et le temps de rétention de 7,65 min. La perte d’une serine moiety a produit un ion avec la valeur m/z (M-H) de 675.6149. (B) Le spectre MS2 d’une forme de phosphatidylserine (34:0) avec la valeur m/z (M-H) de 762.5294 et le temps de rétention de 8.49 min. La perte d’une serine moiety a produit un ion avec la valeur m/z (M-H) de 675.8843. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Mode de détection | Classe de lipides | Composition de queue hydrophobe | Valeur calculée m/z | Concentration (pmoles/l) |
| Négatif | Céramide | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Négatif | Cardiolipine | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Négatif | Acide gras gratuit | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Négatif | Phosphatidylethanolamine | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Négatif | Phosphatidylglycerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Négatif | Phosphatidylinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Négatif | Phosphatidylserine | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positif | Phosphatidylcholine | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positif | Phytosphingosine | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positif | Triacylglycérol | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tableau 1 : La composition d’un mélange de normes lipidiques internes. Des normes internes en lipides ont été préparées dans le mélange de chloroforme/méthanol (2:1). Le mode de détection désigne un mode positif ou négatif de détection des ions parent à l’aide d’un spectromètre de masse Orbitrap Velos équipé d’une source d’ionisation électrospray (ESI). Les valeurs calculées m/z sont pour les adducteurs de lipides.
| Résolution FTMS et p | 60000 |
| Gamme de masse (dalton) | 150-2000 |
| Type source d’Ion | HESI (HESI) |
| Température capillaire (C) | 300 |
| Température du chauffe-eau (C) | 300 |
| Flux de gaz gainé | 10 |
| Au flux de gaz | 5 |
| Tension de polarité positive (kV) | 3 |
| Tension de polarité négative (kV) | 3 |
| Courant de source (A) | 100 |
Tableau 2 : Les réglages du spectromètre de masse Orbitrap Velos utilisés pour analyser les lipides séparés par LC. Abréviations : SPECTROmétrie de masse à base de transformation ftMS et Fourier en mode ESI ; HESI - ionisation électrospray chauffée.
| Polarité d’instrument | Positif | Négatif |
| Type d’activation | Dissociation induite par la haute énergie | Dissociation induite par la collision |
| Signal minimal requis | 5000 | 5000 |
| Largeur d’isolement | 2 | 2 |
| Énergie de collision normalisée | 55 | 35 |
| État de charge par défaut | 2 | 2 |
| Temps d’activation | 0.1 | 10 |
| Résolution FTMS et C | 7500 | |
| 5 pics les plus intenses ont été sélectionnés pour ms/ms |
Tableau 3 : Les paramètres du spectromètre de masse Orbitrap Velos utilisés pour détecter les ions secondaires (MS2). Abréviation : SPECTROmétrie de masse à base de transformation FTMS et Fourier en mode ESI.
| Identification | |
| Base | Orbitrap (En) |
| Détection maximale | Isotope de rappel (ON) |
| Option de recherche | Recherche de produits Orbitrap |
| Type de recherche | Produit |
| Type d’expérience | LC-MS |
| Tolérance précurseur | 22h00 |
| Tolérance du produit | Mode de dissociation induite par l’énergie élevée [ESI) : 20 ppm |
| Collision induite-dissociation [ESI (-) mode]: 0.5 Daltons | |
| Quantification | |
| Exécuter la quantitation | Sur |
| tolérance m/z | -5.0; 5,0 euros |
| Type de tolérance | Ppm |
| Filtre | |
| Filtre de rang supérieur | Sur |
| Filtre de nœud principal | Pic isomer principal |
| seuil m-score | 5 |
| seuil de c-score | 2 |
| Priorité de la FFA | Sur |
| Filtre de qualité ID | R : La classe lipidique et tous les acides gras sont complètement identifiés |
| B : Classe lipidique et quelques acides gras sont identifiés | |
| C : La classe lipidique ou fa sont identifiées | |
| D: Lipide identifié par d’autres ions fragment (H2O, etc.) | |
| Classe lipidique | |
| Mode de dissociation induite par l’énergie élevée [ESI) mode | PC, TAG |
| Collision induite-dissociation [ESI (-) mode | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Ions | |
| Mode de dissociation induite par l’énergie élevée [ESI) mode | H; NH4; Na |
| Collision induite-dissociation [ESI (-) mode | - H; - 2H; - HCOO |
Tableau 4 : Les paramètres de recherche utilisés pour identifier différentes classes et espèces lipidiques à l’aide du logiciel d’identification lipidique « Recherche de lipides » (V 4.1). Abréviations: CER et céramide; CL et cardiolipine; FFA - acide gras gratuit (non stérilisé); PC et phosphatidylcholine; PE - phosphatidylethanolamine; PG et phosphatidylglycerol; PI et phosphatidylinositol; PS - phosphatidylserine; TAG - triacylglycerol.
