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Biochemistry

सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Published: March 8, 2020 doi: 10.3791/60616
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

हम सचारोमाइसेस सेरेविसियामें प्रमुख सेलुलर लिपिड की पहचान करने और उसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए मिलकर द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। खमीर कोशिका के भीतर प्रमुख लिपिड कक्षाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए वर्णित विधि बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील है।

Abstract

लिपिड संरचनात्मक रूप से विविध एम्फीपैथिक अणु हैं जो पानी में अघुलनशील हैं। लिपिड जैविक झिल्ली, ऊर्जा भंडारण और उत्पादन, सेलुलर सिग्नलिंग, प्रोटीन के वेसिकुलर परिवहन, ऑर्गेनेल बायोजेनेसिस और विनियमित सेल डेथ के संगठन और कार्य में आवश्यक योगदानकर्ता हैं। क्योंकि नवोदित खमीर सैचारोमाइसेस सेरेविसिया पूरी तरह से आणविक विश्लेषण करने के लिए एक एकएककोशिकीय यूकेरियोट उत्तरदायी है, एक मॉडल जीव के रूप में इसके उपयोग ने लिपिड मेटाबोलिज्म और इंट्रासेलुलर परिवहन को यूकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर जटिल जैविक प्रक्रियाओं को जोड़ने वाले तंत्र को उजागर करने में मदद की। खमीर कोशिका के भीतर लिपिड के प्रमुख वर्गों के मजबूत, संवेदनशील और सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक विधि की उपलब्धता इन तंत्रों में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हम एस सेरेविसिया के प्रमुख सेलुलर लिपिड के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एलसी-एमएस/एमएस विधि वर्णित बहुमुखी और मजबूत है । यह 10 लिपिड कक्षाओं में से प्रत्येक के भीतर कई प्रजातियों (विभिन्न आइसोबेरिक या आइसोमिक रूपों सहित) की पहचान और मात्रा को सक्षम बनाता है। यह विधि संवेदनशील है और सांद्रता पर कुछ लिपिड प्रजातियों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है, जो ०.२ pmol/μL के रूप में कम है । विधि सफलतापूर्वक पूरे खमीर कोशिकाओं और उनके शुद्ध ऑर्गेनेल्स के लिपिडोम्स का आकलन करने के लिए लागू किया गया है। इस विधि में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए वैकल्पिक मोबाइल चरण योजक का उपयोग कुछ लिपिड प्रजातियों के लिए आयनीकरण की दक्षता को बढ़ा सकता है और इसलिए इसका उपयोग उनकी पहचान और मात्रा में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

साक्ष्य का एक शरीर इंगित करता है कि लिपिड, जैव अणुओं के प्रमुख वर्गों में से एक, एक यूकेरियोटिक सेल के भीतर कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में आवश्यक भूमिकानिभाते हैं। इन प्रक्रियाओं में लिपिड बाइलेयर की असेंबली शामिल है जो सेलुलर ऑर्गेनेल्स के आसपास प्लाज्मा झिल्ली और झिल्ली का गठन करती है, कोशिका झिल्ली में छोटे अणुओं का परिवहन, बाह्य वातावरण और इंट्राकोशियलर सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन में परिवर्तन के लिए प्रतिक्रिया, ऊर्जा का उत्पादन और भंडारण, विभिन्न ऑर्गेनेल्स तक सीमित प्रोटीन का आयात और निर्यात, एंडोम्ब्रेनिक सिस्टम और प्रोटीन स्राव के भीतर प्रोटीन की वैसिकुलर तस्करी, और कई मोड ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

नवोदित खमीर एस cerevisiae,एक एकही सेलुलर यूकेरियोटिक जीव, सफलतापूर्वक इन महत्वपूर्ण सेलुलरप्रक्रियाओं4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 में लिपिड की आवश्यक भूमिकाओं अंतर्निहित तंत्र में से कुछ को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ,16,17,18,19,20. एस सेरेविसिया इन तंत्रों को उजागर करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है क्योंकि यह व्यापक जैव रासायनिक, आनुवंशिक, कोशिका जैविक, रासायनिक जैविक, प्रणाली जैविक और माइक्रोफ्लूइडिक विच्छेदन के लिए उत्तरदायी है21,22,23,24,25का विश्लेषण करता है। तंत्र को समझने में आगे प्रगति जिसके माध्यम से लिपिड चयापचय और इंट्रासेलर परिवहन इन महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में योगदान सेलुलर लिपिडोम के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है, लिपिडोम आणविक जटिलता को समझना, और मात्रात्मक लिपिडोमिक्स को सिस्टम जीव विज्ञान1,2,3,26के बहुविषयक मंच में एकीकृतकरना, 27,28,29,30.

खमीर कोशिकाओं और अन्य यूकेरियोटिक जीवों की कोशिकाओं के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री-असिस्टेड क्वांटिटेटिव लिपिडोमिक्स के लिए वर्तमान तरीके पर्याप्त रूप से बहुमुखी, मजबूत या संवेदनशील नहीं हैं। इसके अलावा, वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले ये तरीके विभिन्न आइसोबेरिक या आइसोमरिक लिपिड प्रजातियों को एक दूसरे से अलग करने में असमर्थ हैं। यहां हम एक बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील विधि का वर्णन करते हैं जो एस सेरेविसीके प्रमुख सेलुलर लिपिड के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी के उपयोग की अनुमति देता है।

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Protocol

1. खमीर की रचनात्मकता के लिए बाँझ मीडिया की तैयारी

  1. एक पूर्ण वाईपी माध्यम का 90 मीटर तैयार करें जिसमें 1% (w/v) खमीर निकालने और 2% (w/v) बैक्टोपेप्टोन शामिल है।
  2. एक सिंथेटिक न्यूनतम YNB माध्यम के ९० mL तैयार अमीनो एसिड के बिना ०.६७% (w/v) खमीर नाइट्रोजन आधार युक्त, 20 मिलीग्राम/एल एल-हिस्टिडीन, 30 मिलीग्राम/एल एल-ल्यूसिन,30 मिलीग्राम/एल-लाइसिन, और 20 मिलीग्राम/एल उरासिल ।
  3. पूर्ण वाईपी माध्यम के 90 मीटर को समान रूप से दो 250 मीटर एर्लेनमेयर फ्लैक्स (यानी, 45 मीटर प्रत्येक) में विभाजित करें।
  4. सिंथेटिक न्यूनतम YNB माध्यम के 90 mL को दो 250 मीटर एर्लेंमेयेर फ्लैक्स (यानी, 45 एमएल प्रत्येक) में विभाजित करें।
  5. उपयोग करने से पहले 45 मिन के लिए 15 साई/121 डिग्री सेल्सियस पर वाईपी और आईएनबी मीडिया के साथ फ्लास्क को ऑटोक्लेव करें।

