Summary
We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.
Abstract
Lipiden zijn structureel diverse amphipathic moleculen die onoplosbaar zijn in water. Lipiden zijn essentiële bijdragen aan de organisatie en functie van biologische membranen, energieopslag en -productie, cellulaire signalering, vesiculaire transport van eiwitten, organelle biogenese, en gereguleerde celdood. Omdat de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is een eencellige eukaryote vatbaar voor grondige moleculaire analyses, het gebruik ervan als een model organisme geholpen onthullen mechanismen koppelen lipide metabolisme en intracellulair vervoer aan complexe biologische processen binnen eukaryotische cellen. De beschikbaarheid van een veelzijdige analytische methode voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van belangrijke klassen lipiden in een gistcel is cruciaal voor het verkrijgen van diepgaande inzichten in deze mechanismen. Hier presenteren we een protocol om vloeibare chromatografie te gebruiken in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor de kwantitatieve analyse van belangrijke cellulaire lipiden van S. cerevisiae. De beschreven LC-MS/MS methode is veelzijdig en robuust. Het maakt de identificatie en kwantificering van talrijke soorten (waaronder verschillende isobarische of isomische vormen) binnen elk van de 10 lipideklassen mogelijk. Deze methode is gevoelig en maakt identificatie en kwantificering van sommige lipidesoorten mogelijk bij concentraties tot 0,2 pmol/μL. De methode is met succes toegepast op de beoordeling van lipidomen van hele gistcellen en hun gezuiverde organellen. Het gebruik van alternatieve mobiele faseadditieven voor elektrosprayionisatiemassaspectrometrie in deze methode kan de efficiëntie van ionisatie voor sommige lipidesoorten verhogen en kan daarom worden gebruikt om hun identificatie en kwantificering te verbeteren.
Introduction
Een lichaam van bewijs geeft aan dat lipiden, een van de belangrijkste klassen van biomoleculen, een essentiële rol spelen in vele vitale processen binnen een eukaryotische cel. Deze processen omvatten de assemblage van lipide tweelagen die het plasmamembraan en de membranen rond cellulaire organellen vormen, het vervoer van kleine moleculen over celmembranen, reactie op veranderingen in de extracellulaire omgeving en intracellulaire signaaltransductie, opwekking en opslag van energie, import en export van eiwitten die beperkt zijn tot verschillende organellen, vesiculaire handel in eiwitten binnen het endomembraansysteem en eiwitafscheiding, en verschillende vormen van gereguleerde celdood1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
De ontluikende gist S. cerevisiae, een eencellig eukaryotisch organisme, is met succes gebruikt om een aantal van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de essentiële rollen van lipiden in deze vitale cellulaire processen4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae is een waardevol modelorganisme voor het blootleggen van deze mechanismen omdat het vatbaar is voor uitgebreide biochemische, genetische, celbiologische, chemische biologische, systeembiologische en microfluïdedsectieanalyses21,22,23,24,25. Verdere vooruitgang in het begrijpen van mechanismen waardoor lipidemetabolisme en intracellulair transport bijdragen aan deze vitale cellulaire processen vereist gevoelige massaspectrometrietechnologieën voor de kwantitatieve karakterisering van het cellulaire lipidoom, het begrijpen van de lipidoom moleculaire complexiteit, en het integreren van kwantitatieve lipideomics in een multidisciplinair platform van systeembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.
De huidige methoden voor de massaspectrometrie-ondersteunde kwantitatieve lipidomica van gistcellen en cellen van andere eukaryotische organismen zijn niet voldoende veelzijdig, robuust of gevoelig. Bovendien zijn deze momenteel gebruikte methoden niet in staat om verschillende isobarische of isomeric lipidesoorten van elkaar te onderscheiden. Hier beschrijven we een veelzijdige, robuuste en gevoelige methode die het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) mogelijk maakt voor kwantitatieve analyse van belangrijke cellulaire lipiden van S. cerevisiae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van steriele media voor het kweken van gist
- Bereid 90 mL van een compleet YP medium dat 1% (w/v) gistextract en 2% (w/v) bactopeptone bevat.
- Bereid 90 mL van een synthetisch minimaal YNB medium met 0,67% (w/v) gist stikstof basis zonder aminozuren, 20 mg/L L-histidine, 30 mg/L L-leucine, 30 mg/L L-lysine, en 20 mg/L uracil.
- Verdeel 90 mL van het volledige YP-medium eveneens in twee Erlenmeyer-kolven van 250 mL (d.w.z. 45 mL per stuk).
- Verdeel 90 mL van het synthetische minimale YNB-medium in twee Erlenmeyer-kolven van 250 mL (d.w.z. 45 mL per stuk).
- Autoclave de kolven met YP en YNB media op 15 psi/121 °C voor 45 min voor gebruik.
