Summary
我们提出一个协议，使用液体色谱结合串联质谱法识别和量化主要细胞脂在糖体质酶。所述的酵母细胞内主要脂质类定量评估的方法用途广泛、健壮且敏感。
Abstract
脂质是结构上多样化的两栖分子，不溶于水。脂质是生物膜、能量储存和生产、细胞信号、蛋白质的血管传输、细胞生成和调节细胞死亡的组织和功能的基本贡献者。由于萌芽的酵母糖精，是一种单细胞真核二代，可接受彻底的分子分析，它作为模型有机体的使用有助于揭示脂质代谢和细胞内迁移与真核细胞中复杂的生物过程之间的联系。提供多种分析方法，对酵母细胞内的主要类脂质进行可靠、敏感和准确的定量评估，对于深入了解这些机制至关重要。在这里，我们提出了一个协议，使用液体色谱结合串联质谱（LC-MS/MS）定量分析S.cerevisiae的主要细胞脂质。所述 LC-MS/MS 方法用途广泛且坚固。它能够识别和定量10种脂质中每个物种（包括不同的等体或异质体形式）。该方法很灵敏，允许一些脂质物种在浓度低至0.2pmol/μL的浓度下进行识别和定量。该方法已成功应用于评估全酵母细胞及其纯化细胞体的脂质。该方法采用替代移动相添加剂进行电镀电质谱，可提高部分脂质品种的电理化效率，从而改善其识别和定量。
Introduction
大量证据表明，脂质是生物分子的主要类别之一，在真核细胞的许多重要过程中起着至关重要的作用。这些过程包括组装构成细胞细胞器周围的血浆膜和膜的脂质双层物，在细胞膜之间传输小分子，对细胞外环境变化和细胞内信号转导的反应，能量的产生和储存，限制于不同细胞器的蛋白质的进出口，内膜系统和蛋白质分泌中蛋白质的静脉贩运，以及几种调节细胞死亡模式1 ，2，3，4，5，6，7，8，9，10.
萌芽酵母S.cerevisiae，一个单细胞真核生物，已经成功地揭示了一些机制，脂质在这些重要的细胞过程4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15的基本作用，16，17，18，19，20.S. cerevisiae是发现这些机制的宝贵模型有机体，因为它适用于全面的生化、遗传、细胞生物学、化学生物学、系统生物学和微流体解剖分析21、22、23、24、25。脂质代谢和细胞内迁移有助于这些重要细胞过程的相互理解机制的进一步进展，需要敏感的质谱技术，用于细胞脂质的定量表征，了解脂质分子的复杂性，并将定量脂质学整合到系统生物学1、2、3、26的多学科平台中， 27、28、29、30。
目前酵母细胞和其他真核生物细胞的质谱辅助定量脂质学方法不够通用、健壮或敏感。此外，这些目前使用的方法无法区分各种等baric或等质脂质物种。在这里，我们描述了一种多功能、健壮和灵敏的方法，它允许使用液体色谱法与串联质谱（LC-MS/MS）进行定量分析S.cerevisiae的主要细胞脂质。
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Protocol
1. 培养酵母的无菌介质的准备
- 制备含有1%（v/v）酵母提取物和2%（v）百能蛋白的完整YP介质的90 mL。
- 制备90 mL的合成最小YNB介质，含有0.67%（w/v）酵母氮碱，不含氨基酸，20毫克/L L-西丁，30毫克/L-柳氨酸，30毫克/L-赖氨酸，和20毫克/L尿素。
- 将 90 mL 的完整 YP 介质平均分成两个 250 mL Erlenmeyer 烧瓶（即每个 45 mL）。
- 将 90 mL 的合成最小 YNB 介质分成两个 250 mL Erlenmeyer 烧瓶（即每个 45 mL）。
- 使用前45分钟，在15 psi/121 °C下用YP和YNB介质对烧瓶进行高压灭菌45分钟。
2. 酵母菌株
- 使用野生类型应变BY4742（MAT_他的3+1 leu2+0 lys2+0 ura3+0）。
3. 在具有葡萄糖的完整YP介质中培养酵母
- 在使用前45分钟，在15 psi/121 °C下高压灭菌20%（w/v）的葡萄糖库存溶液。
- 将含有无菌YP介质的两个Erlenmeyer烧瓶中各加入5 mL的无菌20%（w/v）葡萄糖库存溶液，最终浓度为2%葡萄糖（w/v）。
- 使用微生物循环将野生型菌株BY4742的细胞接种到两个含有葡萄糖的YP介质的Erlenmeyer烧瓶中。
- 在30°C下培养细胞过夜，在200 rpm时旋转摇动。
- 以酵母文化为例。使用血细胞计确定每 mL 培养的酵母细胞总数。