2. खमीर तनाव

  1. जंगली प्रकार तनाव BY4742(MATα his3Ο1 leu2Ο0 lys2Ο0 ura3Ο0)का प्रयोग करें ।

3. ग्लूकोज के साथ पूर्ण वाईपी माध्यम में खमीर की रचनात्मकता

  1. ऑटोक्लेव उपयोग से पहले 45 मिन के लिए 15 साई/121 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूकोज का 20% (w/v) स्टॉक समाधान।
  2. बाँझ 20% (w/v) ग्लूकोज के स्टॉक समाधान के प्रत्येक के लिए 2% ग्लूकोज (w/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ YP माध्यम युक्त फ्लैक्स जोड़ें ।
  3. ग्लूकोज के साथ वाईपी माध्यम युक्त दो Erlenmeyer फ्लास्क में से प्रत्येक में जंगली प्रकार तनाव BY4742 की कोशिकाओं को टीका लगाने के लिए एक माइक्रोबायोलॉजिकल लूप का उपयोग करें।
  4. 200 आरपीएम पर घूर्णन मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को संस्कृति।
  5. खमीर संस्कृति का एक बहाना ले लो। संस्कृति के प्रति एमएल खमीर कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।

4. खमीर को स्थानांतरित करना और उन्हें ग्लूकोज के साथ सिंथेटिक न्यूनतम YNB माध्यम में संजोना

  1. बाँझ 20% (w/v) ग्लूकोज के स्टॉक समाधान के प्रत्येक के लिए 2% ग्लूकोज (w/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ YNB माध्यम युक्त फ्लैक्स जोड़ें ।
  2. रातोंरात खमीर संस्कृति की मात्रा को स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ पिपेट का उपयोग करें जिसमें ग्लूकोज के साथ YNB माध्यम वाले दो एर्लेनमेयर फ्लास्क में से प्रत्येक में 5.0 x 107 कोशिकाओं की कुल संख्या शामिल है।
  3. संस्कृति कम से कम 24 घंटे (या अधिक, यदि प्रयोग की आवश्यकता है) के लिए कोशिकाओं को 200 आरपीएम पर घूर्णन मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर।

5. लिपिड निकालने के लिए अभिकर्मकों, लैबवेयर और उपकरणों की तैयारी

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1) उच्च ग्रेड (>99.9%) क्लोरोफॉर्म; 2) उच्च ग्रेड (>99.9%) मेथनॉल; 3) नैनो-शुद्ध पानी में 28% (v/v) अमोनियम हाइड्रोक्साइड समाधान; 4) कांच के मोतियों (एसिड धोया, 425-600 μM); 5) उपयुक्त एडाप्टर के साथ एक भंवर; 6) पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन लाइन वाली कैप के साथ 15 मेगाल हाई-स्पीड ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब; 7) क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के 17:1 और 2:1 मिश्रण; 8) 0.1% अमोनियम हाइड्रोक्साइड (v/v) के साथ एक क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (2:1) मिश्रण; 9) एबीसी समाधान (155 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट, पीएच = 8.0); 10) क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के 2:1 मिश्रण में तैयार आंतरिक लिपिड मानकों का मिश्रण जैसा कि तालिका 1में इंगित किया गया है; और 11) सेलुलर लिपिड की निकासी के लिए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन लाइन वाली टोपियों के साथ 2 एमएल ग्लास नमूना शीशियां।

6. एलसी के लिए अभिकर्मकों, लैबवेयर और उपकरणों की तैयारी

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1) एसीटोनिट्रिल/2-प्रोपेनॉल/नैनो-शुद्ध पानी (65:35:5) मिश्रण; 2) उपयुक्त एडाप्टर के साथ एक भंवर; 3) एक अल्ट्रासोनिक सोनिकेटर; 4) एक वेलप्लेट के लिए आवेषण के साथ कांच की शीशियां; 5) एक एलसी सिस्टम जो बाइनरी पंप, डेगासर और एक ऑटोसैंपलर से लैस है; 6) एक C18 रिवर्स चरण कॉलम (२.१ मिमी; ७५ मिमी; ताकना आकार १३० Å; 1-11 की पीएच रेंज) एक पूर्व कॉलम प्रणाली के साथ मिलकर; 7) मिश्रण ए: एसीटोनिट्रिल/पानी (60:40); और 8) मिश्रण बी: आइसोप्रोपेनॉल/एसीटोनिट्रिल (90:10) ।

7. खमीर कोशिकाओं से लिपिड निष्कर्षण

  1. खमीर संस्कृति का एक बहाना ले लो। संस्कृति के प्रति एमएल खमीर कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर या उपाय OD600 का उपयोग करें।
  2. खमीर संस्कृति की मात्रा लें जिसमें कुल संख्या 5.0 x 107 कोशिकाएं (3.3 इकाइयां ओडी600)हैं। संस्कृति की इस मात्रा को एक प्रीचिलग्ड 1.5 मिलीस माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूब में रखें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को काटें। अधिस्थान त्यागें।
  4. 1.5 मिलीग्राम बर्फ-ठंडा नैनो-शुद्ध पानी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा कोशिकाओं को धोएं। अधिस्थान त्यागें।
  5. बर्फ-ठंडा एबीसी समाधान के 1.5 मिलीग्राम जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को धोलें। अधिस्थान त्यागें। लिपिड निकालने से पहले सेल पैलेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  6. लिपिड निष्कर्षण शुरू करने के लिए, बर्फ पर सेल गोली गल।
  7. बर्फ ठंड नैनो शुद्ध पानी के २०० μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें । सेल निलंबन को पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन लाइन कैप के साथ 15 मिलीस हाई-स्ट्रेंथ ग्लास स्क्रू टॉप सेंट्रलाइज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। इस ट्यूब में निम्नलिखित जोड़ें: 1) क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (2:1) मिश्रण में तैयार आंतरिक लिपिड मानकों के मिश्रण का 25 μL; 2) 425-600 माइक्रोन एसिड धोया ग्लास मोतियों के 100 μL; और 3) क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (17:1) मिश्रण का ६०० μL ।
  8. कोशिकाओं को बाधित करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम के लिए उच्च गति पर ट्यूब भंवर।
  9. भंवर लिपिड की निकासी की सुविधा के लिए आरटी में 1 घंटे के लिए कम गति पर ट्यूब ।
  10. प्रोटीन वर्षा को बढ़ावा देने और जलीय और कार्बनिक चरणों को एक दूसरे से अलग करने के लिए बर्फ पर 15 मिन के लिए नमूना इनक्यूबेट करें।
  11. आरटी में 5 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में ट्यूब अपकेंद्रित्र। यह केंद्रीकरण कदम निचले कार्बनिक चरण से ऊपरी जलीय चरण को अलग करने की अनुमति देता है, जिसमें सभी लिपिड कक्षाएं शामिल हैं।
  12. एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन लाइन ्डलाइन कैप के साथ एक और 15 मीटर उच्च शक्ति ग्लास स्क्रू टॉप सेंट्रलाइज ट्यूब में कम कार्बनिक चरण (~ 400 माइक्रोन) स्थानांतरित करने के लिए एक बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करें। इस तरह के हस्तांतरण के दौरान कांच के मोतियों या ऊपरी जलीय चरण को बाधित न करें। नाइट्रोजन गैस के प्रवाह के तहत कम कार्बनिक चरण रखें।
  13. शेष ऊपरी जलीय चरण में क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल (2:1) मिश्रण के 300 माइक्रोन जोड़ें ताकि स्फिगोलिपिड और पीए, पीएस, पीआई और सीएल के निष्कर्षण को आरटी में 5 मिन के लिए ट्यूब को सख्ती से इंगित किया जा सके।
  14. आरटी में 5 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  15. चरण 7.13 पर एकत्र किए गए कार्बनिक चरण में केंद्रीकरण के बाद गठित निचले कार्बनिक चरण (~ 200 माइक्रोन) को स्थानांतरित करने के लिए एक बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करें।
  16. संयुक्त कार्बनिक चरणों में सॉल्वेंट को वाष्पित करने के लिए नाइट्रोजन गैस के प्रवाह का उपयोग करें। नाइट्रोजन गैस के प्रवाह के तहत लिपिड फिल्म युक्त ट्यूबों को बंद करें। इन ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. एलसी द्वारा निकाले गए लिपिड का पृथक्करण