Tableau 5 : Les concentrations les plus faibles d’espèces moléculaires de différentes classes lipidiques qui peuvent être identifiées et quantitées à l’aide de notre méthode LC-MS/MS. Une estimation de la concentration quantifiable la plus faible pour chaque classe lipidique est basée sur les zones de pointe de la SP pour sa norme interne (ces zones de pointe de LA SP et les concentrations de normes lipidiques sont affichées en gras) et sa forme moléculaire représentative présente à la concentration détectable la plus faible. Les données sont présentées comme des valeurs moyennes de deux expériences indépendantes, pour chacune d’entre elles, dont trois répliques techniques ont été effectuées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).
| Norme lipidique | Mode ESI | Amf | AmF/FA | AmAc (En) | AmAc/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| étiquette | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tableau 6 : Les effets des additifs alternatifs de phase mobile pour la SEP ESI sur l’efficacité de l’ionisation des lipides de différentes classes. Différents lipides ont été séparés les uns des autres par la chromatographie liquide de phase inverse. Les normes commerciales en lipides qui appartiennent à différentes classes de lipides sont nommées dans le tableau 1. Le mode ESI (-) ou ESI (MD) d’ionisation a été utilisé pour la SP en présence de différents additifs de phase mobile. Le pourcentage d’ionisation pour chaque norme lipidique est indiqué comme une valeur moyenne de trois répliques techniques. Pour chaque lipide, le pourcentage d’ionisation a été calculé en fonction de la zone de pointe de la SP. Une valeur de l’efficacité d’ionisation la plus élevée pour chaque lipide est affichée en gras. Abréviations: Formate AmF et ammonium; Format AmF/FA et ammonium à l’acide formique; AmAc et acétate d’ammonium; AmAc/AA et acétate d’ammonium à l’acide acétique; AmAc/FA et acétate d’ammonium à l’acide formique; CL et cardiolipine; FFA - acide gras gratuit (non stérilisé); PC et phosphatidylcholine; PE - phosphatidylethanolamine; PG et phosphatidylglycerol; PHC et phytoceramide; PHS et phytosphingosine; PI et phosphatidylinositol; PS - phosphatidylserine; TAG - triacylglycerol.
| Norme lipidique | Mode ESI | Amf | AmAc (En) |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| étiquette | + | 65.7 | 69.7 |
Tableau 7 : Effet de la méthode de dissociation induite par la collision (CID) sur l’efficacité de la fragmentation des ions précurseurs (MS1). Les normes commerciales en lipides qui appartiennent à différentes classes de lipides sont nommées dans le tableau 1. Le mode ESI (-) ou ESI (MD) d’ionisation a été utilisé pour la SP, en présence d’un additif de phase mobile de format d’ammonium (AmF) ou d’ammonium (AmAc). Le pourcentage d’ions lipidiques MS1 qui ont été fragmentés en produits MS2 est indiqué comme une valeur moyenne de trois répliques techniques. Pour chaque lipide, le pourcentage d’ionisation a été calculé en fonction de la zone de pointe MS2. Une valeur du pourcentage le plus élevé d’ions lipides MS1 fragmentés est affichée en gras pour chaque lipide (comparez avec les données présentées dans le tableau 8). Cette valeur est la plus élevée si l’efficacité de la formation d’ions de produit MS2 est la plus élevée. Abréviations: CL et cardiolipin; FFA - acide gras gratuit (non stérilisé); PC et phosphatidylcholine; PE - phosphatidylethanolamine; PG et phosphatidylglycerol; PHC et phytoceramide; PHS et phytosphingosine; PI et phosphatidylinositol; PS - phosphatidylserine; TAG - triacylglycerol.
| Norme lipidique | Mode ESI | Amf | AmAc (En) |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| étiquette | + | 91.4 | 84.9 |
Tableau 8 : Effet de la méthode de dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) sur l’efficacité de la fragmentation des ions précurseurs (MS1). Les normes commerciales en lipides qui appartiennent à différentes classes de lipides sont nommées dans le tableau 1. Le mode ESI (-) ou ESI (MD) d’ionisation a été utilisé pour la SP, en présence d’un additif de phase mobile de format d’ammonium (AmF) ou d’ammonium (AmAc). Le pourcentage d’ions lipidiques MS1 qui ont été fragmentés en produits MS2 est indiqué comme une valeur moyenne de trois répliques techniques. Pour chaque lipide, le pourcentage d’ionisation a été calculé en fonction de la zone de pointe MS2. Une valeur du pourcentage le plus élevé d’ions lipides MS1 fragmentés est affichée en gras pour chaque lipide (comparez avec les données présentées dans le tableau 7). Cette valeur est la plus élevée si l’efficacité de la formation d’ions de produit MS2 est la plus élevée. Autres abréviations : CL et cardiolipine ; FFA - acide gras gratuit (non stérilisé); PC et phosphatidylcholine; PE - phosphatidylethanolamine; PG et phosphatidylglycerol; PHC et phytoceramide; PHS et phytosphingosine; PI et phosphatidylinositol; PS - phosphatidylserine; TAG - triacylglycerol.