2. Giststam
- Gebruik de wilde soort stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Het kweken van gist in het volledige YP medium met glucose
- Autoclave een 20% (w/v) voorraadoplossing glucose bij 15 psi/121 °C gedurende 45 min voor gebruik.
- Voeg 5 mL van de steriele 20% (w/v) glucoseoplossing toe aan elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het steriele YP-medium bevatten voor een eindconcentratie van 2% glucose (w/v).
- Gebruik een microbiologische lus om cellen van het wilde type by4742 te inenten in elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het YP-medium met glucose bevatten.
- Kweek de cellen 's nachts bij 30 °C met rotatieschudden bij 200 tpm.
- Neem een aliquot van gist cultuur. Gebruik een hemocytometer om het totale aantal gistcellen per mL cultuur te bepalen.
4. Overdracht van gist naar en kweken ze in de synthetische minimale YNB medium met glucose
- Voeg 5 mL van de steriele 20% (w/v) glucoseoplossing toe aan elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het steriele YNB-medium bevatten tot een eindconcentratie van 2% glucose (w/v).
- Gebruik een steriele pipet om een volume van de 's nachts gistcultuur die het totale aantal van 5,0 x 107 cellen bevat, over te brengen in elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het YNB-medium met glucose bevatten.
- Kweek de cellen gedurende ten minste 24 uur (of meer, als het experiment vereist) bij 30 °C met rotatieschudden bij 200 tpm.
5. Voorbereiding van reagentia, labware en apparatuur voor lipideextractie
- Bereid het volgende voor: 1) hoge kwaliteit (>99,9%) chloroform; 2) hoge kwaliteit (>99,9%) methanol; 3) 28% (v/v) ammoniumhydroxideoplossing in nanozuiver water; 4) glazen kralen (zuurgewassen, 425-600 μM); 5) een vortex met geschikte adapter; 6) 15 mL high-speed glazen centrifugebuizen met polytetrafluorethyleen gevoerde doppen; 7) 17:1 en 2:1 mengsels van chloroform en methanol; 8) een chloorform/methanol (2:1) mengsel met 0,1% ammoniumhydroxide (v/v); 9) ABC-oplossing (ammoniumbicarbonaat van 155 mM, pH = 8,0); 10) een mengsel van interne lipidenormen bereid in een mengsel van chloorvorm en methanol van 2:1 , zoals aangegeven in tabel 1; en 11) 2 mL glas monster flesjes met polytetrafluorethyleen gevoerde doppen voor de extractie van cellulaire lipiden.
6. Voorbereiding van reagentia, labware en apparatuur voor LC
- Bereid het volgende: 1) acetonitril/2-propanol/nano-zuiver water (65:35:5) mengsel; 2) een vortex met geschikte adapter; 3) een ultrasone sonicator; 4) glazen flesjes met inzetstukken voor een wellplate; 5) een LC-systeem dat is uitgerust met een binaire pomp, ontgasser en een autosampler; 6) een c18 achteruitfasekolom (2,1 mm; 75 mm; poriemaat 130 Å; pH-bereik van 1-11) gekoppeld aan een prekolomsysteem; 7) mengsel A: acetonitril/water (60:40); en 8) mengsel B: isopropanol/acetonitril (90:10).
7. Lipideextractie uit gistcellen
- Neem een aliquot van gist cultuur. Gebruik een hemocytometer of meet OD600 om het totale aantal gistcellen per mL cultuur te bepalen.
- Neem een volume van gist cultuur die een totaal aantal van 5,0 x 107 cellen (3,3 eenheden OD600) bevat. Plaats dit volume van cultuur in een vooraf gekoelde 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Oogst de cellen door centrifugeren op 16.000 x g voor 1 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
- Voeg 1,5 mL ijskoud nanozuiver water toe en was de cellen door centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 1 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
- Voeg 1,5 mL ijskoude ABC-oplossing toe en was de cellen door centrifugeren bij 16.000 x g voor 1 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg. De celpellet kan worden opgeslagen bij -80 °C voorafgaand aan de lipideextractie.
- Om te beginnen met de lipide extractie, ontdooien de cel pellet op ijs.
- Resuspend de celpellet in 200 μL ijskoud nanozuiver water. Breng de celvering over op een hoge sterkte glazen schroeftopcentrifugebuis met een met polytetrafluorethyleen gevoerde dop. Voeg aan deze buis het volgende toe: 1) 25 μL van het mengsel van interne lipidenormen bereid in chloorvorm/methanolmengsel (2:1); 2) 100 μL van 425-600 μM zuurgewassen glazen kralen; en 3) 600 μL chloorform/methanol (17:1) mengsel.
- Vortex de buis op hoge snelheid voor 5 min bij kamertemperatuur (RT) om de cellen te verstoren.
- Vortex de buis op lage snelheid voor 1 uur op RT om de extractie van lipiden te vergemakkelijken.