  1. 7.16 के चरण में प्राप्त लिपिड फिल्म वाली ट्यूब में एसीटोनिट्रिल/2-प्रोपेनॉल/नैनो-शुद्ध पानी (65:35:5) मिश्रण के 500 माइक्रोन जोड़ें। भंवर आरटी में 10 एस के लिए ट्यूब 3x ।
  2. 15 मिन के लिए अल्ट्रासोनिक सोनिकेशन के लिए ट्यूब की सामग्री विषय । भंवर आरटी में 10 एस के लिए ट्यूब 3x ।
  3. ट्यूब से एक नमूने के 100 μL ले लो और यह एक अच्छी तरह से प्लेट के लिए इस्तेमाल डाला के साथ एक गिलास शीशी में जोड़ें । इसे वेलप्लेट में पेसकरने से पहले डालने में हवा के बुलबुले को खत्म करें।
  4. रिवर्स-चरण C18 कॉलम CSH पर विभिन्न लिपिड प्रजातियों को अलग करने के लिए एक एलसी सिस्टम का उपयोग करें जो पूर्व-कॉलम प्रणाली (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ मिलकर। पृथक्करण के दौरान कॉलम को 55 डिग्री सेल्सियस और 03 मीटर/मिन की प्रवाह दर पर बनाए रखें। - सैंपल को आरटी पर वेलप्लेट में रखें।
  5. उन मोबाइल चरणों का उपयोग करें जिनमें मिश्रण ए (एसीटोनिट्रिल/पानी [60:40 (v/v))) और मिश्रण बी (आइसोप्रोपेनॉल/एसीटोनिट्रिल [90:10 (v/v)) शामिल हैं । इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) आयन स्रोत, ईएसआई (+) मोड का उपयोग करके बनाए गए माता-पिता आयनों का पता लगाने के सकारात्मक मोड के लिए, मोबाइल चरणए और बी में 10 मीटर की अंतिम एकाग्रता पर अमोनियम फोरमेट होता है। माता-पिता आयनों का पता लगाने के नकारात्मक मोड के लिए, ईएसआई (-) मोड, मोबाइल चरणों ए और बी में 10 mM की अंतिम एकाग्रता पर अमोनियम एसीटेट होता है।
  6. ईएसआई (+) और ईएसआई (-) मोड दोनों में इंजेक्शन के लिए 10 माइक्रोन के सैंपल वॉल्यूम का इस्तेमाल करें।
  7. निम्नलिखित एलसी ढाल का उपयोग करके एलसी द्वारा अलग-अलग लिपिड प्रजातियां: 0-1 मिन 10% (चरण बी); 1-4 मिन 60% (चरण बी); 4-10 0 068% (चरण बी); 10-21 97% (चरण बी); 21-24 मिन 97% (चरण बी); 24-33 मिन 10% (चरण बी) ।
  8. हर चार नमूनों के बीच, और अंतिम नमूने के रूप में, पहले नमूने के रूप में निष्कर्षण रिक्त स्थान चलाएं। डेटा को सामान्य करने के लिए पृष्ठभूमि को घटाना।
  9. जंगली प्रकार की कोशिकाओं से निकाले गए लिपिड के एलसी/एमएस डेटा से एक प्रतिनिधि कुल आयन क्रोमेटोग्राम को चित्र ा 1में दिखाया गया है ।

9. एलसी द्वारा अलग लिपिड का मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण

  1. एलसी द्वारा अलग किए गए लिपिड का विश्लेषण करने के लिए हेसी (गर्म इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण) आयन स्रोत से लैस एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें। तालिका 2में प्रदान की गई सेटिंग्स का उपयोग करें ।
  2. 60,000 के संकल्प पर और 150-2,000 डीए की द्रव्यमान सीमा के भीतर माता-पिता आयनों (MS1) का पता लगाने के लिए फोरियर ट्रांसफॉर्म एनालाइजर का उपयोग करें।
  3. माध्यमिक आयनों (MS2) का पता लगाने के लिए तालिका 3 में प्रदान की गई सेटिंग्स का उपयोग करें।

10. एलसी-एमएस/एमएस से कच्चे डेटा के प्रसंस्करण द्वारा विभिन्न लिपिड वर्गों और प्रजातियों की पहचान और मात्रा

  1. कच्चे एलसी-एमएस/एमएस फाइलों से विभिन्न लिपिड की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें । यह सॉफ्टवेयर सबसे बड़े लिपिड डेटाबेस का उपयोग करता है, जिसमें 1.5 मिलियन लिपिड आयन अग्रदूत (एमएस1) और उनके अनुमानित टुकड़े आयन (एमएस 2) शामिल हैं। सॉफ्टवेयर लिपिड क्वांटिटेशन और लिपिड पहचान के लिए एमएस2 चोटियों का भी उपयोग करता है। दो इसोमिक फॉस्फेटिफलेरिन रूपों (34:0) के एक प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम जिनका एक ही एम/जेड मूल्य है लेकिन अलग-अलग प्रतिधारण समय, साथ ही उनके MS1 और MS2 स्पेक्ट्रा को क्रमशः चित्रा 2, चित्रा 3और चित्रा 4में दिखाया गया है।
  2. पूर्ण स्कैन MS1 डेटा और डेटा पर निर्भर MS2 डेटा मुक्त (unesterified) फैटी एसिड (FFA), कार्डियोलिपिन (सीएल), फाइटोसेरामाइड (पीएचसी), फाइटोस्फिफाइन (पीएचएस), फॉस्फेटिडिलचोलिन (पीसी), फॉस्फेटिफिलेनॉल थेलनॉल वाली एलसी-एमएस कच्ची फाइलें खोजें amine (पीई), फॉस्फेटिपल्ललिसेरोल (पीजी), फॉस्फेटिलिओसिटोल (पीआई), फॉस्फेटिटिलसेरीन (पीएस), और ट्राइसिल्ग्लिसरोल (टैग) लिपिड कक्षाएं अग्रदूत आयनों के लिए 5 पीपीएम की एम/जेड सहिष्णुता और उत्पाद आयनों के लिए 10 पीपीएम का उपयोग कर रही हैं । अन्य खोज पैरामीटर तालिका 4में दिखाए जाते हैं। सॉफ्टवेयर यूजर मैनुअल में दिए गए निर्देशों का पालन करें। असामान्य फैटी एसिड संरचना के साथ आंतरिक लिपिड मानकों और लिपिड प्रजातियों की पहचान मैन्युअल रूप से सत्यापित करने की आवश्यकता है।
  3. लिपिड खोज सॉफ्टवेयर के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ओपन-सोर्स विकल्पों की मदद से विभिन्न लिपिड कक्षाओं और प्रजातियों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए, एलसी-एमएस/एमएस से कच्चे डेटा को संसाधित करने के लिए लिपिड डेटा एनालाइजर(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),एमजेडमाइन 2(http://mzmine.github.io/),या एक्ससीएमएस(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