4. 将酵母转移到合成最小YNB介质中，用葡萄糖培养酵母
- 将含有无菌YNB介质的两个Erlenmeyer烧瓶中各加入5 mL的无菌20%（w/v）葡萄糖库存溶液，最终浓度为2%葡萄糖（w/v）。
- 使用无菌移液器将含有5.0 x 107细胞的过夜酵母培养液的体积转移到含有含葡萄糖的YNB介质的两个Erlenmeyer烧瓶中。
- 在30°C下，在30°C下将细胞培养至少24小时（或以上），并在200 rpm时旋转摇动。
5. 制备试剂、实验室用具和脂质提取设备
- 准备以下内容： 1） 高等级 （>99.9%）氯仿;2） 高等级 （>99.9%）甲醇;3） 28%（v/v）氢氧化铵溶液在纳米纯水中;4） 玻璃珠（酸洗，425-600 μM）;5） 具有适当适配器的涡旋;6） 15 mL高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯内衬盖;7） 17：1和2：1氯仿和甲醇混合物;8） 氯仿/甲醇（2：1）混合物，氢氧化铵（v/v）;9） ABC溶液（155 mM碳酸氢铵，pH = 8.0）;10）表1所示，在2：1氯仿和甲醇混合物中制备的内部脂质标准的混合物;和 11） 2 mL 玻璃样品小瓶与聚四氟乙烯内衬盖提取细胞脂质。
6. 制备LC的试剂、实验室用品和设备
- 准备以下： 1） 醋酸/2丙醇/纳米纯水 （65：35：5） 混合物;2） 具有适当适配器的涡旋;3） 超声波声波器;4） 玻璃小瓶，带孔板的刀片;5） 配备二进制泵、脱气器和自动取样器的 LC 系统;6）C18反向相柱（2.1毫米;75毫米;孔径130°;pH范围1-11）耦合到预柱系统;7） 混合物 A：醋酸酯/水 （60：40）;和8）混合物B：异丙醇/乙酰甲酸酯（90：10）。
7. 从酵母细胞中提取脂质
- 以酵母文化为例。使用血细胞计或测量OD600来确定每mL培养的酵母细胞总数。
- 以含有5.0 x 107个细胞（3.3个单位OD600）的酵母培养量为例。将这种培养量放入预冷的 1.5 mL 微离心管中。
- 在16，000 x g的离心下收获细胞，在4°C下1分钟。丢弃上清剂。
- 加入1.5mL的冰冷纳米纯水，在4°C下以16，000 x g的离心洗涤细胞1分钟。丢弃上清剂。
- 加入1.5 mL的冷ABC溶液，在4°C下以16，000 x g的离心洗涤细胞1分钟。丢弃上清剂。在提取脂质之前，细胞颗粒可以储存在-80°C。
- 要开始提取脂质，解冻冰上的细胞颗粒。
- 在200μL的冰冷的纳米纯水中重新悬浮细胞颗粒。将电池悬浮液转移到带多氟乙烯内衬盖的 15 mL 高强度玻璃螺钉顶部离心管。加入以下本管：1）25 μL的混合物内脂标准制备在氯仿/甲醇（2：1）混合物;2） 100 μL 的 425-600 μM 酸洗玻璃珠;和 3） 600 μL 的氯仿/甲醇 （17：1） 混合物。
- 在室温 （RT） 下高速涡旋管 5 分钟以干扰细胞。
- 在RT时以低速涡旋管1小时，以方便提取脂质。
- 在冰上孵化样品15分钟，促进蛋白质沉淀和水相和有机相的分离。
- 在 RT 时，将管子在临床离心机中以 3，000 x g的 5 分钟离心。这种离心步骤允许将上水相与包含所有脂质的有机相分离。
- 使用硼硅酸盐玻璃移液器将较低的有机相 （+400 μL） 转移到另一个 15 mL 高强度玻璃螺杆顶部离心管，带聚四氟乙烯内衬盖。在此类转移过程中，请勿干扰玻璃珠或上水相。在氮气流动下保持较低的有机相。
- 在剩余的上水相中加入300μL的氯仿甲醇（2：1）混合物，使狮蛋白脂和PA、PS、PI和CL.Vortex在RT时大力抽取5分钟。
- 在 RT 时，将管子在临床离心机中以 3，000 x g的 5 分钟离心。
- 使用硼硅酸盐玻璃移液器将离心后形成的较低有机相位（± 200 μL）转移到步骤 7.13 中收集的有机相。
- 使用氮气流动在组合有机相中蒸发溶剂。在氮气流动下关闭含有脂质膜的管。将这些管存放在-80°C。
8. 通过LC分离提取的脂质
- 将500μL的醋酸酯/2-丙醇/纳米纯水（65：35：5）混合物加入含有步骤7.16中获得的脂质膜的管子中。在 RT 时将管子 3x 旋转 10 s。
- 将管的内容置于超声波声波15分钟。 Vortex 在 RT 处将管子 3x 3x 10 秒。