- Incubeer het monster gedurende 15 min op ijs om eiwitneerslag en de scheiding van de waterige en organische fasen van elkaar te bevorderen.
- Centrifugeer de buis in een klinische centrifuge met 3.000 x g gedurende 5 min bij RT. Deze centrifugatiestap maakt het mogelijk om de bovenste waterige fase te scheiden van de onderste organische fase, die alle lipideklassen bevat.
- Gebruik een borosilicaat glaspipet om de lagere organische fase (~ 400 μL) over te brengen naar een andere 15 mL hoge sterkte glazen schroef top centrifuge buis met een polytetrafluorethyleen gevoerde dop. Verstoor de glazen kralen of de bovenste waterige fase tijdens een dergelijke overdracht niet. Houd de lagere organische fase onder de stroom van stikstofgas.
- Voeg 300 μL chloorform-methanol (2:1) mengsel toe aan de resterende bovenste waterige fase om de extractie van sfingolipiden en PA, PS, PI en CL. Vortex de buis krachtig gedurende 5 minuten bij RT mogelijk te maken.
- Centrifugeer de buis in een klinische centrifuge met 3.000 x g gedurende 5 min bij RT.
- Gebruik een borosilicaat glaspipet om de lagere organische fase (~ 200 μL) gevormd na centrifugering over te brengen naar de organische fase verzameld bij stap 7.13.
- Gebruik de stroom van stikstofgas om het oplosmiddel te verdampen in de gecombineerde organische fasen. Sluit de buizen met de lipidefilm onder de stroom van stikstofgas. Bewaar deze buizen op -80 °C.
8. Scheiding van geëxtraheerde lipiden door LC
- Voeg 500 μL acetonitril/2-propanol/nano-zuiver water (65:35:5) mengsel toe aan een buis met de lipidefilm verkregen bij stap 7.16. Vortex de buis 3x voor 10 s bij RT.
- Onderwerp de inhoud van de buis aan ultrasone sonicatie voor 15 min. Vortex de buis 3x voor 10 s bij RT.
- Neem 100 μL van een monster uit de buis en voeg het toe aan een glazen flacon met een wisselplaat die wordt gebruikt voor een wellplate. Elimineer luchtbellen in de wisselplaat voordat u deze in de putplaat pacing.
- Gebruik een LC-systeem om verschillende lipidesoorten te scheiden op een omgekeerde c18-kolom CSH gekoppeld aan een prekolomsysteem (zie Tabel met materialen). Houd tijdens de scheiding de kolom op 55 °C en bij een stroomsnelheid van 0,3 mL/min. Bewaar het monster in de wellplate bij RT.
- Gebruik de mobiele fasen die bestaan uit mengsel A (acetonitril/water [60:40 (v/v)]) en mengsel B (isopropanol/acetonitril [90:10 (v/v)]). Voor een positieve wijze van detectie van ouderionen die zijn gemaakt met behulp van de elektrosprayionisatie (ESI) ionenbron, de ESI (+) modus, bevatten de mobiele fasen A en B ammoniumformate bij de uiteindelijke concentratie van 10 mM. Voor een negatieve wijze van ouderionendetectie bevatten de ESI (-) modus, de mobiele fasen A en B ammoniumacetaat bij de eindconcentratie van 10 mM.
- Gebruik een monstervolume van 10 μL voor de injectie in zowel de ESI-modus (+) als de ESI (-) modus.
- Scheid verschillende lipidesoorten per LC met behulp van de volgende LC-gradiënt: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 10-21 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
- Voer extractie-spaties uit als het eerste monster, tussen elke vier monsters en als laatste monster. Trek de achtergrond af om gegevens te normaliseren.
- Een representatief totaal ionenchromatogram uit LC/MS-gegevens van lipiden die zijn gewonnen uit cellen van de wilde soortstam BY4742, is weergegeven in figuur 1.
9. Massaspectrometrische analyse van lipiden gescheiden door LC
- Gebruik een massaspectrometer uitgerust met een HESI (verwarmde elektrospray ionisatie) ionenbron om lipiden te analyseren die door LC werden gescheiden. Gebruik de instellingen in tabel 2.
- Gebruik de Fourier transform analyzer om ouderionen (MS1) te detecteren met een resolutie van 60.000 en binnen het massabereik van 150-2.000 Da.
- Gebruik de instellingen in tabel 3 om secundaire ionen (MS2) te detecteren.
10. Identificatie en kwantificering van verschillende lipideklassen en soorten door verwerking van ruwe gegevens van LC-MS/MS
- Zie de Tabel met materialen voor software voor het identificeren en kwantificeren van verschillende lipiden uit ruwe LC-MS/MS-bestanden. Deze software maakt gebruik van de grootste lipide database, met meer dan 1,5 miljoen lipide ionprecursoren (MS1) en hun voorspelde fragmentionen (MS2). De software maakt ook gebruik van MS1 pieken voor lipide quantitatie en MS2 voor lipide identificatie. Een representatief chromatogram van twee isomeric fosfatische vormen (34:0) die dezelfde m/z-waarde hebben, maar verschillende retentietijden, evenals hun MS1- en MS2-spectra, zijn weergegeven in respectievelijk figuur 2, figuur 3en figuur 4.