एलसी-एमएस/एमएस की मदद से खमीर सेल के भीतर प्रमुख सेलुलर लिपिड के मात्रात्मक आकलन के लिए हमारी विधि बहुमुखी और मजबूत थी । इसने हमें शुरू में 2% ग्लूकोज युक्त सिंथेटिक न्यूनतम YNB माध्यम में सुसंस्कृत एस cerevisiae कोशिकाओं में 10 विभिन्न लिपिड कक्षाओं की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति दी। इन लिपिड कक्षाओं में मुफ्त (अनस्टेरेफाइड) फैटी एसिड (एफएफए), सीएल, फाइटोसेरामाइड (पीएचसी), फाइटोस्फिनोसिन (पीएचएस), पीसी, पीई, पीजी, पीआई, पीएस और टैग(सप्लीमेंटल टेबल 1)शामिल हैं। इन कक्षाओं में से प्रत्येक की कई आणविक प्रजातियों की पहचान की गई और इस एलसी-एमएस/एमएस विधि(पूरक तालिका 1)का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई ।

हमारी एलसी-एमएस/एमएस विधि भी संवेदनशील थी । दरअसल, इसने सांद्रता पर लिपिड की आणविक प्रजातियों की पहचान और मात्रा को 0.165 pmol/μL के रूप में कम किया (तालिका 5में फाइटोसेरामाइड के लिए डेटा देखें)। क्वांटिशन की यह सीमा सांद्रता(तालिका 5)की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर विभिन्न लिपिड कक्षाओं के लिए अलग-अलग है।

महत्वपूर्ण बात, हमारी विधि पहचान और लिपिड के विभिन्न आइसोबेरिक या आइसोमरिक रूपों की मात्रा की अनुमति दी। लिपिड के आइसोबेरिक रूप एक ही नाममात्र द्रव्यमान (यानी, सबसे प्रचुर मात्रा में आइसोटोप की जनता की राशि) के साथ लिपिड प्रजातियां हैं, लेकिन सटीक जनता31भिन्न होती हैं। लिपिड के इसोमिक रूप लिपिड प्रजाति यां हैं जिनमें एक ही आणविक सूत्र होता है लेकिन विभिन्न रासायनिक संरचना31के साथ । उदाहरण के लिए, पीएचसी (16:0_26:0) और आइसोबेरिक लिपिड प्रजातियों पीसी (16:0_10:0) के बीच प्रतिष्ठित हमारे एलसी-एमएस/एमएस विधि का उपयोग: हालांकि उनके पास 650 का एक ही नाममात्र द्रव्यमान मूल्य है, उनकी सटीक जनता क्रमशः 650.6457 और 650.4755 हैं। इसके अलावा, यह एलसी-एमएस/एमएस विधि एक ही आणविक सूत्र लेकिन विभिन्न रासायनिक संरचना के साथ इसोमरिक लिपिड प्रजातियों के दो जोड़े के बीच प्रतिष्ठित है: 1) पीसी (18:0_18:1) और पीसी (20:0_16:1), आणविक सूत्र (C44H87N1O8P1) और सटीक द्रव्यमान (788.6163); और 2) पीई (16:0_16:0) और पीई (14:0_18:0), आणविक सूत्र (C37H75N1O8P1) और सटीक द्रव्यमान (692.5224) के साथ।

हमारी एलसी-एमएस/एमएस विधि का उपयोग सभी वर्गों के लिपिड के लिए आयनीकरण की दक्षता बढ़ाने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार प्रमुख सेलुलर लिपिड की पहचान और मात्रा में सुधार हो ता है । ईएसआई एमएस(टेबल 6)के लिए वैकल्पिक मोबाइल चरण एडिटिव्स का उपयोग करके इस तरह के सुधार को प्राप्त किया जा सकता है। इन वैकल्पिक चरणों में अमोनियम फोरमेट, हार्मोनियम फोरमेट के साथ फोरिक एसिड, अमोनियम एसीटेट, एसिटिक एसिड के साथ अमोनियम एसीटेट, और हार्मोनियम एसीटेट शामिल हैं। इन वैकल्पिक मोबाइल चरण एडिटिव्स में से प्रत्येक का उपयोग सामान्य चरण और रिवर्स-चरण एलसी कॉलम(तालिका 6)दोनों के लिए किया जा सकता है।