- 从管子中取出100 μL的样品，然后将其添加到玻璃瓶中，并带有用于孔板的刀片。在将插入物加入井板之前，消除刀片中的气泡。
- 使用LC系统将反向相C18列CSH上的不同脂质物种分离到前柱系统（参见材料表）。在分离过程中，将柱保持在55°C，流速为0.3 mL/min。将样品保持在RT的孔板中。
- 使用由混合物A（乙酰三醇/水[60：40（v/v）]和混合物B（异丙醇/乙酰二醇[90：10（v/v）]组成的移动相。对于使用电喷电离子源创建的母离子检测的正模式，ESI （+） 模式、移动相 A 和 B 包含最终浓度为 10 mM 的铵甲酸酯。对于父离子检测的负模式，ESI （-） 模式、移动相 A 和 B 在最终浓度为 10 mM 时包含醋酸铵。
- 将样品体积为 10 μL 以喷射到 ESI （+） 和 ESI （-） 模式。
- 使用以下LC梯度通过LC分离不同的脂质物种：0-1分10%（B相）;1-4分钟60%（B阶段）;4-10分钟 68%（B阶段）;10-21 97%（B阶段）;21-24分钟97%（阶段B）;24-33 分钟 10%（阶段 B）。
- 将提取空白作为第一个样本，每四个样本之间，作为最后一个样本运行。减去背景以规范化数据。
- 图1显示了从野生类型菌株BY4742细胞中提取的脂质LC/MS数据中具有代表性的总电离色谱图。
9. 按LC分离的脂质的质谱分析
- 使用配备 HESI（加热电喷涂电电）电仪源的质谱仪来分析由 LC 分离的脂质。使用表 2中提供的设置。
- 使用 Fourier 变换分析仪以 60，000 的分辨率和 150-2，000 Da 的质量范围内检测母离子 （MS1）。
- 使用表 3中提供的设置检测次离子 （MS2）。
10. 通过处理LC-MS/MS的原始数据，确定和定量不同的脂质类别和物种
- 请参阅材料表，了解软件，以便从原始 LC-MS/MS 文件中检测和定量不同脂质。该软件使用最大的脂质数据库，包含超过150万脂质离子前体（MS1）及其预测的片段离子（MS2）。该软件还使用MS1峰进行脂质定量和MS2进行脂质识别。图2、图3和图4分别显示了两种异感磷脂酰丝氨酸形式（34：0）的代表色谱图，这些色谱具有相同的m/z值，但保留时间不同，并且它们的MS1和MS2光谱。
- 搜索LC-MS原始文件包含全扫描MS1数据和数据依赖MS2数据免费（未酯化）脂肪酸（FFA），心利平（CL），植物酰胺（PHC），植物人素（PHS），磷脂酰胆碱（PC），磷脂 l乙醇胺（PE）、磷脂乙二醇（PG）、磷脂酰胺醇（PI）、磷脂酰乙酰乙酰胺（PS）和三乙二甘二醇（TAG）脂质类，前体离子的m/z公差为5ppm，产品离子为10 ppm。其他搜索参数显示在表 4中。按照软件用户手册中提供的说明进行操作。需要手动验证内部脂质标准和具有异常脂肪酸成分的脂质成分的特性。
- 要识别和量化不同的脂质类别和物种，借助脂质搜索软件的免费开源替代品，请使用脂质数据分析器（http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml）、MZmine2（http://mzmine.github.io/）或XCMS（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html）软件处理来自LC-MS/MS的原始数据。
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Representative Results
在LC-MS/MS的帮助下，我们定量评估酵母细胞内主要细胞脂质的方法是多功能和稳健的。它使我们能够识别和量化10个不同的脂质类在S.cerevisae细胞培养在合成最小YNB培养最初含有2%葡萄糖。这些脂质类包括自由（未酯）脂肪酸（FFA）、CL、植物酰胺（PHC）、植物蛋白酶（PHS）、PC、PE、PG、PI、PS和TAG（补充表1）。使用这种LC-MS/MS方法（补充表1），确定和量化了这些类别的许多分子物种。
我们的LC-MS/MS方法也很敏感。事实上，它使浓度低至0.165pmol/μL的脂质分子物种得以识别和定量（见表5中植物酰胺的数据）。这种定量极限因浓度范围之大的不同脂质类别而异（表5）。