- Zoek LC-MS raw-bestanden met full-scan MS1-gegevens en gegevensafhankelijke MS2-gegevens voor gratis (ongesteriliseerde) vetzuren (FFA), cardiolipine (CL), fytoceramide (PHC), fytosphingosine (PHS), fosphatidylcholine (PC), fosphatidy lethanolamine (PE), fosphatidylglycerol (PG), fosphatidylinositol (PI), fosphatidylserine (PS), en triacylglycerol (TAG) lipide klassen met behulp van een m / z tolerantie van 5 ppm voor voorloper ionen en 10 ppm voor productionen. Andere zoekparameters worden weergegeven in tabel 4. Volg de instructies in de gebruikershandleiding van de software. De identiteit van interne lipidenormen en lipidesoorten met ongebruikelijke vetzuursamenstelling moet handmatig worden geverifieerd.
- Gebruik de Lipid Data Analyzer(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine 2(http://mzmine.github.io/)of XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)software om ruwe gegevens van LC-MS/MS te verwerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke cellulaire lipiden in een gistcel met behulp van LC-MS/MS was veelzijdig en robuust. Het stelde ons in staat om 10 verschillende lipideklassen in S. cerevisiae cellen gekweekt in het synthetische minimale YNB medium in eerste instantie met 2% glucose te identificeren en te kwantificeren. Deze lipideklassen omvatten vrije (ongesteriliseerde) vetzuren (FFA), CL, fytoceramide (PHC), fytosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI, PS en TAG (Aanvullende Tabel 1). Talrijke moleculaire soorten van elk van deze klassen werden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van deze LC-MS/MS-methode (Aanvullende tabel 1).
Onze LC-MS/MS methode was ook gevoelig. Het maakte de identificatie en kwantificatie van moleculaire lipidensoorten in concentraties van 0,165 pmol/μL mogelijk (zie gegevens voor fytoceramide in tabel 5). Deze beperking van de kwantificatie verschilt voor verschillende lipideklassen binnen een breed scala aan concentraties (tabel 5).
Belangrijk is dat onze methode identificatie en kwantificering van verschillende isobarische of isomeric vormen van lipiden mogelijk maakte. Isobarische vormen van lipiden zijn lipidensoorten met dezelfde nominale massa (d.w.z. som van de massa's van de meest voorkomende isotopen), maar verschillen exacte massa's31. Isomeric vormen van lipiden zijn lipide soorten met dezelfde moleculaire formule, maar met verschillende chemische structuur31. Bijvoorbeeld, het gebruik van onze LC-MS / MS methode onderscheid gemaakt tussen PHC (16:0_26:0) en de isobarische lipide soort PC (16:0_10:0): hoewel ze dezelfde nominale massawaarde van 650, hun exacte massa's zijn 650.6457 en 650.4755, respectievelijk. Bovendien onderscheidde deze LC-MS/MS-methode tussen twee paren isomeric lipidesoorten met dezelfde moleculaire formule maar verschillende chemische structuur: 1) PC (18:0_18:1) en PC (20:0_16:1), met moleculaire formule (C44H87N1O8P1) en exacte massa (788.6163); en 2) PE (16:0_16:0) en PE (14:0_18:0), met de moleculaire formule (C37H75N1O8P1) en exacte massa (692.5224).
Onze LC-MS/MS-methode kan worden gebruikt om de efficiëntie van ionisatie voor lipiden van alle klassen te verhogen, waardoor de identificatie en kwantificering van belangrijke cellulaire lipiden wordt verbeterd. Een dergelijke verbetering kan worden bereikt door gebruik te maken van alternatieve mobiele faseadditieven voor de ESI-ms(tabel 6). Deze alternatieve fasen omvatten ammoniumformate, ammoniumformate met mierenzuur, ammoniumacetaat, ammoniumacetaat met acetaat en ammoniumacetaat met mierenzuur. Elk van deze alternatieve mobiele faseadditieven kan worden gebruikt voor zowel de normale fase als de omgekeerde fase LC-kolommen(tabel 6).