हमारे एलसी-एमएस/एमएस विधि का एक और लाभ MS2 उत्पादों में लिपिड के अग्रदूत आयनों (MS1) के विखंडन के लिए दो अलग तरीकों का उपयोग करने की क्षमता में होते हैं । ये दो तरीके उच्च ऊर्जा टकराव विच्छेदन (एचसीडी) और टकराव से प्रेरित विच्छेदन (सीआईडी)३२हैं । हमने पाया कि सीआईडी विधि फायदेमंद है अगर एमएस के ईएसआई (-) मोड के लिए अमोनियम एसीटेट मोबाइल चरण योजक के संयोजन में इस्तेमाल किया जाता है, क्योंकि इन परिस्थितियों में यह पीएचसी, सीएल, एफएफए, पीई, पीजी, पीआई और पीएस(टेबल 7)के लिए एमएस 2 उत्पादों में एमएस1 लिपिड आयन विखंडन की दक्षता में वृद्धि की अनुमति देता है । इसके विपरीत, एचसीडी विधि अनुकूल है यदि एमएस के ईएसआई (+) मोड के लिए अमोनियम फोर्टमेट मोबाइल चरण योजक के संयोजन में उपयोग किया जाता है, क्योंकि इन परिस्थितियों में यह पीसी, पीएचएस और टैग(टेबल 8)के लिए एमएस 2 उत्पादों में एमएस1 लिपिड आयन विखंडन की दक्षता में वृद्धि को सक्षम बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1: तरल क्रोमेटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस) लिपिड के डेटा से कुल आयन क्रोमेटोग्राम (TIC) जो जंगली प्रकार की कोशिकाओं से निकाले गए थे BY4742 । एक रिवर्स-चरण कॉलम सीएसएच C18 पर एलसी द्वारा अलग किए गए लिपिड का TIC और नकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड का उपयोग करके बनाए गए माता-पिता आयनों के एमएस द्वारा पता लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दो इसोमिक फॉस्फेटिफलेरिन रूपों (34:0) का क्रोमोटोग्राम जिसमें 762.5294 का एक ही एम/जेड वैल्यू (एम-एच) है लेकिन 7.65 मिन और 8.49 मिन का अलग-अलग रिटेंशन टाइम है। लिपिड जंगली प्रकार तनाव BY4742 की कोशिकाओं से निकाले गए थे और एक रिवर्स चरण कॉलम CSH C18 पर तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा अलग किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: दो isomeric फॉस्फेटिफलेरिन प्रजातियों (34:0) का MS1 स्पेक्ट्रा जिसमें 762.5294 का एक ही एम/जेड वैल्यू (एम-एच) है लेकिन 7.65 मिन और 8.49 मिन का अलग-अलग प्रतिधारण समय है। लिपिड को जंगली प्रकार के तनाव BY4742 की कोशिकाओं से निकाला गया था, जो रिवर्स-चरण कॉलम सीएसएच C18 (जैसा कि चित्र ा 2में दिखाया गया है) पर तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा अलग किया गया था और नकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड का उपयोग करके बनाए गए माता-पिता (एमएस1) आयनों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया गया था। (क)762.5294 के एम/जेड वैल्यू (एम-एच) के साथ फॉस्फेटिलसेरीन फॉर्म (34:0) का एमएस1 स्पेक्ट्रम और 7.65 मिन का रिटेंशन टाइम।(ख)762.5294 के एम/जेड वैल्यू (एम-एच) के साथ फॉस्फेटिलसेरीन फॉर्म (34:0) का एमएस1 स्पेक्ट्रम और 8.49 मिन का रिटेंशन टाइम। कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: दो isomeric फॉस्फेटिलसेरीन प्रजातियों (34:0) का MS2 स्पेक्ट्रा जिसमें 762.5294 का एक ही एम/जेड वैल्यू (एम-एच) है लेकिन 7.65 मिन और 8.49 मिन का अलग-अलग प्रतिधारण समय है। लिपिड जंगली प्रकार तनाव BY4742 की कोशिकाओं से निकाले गए थे, जो रिवर्स-चरण कॉलम सीएसएच C18 (जैसा कि चित्र ा 2में दिखाया गया है) पर तरल क्रोमेटोग्राफी से अलग हो करते थे और एमएस 1 आयनों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जाता था (जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है)। इसके बाद सेकेंडरी आयनों (एमएस2) का पता मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा लगाया गया । (क)762.5294 के एम/जेड वैल्यू (एम-एच) के साथ फॉस्फेटिलसेरीन फॉर्म (34:0) का एमएस2 स्पेक्ट्रम और 7.65 मिन का रिटेंशन टाइम। सेरीन मोईटी के नुकसान ने 675.6149 के एम/जेड वैल्यू (एम-एच) के साथ आयन का उत्पादन किया। (ख)762.5294 के एम/जेड वैल्यू (एम-एच) के साथ फॉस्फेटिलसेरीन फॉर्म (34:0) का एमएस2 स्पेक्ट्रम और 8.49 मिन का रिटेंशन टाइम। सेरीन मोईटी के नुकसान ने 675.8843 के एम/जेड वैल्यू (एम-एच) के साथ आयन का उत्पादन किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डिटेक्शन मोड लिपिड क्लास हाइड्रोफोबिक टेल संरचना गणना मे/जेड मूल्य एकाग्रता (पीएमओएल/माइक्रोन)
नकारात्मक सेरामाइड 18:1_17:0 550.5204675 226
नकारात्मक कार्डियोलिपिन 14:0_14:0_14:0_14:0 1239.839755 196
नकारात्मक फ्री फैटी एसिड 19:0 297.2799035 837
नकारात्मक फॉस्फेटिटिलथेनॉमामाइन 15:0_15:0 662.4766305 377
नकारात्मक फॉस्फेटिग्लिसेरोल 15:0_15:0 693.4712115 349
नकारात्मक फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 17:0_20:4 871.5342065 3
नकारात्मक फॉस्फेटिडिलसेरिन 17:0_17:0 762.5290605 318
सकारात्मक फॉस्फेटिइलकोलिन 13:0_13:0 650.4755335 385
सकारात्मक फाइटोस्फिनोसिन 16:1 272.2584055 225
सकारात्मक ट्रायसिलग्लिसेरोल 28:1_10:1_10:1 818.7232155 367

तालिका 1: आंतरिक लिपिड मानकों के मिश्रण की संरचना। क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (2:1) मिश्रण में आंतरिक लिपिड मानक तैयार किए गए थे । डिटेक्शन मोड इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) आयन स्रोत से लैस ऑर्बिटरैप वेलोस मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके माता-पिता आयनों का पता लगाने के सकारात्मक या नकारात्मक मोड को संदर्भित करता है। गणना किए गए एम/जेड मान लिपिड के अभिडक्टों के लिए हैं।

एफटीएमएस + पी संकल्प 60000
मास रेंज (डाल्टन) 150-2000
आयन स्रोत प्रकार हेसी
केशिका तापमान (डिग्री सेल्सियस) 300
स्रोत हीटर तापमान (डिग्री सेल्सियस) 300
म्यान गैस प्रवाह 10
ऑक्स गैस प्रवाह 5
सकारात्मक ध्रुवता वोल्टेज (केवी) 3
नकारात्मक ध्रुवता वोल्टेज (केवी) 3
स्रोत वर्तमान (μA) 100

तालिका 2: ऑर्बिटरैप वेलोस मास स्पेक्ट्रोमीटर की सेटिंग्स का उपयोग लिपिड का विश्लेषण करने के लिए किया जाता था जो एलसी द्वारा अलग किए गए थे। संक्षिप्त: एफटीएमएस + पी = फोरियर ट्रांसफॉर्म-आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री ईएसआई (+) मोड में; हेसी = गर्म इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण।

साधन ध्रुवीकरण सकारात्मक नकारात्मक
एक्टिवेशन प्रकार उच्च ऊर्जा प्रेरित-टकराव-विसोशन टकराव से प्रेरित-विच्छेदन
न्यूनतम संकेत आवश्यक 5000 5000
अलगाव की चौड़ाई 2 2
सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा 55 35
डिफॉल्ट चार्ज राज्य 2 2
सक्रियण समय 0.1 10
एफटीएमएस + सी संकल्प 7500
5 सबसे तीव्र चोटियों एमएस के लिए चुना गया/