重要的是，我们的方法允许识别和定量不同的等baric或异质体形式的脂质。脂质的等体形式是具有相同名义质量的脂质物种（即最丰富的同位素质量的总和），但不同的确切质量31。微微状的脂质是具有相同分子公式但具有不同化学结构的脂质物种31。例如，使用我们的LC-MS/MS方法区分PHC（16：0~26：0）和等baric脂质质质（16：0=10：0）：虽然它们的名义质量值为650，但它们的确切质量分别为650.6457和650.4755。此外，这种LC-MS/MS方法区分了两对具有相同分子配方但不同化学结构的异构脂质：1） PC （18：0_18：1） 和 PC （20：0_16：1），分子公式 （C44H87N1O8P1） 和精确质量 （788.6163）;和 2） PE （16：0×16：0） 和 PE （14：0×18：0），采用分子公式 （C37H75N1O8P1） 和精确质量 （692.5224）。
我们的LC-MS/MS方法可用于提高所有类别的脂质电感效率，从而改善主要细胞脂的识别和定量。这种改进可以通过为ESI MS使用替代移动相位添加剂来实现（表6）。这些替代相包括mate铵、带甲酸的铵、醋酸铵、醋酸铵和醋酸铵。这些替代移动相添加剂中的每一个都可用于普通相和反向相 LC 列（表 6）。
我们的LC-MS/MS方法的另一个优点是能够使用两种不同的方法将前体离子（MS1）的脂质分成MS2产品。这两种方法是高能碰撞分离（HCD）和碰撞引起的分离（CID）32。我们发现，CID方法与MSESI（-）模式的醋酸铵移动相添加剂结合使用是有益的，因为这些条件下，它允许提高MS1脂离子碎片到MS2产品的效率，用于PHC、CL、FFA、PE、PG、PI和PS（表7）。相反，如果HCD方法与MSESI（+）模式的铵为配合移动相添加剂结合使用，则很有利，因为这些条件下，它提高了MS1脂离子碎片到PC、PHS和TAG的MS2产品的效率（表8）。
图1：从野生型菌株BY4742的细胞中提取的液色谱/质谱（LC/MS）脂质数据中产生的总电离色色谱图（TIC）。在反向相柱CSH C18上由LC分离的脂质的TIC，由使用负电喷雾电解模式创建的母离子MS检测。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：两种异感磷脂酰丝氨酸形式的色谱图（34：0），其 m/z 值 （M-H） 为 762.5294，但不同的保留时间为 7.65 分钟和 8.49 分钟。脂质从野生型菌株BY4742的细胞中提取，并通过在反向相柱CSH C18上通过液相色谱分离。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：两种异感磷脂酰丝氨酸物种（34：0）的MS1光谱，其 m/z 值 （M-H） 为 762.5294，但不同的保留时间为 7.65 分钟和 8.49 分钟。脂质从野生型菌株BY4742的细胞中提取，通过反向相柱CSH C18的液体色谱分离（如图2所示），并通过使用负电喷雾电离模式创建的父离子（MS1）的质谱检测。（A） 磷脂酰丝氨酸形式的 MS1 频谱 （34：0），m/z 值 （M-H） 为 762.5294，保留时间为 7.65 分钟。 （B） 磷脂酰丝氨酸形式的 MS1 频谱 （34：0）， m/z 值 （M-H） 为 762.5294，保留时间为 8.49 分钟。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：两种异感磷脂酰丝氨酸物种（34：0）的MS2光谱，其 m/z 值 （M-H） 为 762.5294，但不同的保留时间为 7.65 分钟和 8.49 分钟。脂质从野生型菌株BY4742的细胞中提取，通过反向相位CSH C18的液体色谱分离（如图2所示），并通过MS1离子的质谱检测（如图3所示）。然后通过质谱检测二次离子（MS2）。（A） 磷脂酰丝氨酸形式的 MS2 频谱 （34：0），m/z 值 （M-H） 为 762.5294，保留时间为 7.65 分钟。丝氨酸摩尔蒂的丢失产生了 m/z 值 （M-H） 为 675.6149 的 ion。（B） 磷脂酰丝氨酸形式的 MS2 频谱 （34：0），m/z 值 （M-H） 为 762.5294，保留时间为 8.49 分钟。丝氨酸摩尔蒂的丢失产生了 m/z 值 （M-H） 为 675.8843 的 ion。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 检测模式 | 脂质类 | 疏水尾组成 | 计算的 m/z 值 | 浓度（pmoles/μl） |