Een ander voordeel van onze LC-MS/MS methode is de mogelijkheid om twee verschillende methoden te gebruiken voor de fragmentatie van precursorionen (MS1) van lipiden in MS2-producten. Deze twee methoden zijn high-energy collisional dissociatie (HCD) en collision-geïnduceerde dissociatie (CID)32. We hebben vastgesteld dat de CID-methode nuttig is in combinatie met het mobiele ascetaatadditieven voor de ESI (-) modus van MS, omdat het onder deze omstandigheden een verhoging van de efficiëntie van ms1 lipide-ionfragmentatie in MS2-producten voor PHC, CL, FFA, PE, PG, PI en PS (tabel 7 )mogelijk maakt. De HCD-methode is daarentegen gunstig in combinatie met het ammoniumformate mobiele faseadditief voor de ESI (+) modus van MS, omdat het onder deze omstandigheden een verhoging van de efficiëntie van ms1 lipidionfragmentatie in MS2-producten voor PC, PHS en TAG (tabel 8) mogelijk maakt.
Figuur 1: De totale ionenchromatogram (TIC) uit vloeibare chromatografie/massaspectrometrie (LC/MS) gegevens van lipiden die werden gewonnen uit cellen van het wilde type stam BY4742. De TIC van lipiden gescheiden door LC op een omgekeerde fase kolom CSH C18 en gedetecteerd door MS van ouderionen die zijn gemaakt met behulp van de negatieve elektrospray ionisatie-modus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Een chromatogram van twee isomrische fosfoftidylserine vormen (34:0) die dezelfde m/z waarde (M-H) hebben van 762.5294 maar verschillende retentietijden van 7,65 min en 8,49 min. De lipiden werden gewonnen uit cellen van het wilde type stam BY4742 en gescheiden door vloeibare chromatografie op een omgekeerde fase kolom CSH C18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: MS1-spectra van twee isomrische fosfatenlse soorten (34:0) die dezelfde m/z-waarde (M-H) hebben van 762.5294, maar verschillende retentietijden van 7,65 min en 8,49 min. De lipiden werden gewonnen uit cellen van het wilde type stam BY4742, gescheiden door vloeibare chromatografie op een omgekeerde fase kolom CSH C18 (zoals weergegeven in figuur 2) en gedetecteerd door massaspectrometrie van ouder (MS1) ionen die werden gemaakt met behulp van de negatieve elektrospray ionisatie modus. (A) Het MS1-spectrum van een fosphatidylserinevorm (34:0) met de m/z-waarde (M-H) van 762,5294 en de retentietijd van 7,65 min. (B) Het MS1-spectrum van een fosphatidylserine vorm (34:0) met de m/z waarde (M-H) van 762.5294 en de retentietijd van 8,49 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: MS2-spectra van twee isomrische fosfatenlse soorten (34:0) die dezelfde m/z-waarde (M-H) hebben van 762.5294, maar verschillende retentietijden van 7,65 min en 8,49 min. De lipiden werden gewonnen uit cellen van de wilde soort stam BY4742, gescheiden door vloeibare chromatografie op een omgekeerde kolom CSH C18 (zoals weergegeven in figuur 2) en gedetecteerd door massaspectrometrie van MS1 ionen (zoals weergegeven in figuur 3). Secundaire ionen (MS2) werden vervolgens gedetecteerd door massaspectrometrie. (A) Het MS2-spectrum van een fosphatidylserinevorm (34:0) met de m/z-waarde (M-H) van 762,5294 en de retentietijd van 7,65 min. Het verlies van een serine moiety leverde een ion met de m/z waarde (M-H) op van 675.6149. (B) Het MS2-spectrum van een fosphatidylserinevorm (34:0) met de m/z-waarde (M-H) van 762,5294 en de retentietijd van 8,49 min. Het verlies van een serine moiety leverde een ion met de m/z waarde (M-H) op van 675.8843. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Detectiemodus | Lipideklasse | Hydrofobe staartsamenstelling | Berekende m/z-waarde | Concentratie (pmoles/μl) |
| Negatieve | Ceramide (Ceramide) | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negatieve | Cardiolipine | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negatieve | Gratis vetzuur | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negatieve | Phosphatidylethanolamine | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negatieve | Phosphatidylglycerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negatieve | Phosphatidylinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negatieve | Phosphatidylserine | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positieve | Fosphatidylcholine | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positieve | Fytosfineosine | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positieve | Triacylglycerol Triacylglycerol | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabel 1: De samenstelling van een mengsel van interne lipidenormen. Interne lipidenormen werden opgesteld in chloorvorm/methanol (2:1) mengsel. Detectie modus verwijst naar een positieve of negatieve modus van ouder ionen detectie met behulp van een Orbitrap Velos Mass Spectrometer uitgerust met elektrospray ionisatie (ESI) ionenbron. De berekende m/z-waarden zijn voor de adducts van lipiden.