तालिका 3: ऑर्बिटरैप वेलोस मास स्पेक्ट्रोमीटर की सेटिंग्स माध्यमिक आयनों (MS2) का पता लगाने के लिए उपयोग की जाती हैं। संक्षिप्त: एफटीएमएस + सी = फोरियर ट्रांसफॉर्म-आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री ईएसआई (+) मोड में।

पहचान
डेटाबेस ऑर्बिटरैप
पीक डिटेक्शन आइसोटोप को याद करें (ऑन)
खोज विकल्प उत्पाद खोज ऑर्बिटरैप
खोज प्रकार उत्पाद
प्रयोग प्रकार एलसी-एमएस
अग्रदूत सहिष्णुता 10 पीपीएम
उत्पाद सहिष्णुता उच्च ऊर्जा प्रेरित-टकराव-विसोशन [ईएसआई (+) मोड]: 20 पीपीएम
टकराव-प्रेरित-विच्छेदन [ईएसआई (-) मोड]: 0.5 डाल्टन
क्वांटिथेशन
परिमाण पर अमल करें पर
मेसर्स टॉलरेंस -5.0; +5.0
सहिष्णुता प्रकार पीपीएम
फ़िल्टर
शीर्ष रैंक फिल्टर पर
मुख्य नोड फ़िल्टर मुख्य isomer चोटी
एम-स्कोर सीमा 5
सी-स्कोर सीमा 2
FFA प्राथमिकता पर
आईडी क्वालिटी फिल्टर A: लिपिड क्लास और सभी फैटी एसिड पूरी तरह से पहचाने जाते हैं
B: लिपिड वर्ग और कुछ फैटी एसिड की पहचान की जाती है
सी: लिपिड वर्ग या एफए की पहचान कर रहे है
डी: लिपिड अन्य टुकड़ा आयनों (H2O, आदि) द्वारा पहचाना जाता है
लिपिड क्लास
उच्च ऊर्जा प्रेरित-टकराव-विसोशन [ईएसआई (+) मोड] पीसी, टैग
टकराव-प्रेरित-विच्छेदन [ईएसआई (-) मोड] सीईआर, सीएल, एफएफए, पीई, पीजी, पीआई, पीएस
आयनों
उच्च ऊर्जा प्रेरित-टकराव-विसोशन [ईएसआई (+) मोड] + एच; + एनएच4; + ना
टकराव-प्रेरित-विच्छेदन [ईएसआई (-) मोड] - एच; - 2H; - एचसीओओ

तालिका 4: लिपिड पहचान सॉफ्टवेयर "लिपिड खोज" (V 4.1) की मदद से विभिन्न लिपिड कक्षाओं और प्रजातियों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले खोज पैरामीटर। संक्षिप्त रूप: CER = ceramide; सीएल = कार्डियोलिपिन; FFA = मुक्त (unesterified) फैटी एसिड; पीसी = फॉस्फेटिलकोलिन; पीई = फॉस्फेटिटिलथेनॉलामामाइन; पीजी = फॉस्फेटिग्लिग्लिसेरोल; पीआई = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरिन; टैग = ट्राइसिलग्लिसेरोल।

तालिका 5: विभिन्न लिपिड कक्षाओं की आणविक प्रजातियों की सबसे कम सांद्रता जिसे हमारे एलसी-एमएस/एमएस विधि की मदद से पहचाना और परिमाणित किया जा सकता है। प्रत्येक लिपिड वर्ग के लिए सबसे कम मात्रात्मक एकाग्रता का अनुमान एमएस पीक क्षेत्रों पर आधारित है इसके आंतरिक मानक (ये एमएस पीक क्षेत्रऔर लिपिड मानक सांद्रता बोल्ड में प्रदर्शित होती हैं) और इसके प्रतिनिधि आणविक रूप सबसे कम पता लगाने योग्य एकाग्रता पर मौजूद हैं। डेटा को दो स्वतंत्र प्रयोगों के औसत मूल्यों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृतियां की गई थीं। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

लिपिड मानक ईएसआई मोड Amf एएमएफ/एफए Amac आमसैक/एए AmAc/FA
पीएचसी - 74 75.2 85.8 77 74.8
Cl - 72.9 75.1 78.3 68.4 74
Ffa - 77.1 77.2 75.5 84 72.9
पीई - 98 96 95 91.5 86
स्नातकोत्तर - 64 45.1 75.9 60.5 55
Pi - 79.3 76 82.5 80.3 77
पुनश्च - 73.7 61.6 85.8 81.4 73.7
पीसी + 93.5 86.9 69.3 60.5 62.7
पीएचएस + 89.1 79.2 78.1 73.7 69.3
टैग + 92.4 88 86.9 80.3 84.7

तालिका 6: विभिन्न वर्गों के लिपिड के लिए आयनीकरण की क्षमता पर ईएसआई एमएस के लिए वैकल्पिक मोबाइल चरण योजक का प्रभाव। रिवर्स-फेज लिक्विड क्रोमेटोग्राफी द्वारा अलग-अलग लिपिड को एक-दूसरे से अलग किया गया। लिपिड के विभिन्न वर्गों से संबंधित वाणिज्यिक लिपिड मानकों का नाम तालिका 1में रखा गया है। विभिन्न मोबाइल चरण योजक ों की उपस्थिति में एमएस के लिए आयनीकरण के ईएसआई (-) या ईएसआई (+) मोड का उपयोग किया गया था। प्रत्येक लिपिड मानक के लिए आयनीकरण का प्रतिशत तीन तकनीकी प्रतिकृतियों से एक औसत मूल्य के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक लिपिड के लिए, आयनीकरण प्रतिशत की गणना एमएस पीक क्षेत्र के आधार पर की गई थी। प्रत्येक लिपिड के लिए उच्चतम आयनीकरण दक्षता का मूल्य बोल्ड में प्रदर्शित किया जाता है। संक्षिप्त: AmF = अमोनियम formate; AmF/एफए = अमोनियम formic एसिड के साथ formate; AmAc = अमोनियम एसीटेट; एएमएसी/एए = अमोनियम एसीटिक एसिड के साथ एसीटेट; AmAc/एफए = अमोनियम formic एसिड के साथ एसीटेट; सीएल = कार्डियोलिपिन; FFA = मुक्त (unesterified) फैटी एसिड; पीसी = फॉस्फेटिलकोलिन; पीई = फॉस्फेटिटिलथेनॉलामामाइन; पीजी = फॉस्फेटिग्लिग्लिसेरोल; पीएचसी = फाइटोसेरामाइड; PHS = फाइटोस्फिनेसिन; पीआई = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरिन; टैग = ट्राइसिलग्लिसेरोल।