Tableau supplémentaire 1 : Liste des espèces moléculaires de 10 classes lipidiques différentes identifiées et quantifiées dans les cellules de la Cérévisiae S. à l’aide de notre méthode LC-MS/MS. Ces classes de lipides comprenaient des acides gras gratuits (non stérilisés) (FFA), de cardiolipine (CL), de phytoceramide (PHC), de phytosphingosine (PHS), de phosphatidylcholine (PC), de phosphati phosphatidyolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), et triacylglycerol (TAG). Les cellules de S. cerevisiae ont été cultivées dans le milieu minimal synthétique de YNB contenant au commencement 2% de glucose. Des aliquots des cellules de levure pour l’extraction de lipides et l’analyse de LC-MS/MS des lipides extraits ont été récupérés les jours 1, 2, 3, 4, 6, 8, et 10 de la culture. Toutes les espèces lipidiques de chaque classe lipidique qui ont été identifiées dans les cellules de levure récupérées à différents jours de culturing sont montrées. Certaines de ces espèces lipidiques n’étaient présentes que dans les cellules de levure chronologiquement jeunes récupérées les jours 1-4 de la culture, d’autres seulement dans les cellules de levure chronologiquement vieilles récupérées les jours 6-10 de la culture, alors que certains étaient présents dans les cellules chronologiquement jeunes et anciennes de levure. La zone de pointe de MS la plus élevée pour chaque espèce lipidique de chaque classe de lipides identifiée un certain jour de culturation est montrée. Les normes lipidiques de différentes classes lipidiques qui ont été utilisées pour la quantitation d’autres espèces dans cette classe de lipides sont affichées en couleur rouge. Les valeurs calculées m/z sont pour les adducteurs de lipides. Abréviation: ESI (-) - le mode ESI (-) de la SP; ESI (EN) - le mode ESI (MD) de MS. Les données sont présentées comme des valeurs moyennes de deux expériences indépendantes, pour chacune d’entre elles, trois répliques techniques ont été effectuées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).
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Discussion
Les précautions suivantes sont importantes pour la mise en œuvre réussie du protocole décrit ici :
1. Le chloroforme et le méthanol sont toxiques. Ils extraient efficacement diverses substances des surfaces, y compris la plasticware de laboratoire et votre peau. Par conséquent, manipuler ces solvants organiques avec prudence en évitant l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent le contact avec le chloroforme et / ou le méthanol, en utilisant des pipettes en verre borosilicate pour ces étapes, et le rinçage de ces pipettes avec du chloroforme et du méthanol avant utilisation.
2. Pendant l’extraction lipidique par mélange méthanol/chloroforme (17:1), utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (400 l) à une trompe de centrifugeuse en verre haute résistance de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ne perturbez pas les perles de verre ou la phase aqueuse supérieure pendant un tel transfert. Maintenir la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté.
3. Pendant la préparation de l’échantillon pour LC-MS/MS, il est important d’éliminer toutes les bulles d’air dans les flacons de verre avant d’insérer les flacons dans une plaque de puits.
4. Pour parvenir à une solubilisation complète du format d’ammonium et de l’acétate d’ammonium dans les phases mobiles A et B avant la séparation des lipides par LC, dissoudre chaque sel dans 500 l d’eau nano-pure avant de mélanger la solution avec la phase mobile et sonifier pendant 20 min.
5. Ne stockez pas le film lipidique formé après l’évaporation de solvant pendant une longue période de temps avant la course. Nous stockons ce film à -80 oC pendant au plus une semaine avant de le dissoudre dans le mélange d’acétyonitrile/2-propanol/nano-pur (65:35:5) puis de soumettre les lipides à LC-MS/MS.
La méthode LC-MS/MS décrite ici est une technique polyvalente, robuste et sensible pour une évaluation quantitative de nombreuses espèces lipidiques comprenant le lipidome cellulaire de levure ou tout autre organisme eucaryote. La méthode permet l’identification et la quantification de différentes espèces de lipides isobariques ou isomériques, permet d’utiliser d’autres additifs de phase mobile pour la SEP ESI pour promouvoir l’ionisation des lipides et rendre l’identification et la quantification des lipides plus efficaces, et peuvent utiliser des méthodes de HCD et de CID pour la fragmentation ou l’activation des ions lipidiques MS1.
Nous utilisons cette méthode LC-MS/MS pour étudier les changements liés à l’âge dans les lipidomes cellulaires et organellar pendant le vieillissement chronologique de la levure en herbe S. cerevisiae. Nous utilisons également cette méthode pour étudier combien d’interventions génétiques, diététiques et pharmacologiques vieillissantes influencent la composition lipidique de toute la cellule de S. cerevisiae et de ses divers organites. En raison de sa polyvalence, de sa robustesse et de sa sensibilité, cette méthode LC-MS/MS peut être utilisée avec succès pour l’évaluation quantitative des lipidomes cellulaires et organellars dans les organismes eucaryotes à travers la phyla.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous remercions le Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry et le Centre for Structural and Functional Genomics (tous deux de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été appuyée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (NSERC) du Canada (RGPIN 2014-04482) et du Fonds de la chaire de l’Université Concordia (CC0113). K.M. a reçu l’appui du Prix du mérite de l’Université Concordia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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