| FTMS + p-resolutie | 60000 |
| Massabereik (dalton) | 150-2000 |
| Ionenbrontype | HESI HESI |
| Capillaire temperatuur (°C) | 300 |
| Temperatuur van de bronverwarming (°C) | 300 |
| De gasstroom van de schede | 10 |
| Aux-gasstroom | 5 |
| Positieve polariteitsspanning (kV) | 3 |
| Negatieve polariteitsspanning (kV) | 3 |
| Bronstroom (μA) | 100 |
Tabel 2: De instellingen van de Orbitrap Velos Mass Spectrometer worden gebruikt om lipiden te analyseren die door LC werden gescheiden. Afkortingen: FTMS + p = Fourier transform-based massaspectrometrie in de ESI (+) modus; HESI = verwarmde elektrospray ionisatie.
| Instrument polariteit | Positieve | Negatieve |
| Activeringstype | Hoog-energie-geïnduceerde-botsing-dissociatie | Botsing-geïnduceerde-dissociatie |
| Minimaal signaal nodig | 5000 | 5000 |
| Isolatiebreedte | 2 | 2 |
| Genormaliseerde botsingsenergie | 55 | 35 |
| Standaardlaadstatus | 2 | 2 |
| Activeringstijd | 0.1 | 10 |
| FTMS + C-resolutie | 7500 | |
| 5 meest intense pieken werden geselecteerd voor ms/ms |
Tabel 3: De instellingen van de Orbitrap Velos Mass Spectrometer die worden gebruikt om secundaire ionen (MS2) te detecteren. Afkorting: FTMS + C = Fourier transform-based mass spectrometrie in de ESI (+) modus.
| Identificatie | |
| Database | Orbitrap Orbitrap |
| Piekdetectie | Terugroepisotoop (ON) |
| Zoekoptie | Product zoeken Orbitrap |
| Zoektype | Product |
| Experimenttype | LC-MS |
| Precursortolerantie | 10 ppm |
| Producttolerantie | Hoog-energie-geïnduceerde-botsing-dissociatie [ESI (+) modus]: 20 ppm |
| Collision-induced-dissociatie [ESI (-) mode]: 0,5 Daltons | |
| Quantitatie | |
| Quantitatie uitvoeren | Op |
| m/z tolerantie | -5.0; +5.0 |
| Tolerantietype | Ppm |
| Filter | |
| Filter met de hoogste rang | Op |
| Hoofdknooppuntfilter | Belangrijkste isomerpiek |
| m-score drempel | 5 |
| c-score drempel | 2 |
| FFA prioriteit | Op |
| ID-kwaliteitsfilter | A: Lipideklasse en alle vetzuren zijn volledig geïdentificeerd |
| B: Lipideklasse en sommige vetzuren worden geïdentificeerd | |
| C: Lipide klasse of FA worden geïdentificeerd | |
| D: Lipide geïdentificeerd door andere fragmentionen (H2O, enz.) | |
| Lipideklasse | |
| Hoog-energie-geïnduceerde-botsing-dissociatie [ESI (+) modus] | PC, TAG |
| Botsing-geïnduceerde-dissociatie [ESI (-) modus] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Ionen | |
| Hoog-energie-geïnduceerde-botsing-dissociatie [ESI (+) modus] | + H; + NH4; + Na |
| Botsing-geïnduceerde-dissociatie [ESI (-) modus] | - H; - 2H; - HCOO |
Tabel 4: De zoekparameters die worden gebruikt om verschillende lipideklassen en soorten te identificeren met behulp van de Lipid Identification-software "Lipid Search" (V 4.1). Afkortingen: CER = ceramide; CL = cardiolipine; FFA = vrij (ongesteriliseerd) vetzuur; PC = fosphatidylcholine; PE = fosphatidylethanolamine; PG = fosphatidylglycerol; PI = fosphatidylinositol; PS = fosphatidylserine; TAG = triacylglycerol.
Tabel 5: De laagste concentraties moleculaire soorten van verschillende lipideklassen die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van onze LC-MS/MS-methode. Een schatting van de laagste kwantificeerbare concentratie voor elke lipideklasse is gebaseerd op de MS-piekgebieden voor zijn interne standaard (deze MS-piekgebieden en lipidestandaardconcentraties worden vet weergegeven) en de representatieve moleculaire vorm die aanwezig is bij de laagste detecteerbare concentratie. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde waarden van twee onafhankelijke experimenten, voor elk van die drie technische replicaties werden uitgevoerd. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
| Lipidestandaard | ESI-modus | Amf | AmF/FA | Amac Amac | Amac/AA | Amac/FA |
| PHC | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| Tag | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabel 6: De effecten van alternatieve mobiele faseadditieven voor de ESI MS op de efficiëntie van ionisatie voor lipiden van verschillende klassen. Verschillende lipiden werden van elkaar gescheiden door omgekeerde-fase vloeibare chromatografie. Commerciële lipidenormen die tot verschillende klassen lipiden behoren, worden in tabel 1genoemd. De ESI (-) of ESI (+) ionisatiemodus werd gebruikt voor MS in aanwezigheid van verschillende mobiele faseadditieven. Het percentage ionisatie voor elke lipidestandaard wordt weergegeven als een gemiddelde waarde van drie technische replicaties. Voor elke lipide werd het ionisatiepercentage berekend op basis van het MS-piekgebied. Een waarde van de hoogste ionisatie-efficiëntie voor elke lipide wordt vet weergegeven. Afkortingen: AmF = ammoniumformaat; AMF/FA = ammoniumformaat met mierenzuur; Oc = ammoniumacetaat; AmAc/AA = ammoniumacetaat met azijnzuur; Oc/FA = ammoniumacetaat met mierenzuur; CL = cardiolipine; FFA = vrij (ongesteriliseerd) vetzuur; PC = fosphatidylcholine; PE = fosphatidylethanolamine; PG = fosphatidylglycerol; PHC = fytoceramide; PHS = fytosphingosine; PI = fosphatidylinositol; PS = fosphatidylserine; TAG = triacylglycerol.