लिपिड मानक ईएसआई मोड Amf Amac
पीएचसी - 75 83.8
Cl - 70.9 79.3
Ffa - 76.1 74.5
पीई - 98 95
स्नातकोत्तर - 64 75.9
Pi - 79.3 82.5
पुनश्च - 71.5 84.8
पीसी + 52.3 60.5
पीएचएस + 78.4 75.2
टैग + 65.7 69.7

तालिका 7: अग्रदूत आयनों (एमएस1) विखंडन की दक्षता पर टकराव-प्रेरित विच्छेदन (सीआईडी) विधि का प्रभाव। लिपिड के विभिन्न वर्गों से संबंधित वाणिज्यिक लिपिड मानकों का नाम तालिका 1में रखा गया है। आयनीकरण के ईएसआई (-) या ईएसआई (+) मोड का उपयोग एमएस के लिए अमोनियम फोर्ट (एएमएफ) या अमोनियम एसीटेट (एएमएसी) मोबाइल चरण योजक की उपस्थिति में किया गया था। MS1 लिपिड आयनों का प्रतिशत जो MS2 उत्पादों में खंडित थे, को तीन तकनीकी प्रतिकृतियों से एक औसत मूल्य के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक लिपिड के लिए, आयनीकरण प्रतिशत MS2 पीक क्षेत्र के आधार पर गणना की गई थी। एमएस1 लिपिड आयनों के उच्चतम प्रतिशत का मूल्य जो खंडित थे, प्रत्येक लिपिड के लिए बोल्ड में प्रदर्शित किया जाता है (तालिका 8में प्रस्तुत डेटा के साथ तुलना करें)। यदि एमएस 2 उत्पाद आयन गठन की दक्षता सबसे अधिक है तो यह मूल्य सबसे अधिक है। संक्षिप्त रूप: सीएल = कार्डियोलिपिन; FFA = मुक्त (unesterified) फैटी एसिड; पीसी = फॉस्फेटिलकोलिन; पीई = फॉस्फेटिटिलथेनॉलामामाइन; पीजी = फॉस्फेटिग्लिग्लिसेरोल; पीएचसी = फाइटोसेरामाइड; PHS = फाइटोस्फिनेसिन; पीआई = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरिन; टैग = ट्राइसिलग्लिसेरोल।

लिपिड मानक ईएसआई मोड Amf Amac
पीएचसी - 68.4 65.4
Cl - 74.3 75.2
Ffa - 84.2 81.2
पीई - 85.1 73.1
स्नातकोत्तर - 68.4 67.1
Pi - 58.7 55.8
पुनश्च - 67.4 68.5
पीसी + 92.5 65.3
पीएचएस + 87.1 75.1
टैग + 91.4 84.9

तालिका 8: अग्रदूत आयनों (एमएस1) विखंडन की दक्षता पर उच्च ऊर्जा टकराव विच्छेदन (एचसीडी) विधि का प्रभाव। लिपिड के विभिन्न वर्गों से संबंधित वाणिज्यिक लिपिड मानकों का नाम तालिका 1में रखा गया है। आयनीकरण के ईएसआई (-) या ईएसआई (+) मोड का उपयोग एमएस के लिए अमोनियम फोर्ट (एएमएफ) या अमोनियम एसीटेट (एएमएसी) मोबाइल चरण योजक की उपस्थिति में किया गया था। MS1 लिपिड आयनों का प्रतिशत जो MS2 उत्पादों में खंडित थे, को तीन तकनीकी प्रतिकृतियों से एक औसत मूल्य के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक लिपिड के लिए, आयनीकरण प्रतिशत MS2 पीक क्षेत्र के आधार पर गणना की गई थी। एमएस1 लिपिड आयनों के उच्चतम प्रतिशत का मूल्य जो खंडित थे, प्रत्येक लिपिड के लिए बोल्ड में प्रदर्शित किया जाता है (तालिका 7में प्रस्तुत डेटा के साथ तुलना करें)। यदि एमएस 2 उत्पाद आयन गठन की दक्षता सबसे अधिक है तो यह मूल्य सबसे अधिक है। अन्य संक्षिप्त नाम: सीएल = कार्डियोलिपिन; FFA = मुक्त (unesterified) फैटी एसिड; पीसी = फॉस्फेटिलकोलिन; पीई = फॉस्फेटिटिलथेनॉलामामाइन; पीजी = फॉस्फेटिग्लिग्लिसेरोल; पीएचसी = फाइटोसेरामाइड; PHS = फाइटोस्फिनेसिन; पीआई = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरिन; टैग = ट्राइसिलग्लिसेरोल।

पूरक तालिका 1: हमारे एलसी-एमएस/एमएस विधि की मदद से एस सेरेविस कोशिकाओं में पहचाने गए और निर्धारित किए गए 10 विभिन्न लिपिड वर्गों की आणविक प्रजातियों की सूची । इन लिपिड कक्षाओं में मुफ्त (अनस्टेरेफाइड) फैटी एसिड (एफएफए), कार्डियोलिपिन (सीएल), फाइटोसेरामाइड (पीएचसी), फाइटोस्फिओसिन (पीएचएस), फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी), शामिल थे। फॉस्फेटिटिलथेनॉलामामाइन (पीई), फॉस्फेटिडिलिग्लिसरोल (पीजी), फॉस्फेटिडिलिओसिटोल (पीआई), फॉस्फेटिटिलसेरीन (पीएस), और ट्रायसिलग्लिसेरोल (टैग)। एस cerevisiae कोशिकाओं सिंथेटिक ंयूनतम YNB माध्यम में शुरू में 2% ग्लूकोज युक्त सुसंस्कृत थे । लिपिड निष्कर्षण और एलसी-एमएस/निकाले गए लिपिड के एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए खमीर कोशिकाओं के Aliquots 1, 2, 3, 4, 6, 8, और 10 पुलिया के दिन बरामद किए गए । प्रत्येक लिपिड वर्ग की सभी लिपिड प्रजातियों को दिखाया गया है जिन्हें विभिन्न दिनों की खेती के विभिन्न दिनों में बरामद खमीर कोशिकाओं में पहचाना गया था। इन लिपिड प्रजातियों में से कुछ केवल कालक्रम युवा खमीर कोशिकाओं में मौजूद थे 1-4 संस्कृति के दिनों में बरामद, दूसरों को केवल कालक्रम में पुराने खमीर कोशिकाओं को केवल 6-10 के दिनों में बरामद किया, जबकि कुछ कालक्रम युवा और पुराने खमीर कोशिकाओं दोनों में मौजूद थे । प्रत्येक लिपिड वर्ग की प्रत्येक लिपिड प्रजातियों के लिए उच्चतम एमएस पीक क्षेत्र को एक निश्चित दिन पर पहचाना जाता है। इस लिपिड वर्ग के भीतर अन्य प्रजातियों की मात्रा के लिए उपयोग की जाने वाली विभिन्न लिपिड कक्षाओं के लिपिड मानक लाल रंग में प्रदर्शित किए जाते हैं। गणना किए गए एम/जेड मान लिपिड के अभिडक्टों के लिए हैं। संक्षिप्त नाम: ईएसआई (-) = ईएसआई (-) एमएस का मोड; ईएसआई (+) = एमएस डेटा के ईएसआई (+) मोड को दो स्वतंत्र प्रयोगों के औसत मूल्यों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृतियां की गई थीं। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