| Lipidestandaard | ESI-modus | Amf | Amac Amac |
| PHC | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| Tag | + | 65.7 | 69.7 |
Tabel 7: Het effect van de door botsing veroorzaakte dissociatiemethode (CID) op de efficiëntie van precursorionen (MS1) fragmentatie. Commerciële lipidenormen die tot verschillende klassen lipiden behoren, worden in tabel 1genoemd. De ESI (-) of ESI (+) ionisatiemodus werd gebruikt voor MS, in aanwezigheid van een ammoniumformate (AmF) of ammoniumacetaat (AmAc) mobiele faseadditief. Het percentage ms1 lipidionen dat in MS2-producten is gefragmenteerd, wordt weergegeven als een gemiddelde waarde van drie technische repliceringen. Voor elke lipide werd het ionisatiepercentage berekend op basis van het MS2-piekgebied. Een waarde van het hoogste percentage ms1 lipide-ionen die zijn gefragmenteerd, wordt vet weergegeven voor elke lipide (vergelijk met de gegevens in tabel 8). Deze waarde is het hoogst als de efficiëntie van MS2 productionenvorming het hoogst is. Afkortingen: CL = cardiolipine; FFA = vrij (ongesteriliseerd) vetzuur; PC = fosphatidylcholine; PE = fosphatidylethanolamine; PG = fosphatidylglycerol; PHC = fytoceramide; PHS = fytosphingosine; PI = fosphatidylinositol; PS = fosphatidylserine; TAG = triacylglycerol.
| Lipidestandaard | ESI-modus | Amf | Amac Amac |
| PHC | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| Tag | + | 91.4 | 84.9 |
Tabel 8: Het effect van de methode van de hoge-energie botsingsdissociatie (HCD) op de efficiëntie van precursorionen (MS1) fragmentatie. Commerciële lipidenormen die tot verschillende klassen lipiden behoren, worden in tabel 1genoemd. De ESI (-) of ESI (+) ionisatiemodus werd gebruikt voor MS, in aanwezigheid van een ammoniumformate (AmF) of ammoniumacetaat (AmAc) mobiele faseadditief. Het percentage ms1 lipidionen dat in MS2-producten is gefragmenteerd, wordt weergegeven als een gemiddelde waarde van drie technische repliceringen. Voor elke lipide werd het ionisatiepercentage berekend op basis van het MS2-piekgebied. Een waarde van het hoogste percentage ms1 lipide-ionen die zijn gefragmenteerd, wordt vet weergegeven voor elke lipide (vergelijk met de gegevens in tabel 7). Deze waarde is het hoogst als de efficiëntie van MS2 productionenvorming het hoogst is. Andere afkortingen: CL = cardiolipine; FFA = vrij (ongesteriliseerd) vetzuur; PC = fosphatidylcholine; PE = fosphatidylethanolamine; PG = fosphatidylglycerol; PHC = fytoceramide; PHS = fytosphingosine; PI = fosphatidylinositol; PS = fosphatidylserine; TAG = triacylglycerol.
Aanvullende tabel 1: Een lijst van moleculaire soorten van 10 verschillende lipideklassen geïdentificeerd en gekwantificeerd in S. cerevisiaecellen met behulp van onze LC-MS/MS-methode. Deze lipideklassen omvatten vrije (ongesteriliseerde) vetzuren (FFA), cardiolipine (CL), fytoceramide (PHC), fytosphingosine (PHS), fosphatidylcholine (PC), fosphatidylethanolamine (PE), fosphatidylglycerol (PG), fosphatidylinositol (PI phosphatidylserine (PS), en triacyllyceyrol (TAG). S. cerevisiae cellen werden gekweekt in de synthetische minimale YNB medium in eerste instantie met 2% glucose. Aliquots van gistcellen voor lipideextractie en LC-MS/MS analyse van geëxtraheerde lipiden werden teruggewonnen op dagen 1, 2, 3, 4, 6, 8 en 10 van het kweken. Alle lipidesoorten van elke lipideklasse die werden geïdentificeerd in gistcellen die op verschillende dagen van het kweken zijn teruggewonnen, worden getoond. Sommige van deze lipidesoorten waren alleen aanwezig in chronologisch jonge gistcellen hersteld op dag 1-4 van het kweken, anderen alleen in chronologisch oude gistcellen hersteld op dag 6-10 van het kweken, terwijl sommige aanwezig waren in zowel chronologisch jonge als oude gistcellen. Het hoogste MS-piekgebied voor elke lipidesoort van elke lipideklasse die op een bepaalde dag van kweek wordt geïdentificeerd, wordt weergegeven. Lipide normen van verschillende lipide klassen die werden gebruikt voor de kwantificering van andere soorten binnen deze lipide klasse worden weergegeven in rode kleur. De berekende m/z-waarden zijn voor de adducts van lipiden. Afkorting: ESI (-) = de ESI (-) modus van MS; ESI (+) = de ESI (+) modus van MS. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde waarden van twee onafhankelijke experimenten, voor elk van die drie technische replicaties werden uitgevoerd. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De volgende voorzorgsmaatregelen zijn belangrijk voor de succesvolle uitvoering van het hier beschreven protocol:
1. Chloroform en methanol zijn giftig. Ze halen efficiënt verschillende stoffen uit oppervlakken, waaronder laboratoriumplasticware en uw huid. Behandel deze organische oplosmiddelen daarom voorzichtig door het gebruik van kunststoffen te vermijden in stappen die contact met chloroform en/of methanol inhouden, met behulp van borosilicaatglaspipetten voor deze stappen, en spoel deze pipetten af met chloroform en methanol voor gebruik.
2. Gebruik bij lipideextractie door methanol/chloroform (17:1) een borosilicaatglaspipet om de lagere organische fase (~400 μL) over te brengen naar een centrifugebuis met hoge sterkte van 15 mL met hoge sterkte glazen schroefmeteen dop met een met polytetrafluorethyleen gevoerde dop. Verstoor de glazen kralen of de bovenste waterige fase tijdens een dergelijke overdracht niet. Houd de lagere organische fase onder de stroom van stikstofgas.
3. Tijdens de voorbereiding van het monster voor LC-MS/MS is het belangrijk om alle luchtbellen in de glazen flesjes te elimineren voordat de flacons in een wellplate worden gestoken.
4. Los elk zout op in 500 μL nanozuiver water voordat u de oplossing mengt met de mobiele fase A en B voordat de lipidescheiding door LC wordt gescheiden, lost u elk zout op in 500 μL nanozuiver water voordat u de oplossing mengt met de mobiele fase en gedurende 20 minuten soniceren.
5. Bewaar de lipidefilm die na verdamping van oplosmiddelen is gevormd gedurende een lange periode niet voordat u gaat hardlopen. We slaan deze film op -80 °C voor niet meer dan een week voordat we deze oplossen in het acetonitril/2-propanol/nano-zuiver water (65:35:5) mengsel en vervolgens de lipiden onderwerpen aan LC-MS/MS.
De LC-MS/MS-methode die hier wordt beschreven, is een veelzijdige, robuuste en gevoelige techniek voor een kwantitatieve beoordeling van vele lipidesoorten die bestaan uit het cellulaire lipidoom van gist of een ander eukaryotisch organisme. De methode maakt de identificatie en kwantificering van verschillende isobarische of isomeric lipidesoorten mogelijk, maakt het mogelijk om alternatieve mobiele faseadditieven voor de ESI MS te gebruiken om lipide-ionisatie te bevorderen en lipide-identificatie en kwantificering efficiënter te maken, en kan zowel HCD- als CID-methoden gebruiken voor de fragmentatie of activering van MS1 lipideionen.
We gebruiken deze LC-MS/MS methode om leeftijdsgebonden veranderingen in de cellulaire en organelellar lipidomen te bestuderen tijdens chronologische veroudering van de ontluikende gist S. cerevisiae. We gebruiken deze methode ook om te onderzoeken hoeveel verouderingsvertragende genetische, dieet- en farmacologische interventies de lipidesamenstelling van de gehele S. cerevisiaecel en de verschillende organellen beïnvloeden. Vanwege zijn veelzijdigheid, robuustheid en gevoeligheid kan deze LC-MS/MS-methode met succes worden gebruikt voor de kwantitatieve beoordeling van de cellulaire en organelelellipiden bij eukaryotische organismen in fylo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We zijn de huidige en voormalige leden van het Titorenko laboratorium dankbaar voor discussies. Wij erkennen het Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry en het Centre for Structural and Functional Genomics (beide aan de Concordia University) voor uitstekende diensten. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN 2014-04482) en Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. werd ondersteund door de Concordia University Merit Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