निम्नलिखित सावधानियां यहां वर्णित प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण हैं:

1. क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल विषाक्त होते हैं। वे कुशलता पूर्वक सतहों से विभिन्न पदार्थों को निकालते हैं, जिसमें प्रयोगशाला प्लास्टिकवेयर और आपकी त्वचा शामिल हैं। इसलिए, इन कार्बनिक सॉल्वैंट्स को सावधानी के साथ संभालें, जिनमें क्लोरोफॉर्म और/या मेथनॉल के साथ संपर्क शामिल है, इन चरणों के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करना और उपयोग से पहले क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के साथ इन पाइपेट को खंगालना ।

2. मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म (17:1) मिश्रण द्वारा लिपिड निष्कर्षण के दौरान, कम कार्बनिक चरण (~ 400 माइक्रोन) को 15 मीटर उच्च शक्ति वाले ग्लास स्क्रू टॉप सेंट्रलाइज ट्यूब को पॉलीटेट्राफ्लोरोथिलीन लाइन कैप के साथ स्थानांतरित करने के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करें। इस तरह के हस्तांतरण के दौरान कांच के मोतियों या ऊपरी जलीय चरण को बाधित न करें। नाइट्रोजन गैस के प्रवाह के तहत कम कार्बनिक चरण रखें।

3. एलसी-एमएस/एमएस के लिए नमूना तैयार करने के दौरान, शीशियों को वेलप्लेट में डालने से पहले कांच की शीशियों में सभी हवा के बुलबुले को खत्म करना महत्वपूर्ण है।

4. एलसी द्वारा लिपिड पृथक्करण से पहले मोबाइल चरणों ए और बी में अमोनियम फोरमेट और अमोनियम एसीटेट के पूर्ण घुलना प्राप्त करने के लिए, मोबाइल चरण के साथ समाधान को मिलाने और 20 मिन के लिए सोनिकिंग करने से पहले नैनो-शुद्ध पानी के 500 माइक्रोन में प्रत्येक नमक को भंग करें।

5. चलने से पहले लंबे समय तक सॉल्वेंट वाष्पीकरण के बाद बनने वाली लिपिड फिल्म को स्टोर न करें। हम इस फिल्म को एसीटोनिट्रिल/2-प्रोपेनॉल/नैनो-प्योर वॉटर (65:35:5) मिश्रण में घुलने से पहले एक सप्ताह से अधिक समय तक-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करते हैं और फिर लिपिड को एलसी-एमएस/एमएस के अधीन करते हैं ।

यहां वर्णित एलसी-एमएस/एमएस विधि कई लिपिड प्रजातियों के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील तकनीक है जिसमें खमीर या किसी अन्य यूकेरियोटिक जीव के सेलुलर लिपिडोम शामिल हैं । विधि विभिन्न आइसोबेरिक या इसोमरिक लिपिड प्रजातियों की पहचान और मात्राकरण को सक्षम बनाती है, लिपिड आयनीकरण को बढ़ावा देने और लिपिड पहचान और मात्राकरण को अधिक कुशल बनाने के लिए ईएसआई एमएस के लिए वैकल्पिक मोबाइल चरण योजक का उपयोग करने की अनुमति देती है, और एमएस 1 लिपिड आयनों के विखंडन या सक्रियण के लिए एचसीडी और सीआईडी दोनों तरीकों का उपयोग कर सकती है।

हम नवोदित खमीर एस cerevisieके कालक्रम उम्र बढ़ने के दौरान सेलुलर और ऑर्गेनेलर लिपिडोम्स में उम्र से संबंधित परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इस एलसी-एमएस/एमएस विधि का उपयोग करते हैं । हम इस विधि को यह जांचने के लिए भी नियोजित करते हैं कि कितने उम्र बढ़ने में देरी करने वाले आनुवंशिक, आहार और औषधीय हस्तक्षेप पूरे एस सेरेविसिया सेल और इसके विभिन्न ऑर्गेनेल्स की लिपिड संरचना को प्रभावित करते हैं। अपनी बहुमुखी प्रतिभा, मजबूती और संवेदनशीलता के कारण, इस एलसी-एमएस/एमएस विधि का सफलतापूर्वक फायला भर में यूकेरियोटिक जीवों में सेलुलर और ऑर्गेनेलर लिपिडोम्स के मात्रात्मक आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम चर्चाओं के लिए टिटोर्को प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों के आभारी हैं । हम उत्कृष्ट सेवाओं के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के जैविक अनुप्रयोगों और सेंटर फॉर स्ट्रक्चरल एंड फंक्शनल जीनोमिक्स (कॉनकोर्डिया विश्वविद्यालय में दोनों) को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (आरजीपिन 2014-04482) और कॉनकोर्डिया विश्वविद्यालय चेयर फंड (CC0113) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । केएम को कॉनकोर्डिया यूनिवर्सिटी मेरिट अवार्ड का समर्थन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
2-Propanol Fisher Scientific A461-500
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Agilent1100 Wellplate Agilent Technologies G1367A
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Ammonium formate Fisher Scientific A11550
Ammonium hydroxide Fisher Scientific A470-250
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Ceramide Avanti Polar Lipids 860517
Chloroform Fisher Scientific C297-4
CSH C18 VanGuard Waters 186006944 Pre-column system
Free fatty acid (19:0) Matreya 1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) Sigma-Aldrich G8772
Glucose Fisher Scientific D16-10
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
L-histidine Sigma H8125
Lipid Search software (V4.1) Fisher Scientific V4.1 LC-MS/MS analysis software
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850340
Phosphatidylethanolamine Avanti Polar Lipids 850704
Phosphatidylglycerol Avanti Polar Lipids 840446
Phosphatidylinositol Avanti Polar Lipids LM1502
Phosphatidylserine Avanti Polar Lipids 840028
Reverse-phase column CSH C18 Waters 186006102
Sphingosine Avanti Polar Lipids 860669
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Tricylglycerol Larodan, Malmo TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Uracil Sigma U0750
Vortex Fisher Scientific 2215365
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids Fisher Scientific DF0919-15-3
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 157 लिपिड सेलुलर लिपिडोम अनस्टेरेफाइड (फ्री) फैटी एसिड ग्लाइफोफोस्फोलिपिड न्यूट्रल लिपिड स्फिंगोलिपिड्स सेरामाइड कार्डियोलिपिन लिपिड एक्सट्रैक्शन लिपिडोमिक्स लिक्विड क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री
<em>सचारोमाइसेस सेरेविसी</em> के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके
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Mohammad, K., Jiang, H., Hossain, M. I., Titorenko, V. I. Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60616, doi:10.3791/60616 (2020).

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