| 负 | 神经 酰 胺 | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| 负 | 心利平 | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| 负 | 游离脂肪酸 | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| 负 | 磷脂酰胺 | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| 负 | 磷脂甘油 | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| 负 | 肌 醇 | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| 负 | 磷脂酰塞林 | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| 积极 | 磷脂 酰 胆碱 | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| 积极 | 植物肽 | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| 积极 | 三甘油 | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
表1：内部脂质标准混合物的组成。内部脂质标准以氯仿/甲醇（2：1）混合物制备。检测模式是指使用配备电喷电离子源（ESI）离子源的轨道Rap Velos质谱仪检测的正或负母离子检测模式。计算出的 m/z 值用于脂质的附着。
| FTMS = p 分辨率 | 60000 |
| 质量范围（道尔顿） | 150-2000 |
| Ion 源类型 | 赫西 |
| 毛细管温度 （°C） | 300 |
| 源加热器温度 （°C） | 300 |
| 护套气体流量 | 10 |
| 辅助气体流量 | 5 |
| 正极性电压 （kV） | 3 |
| 负极性电压 （kV） | 3 |
| 源电流 （μA） | 100 |
表2：轨道轨道Velos质谱仪用于分析由LC分离的脂质的设置。缩写：FTMS = p = 在 ESI （+） 模式下基于傅立叶变换的质谱;HESI = 加热电喷涂电电化。
| 仪器极性 | 积极 | 负 |
| 激活类型 | 高能引起的碰撞-分离 | 碰撞引起的分离 |
| 所需的最小信号 | 5000 | 5000 |
| 隔离宽度 | 2 | 2 |
| 标准化碰撞能量 | 55 | 35 |
| 默认充电状态 | 2 | 2 |
| 激活时间 | 0.1 | 10 |
| FTMS = C 分辨率 | 7500 | |
| 为 ms/ms 选择了 5 个最强烈的峰值 |
表3：轨道轨道Velos质谱仪用于检测继离子（MS2）的设置。缩写：FTMS = C = 在 ESI （+） 模式下基于傅立叶变换的质谱仪。
| 识别 | |
| 数据库 | 轨道 |
| 峰值检测 | 召回同位素（ON） |
| 搜索选项 | 产品搜索轨道 |
| 搜索类型 | 产品 |
| 实验类型 | LC-MS |
| 前体公差 | 10 ppm |
| 产品耐受性 | 高能量诱导碰撞-分离 [ESI （+） 模式]：20 ppm |
| 碰撞引起的分离 [ESI （-） 模式]： 0.5 道尔顿 | |
| 定量 | |
| 执行量化 | 上 |
| m/z 公差 | -5.0;¥5.0 |
| 容差类型 | Ppm |
| 滤波器 | |
| 排名靠前的筛选器 | 上 |
| 主节点筛选器 | 主等体峰值 |
| m-分数阈值 | 5 |
| c-分数阈值 | 2 |
| FFA优先事项 | 上 |
| ID 质量过滤器 | 答：脂质类和所有脂肪酸均被完全识别 |
| B：确定脂质类和一些脂肪酸 | |
| C： 确定脂质等级或 FA | |
| D：由其他碎片离子（H2O等）识别的脂质 | |
| 脂质类 | |
| 高能量引起的碰撞-分离 [ESI （+） 模式] | 电脑， 标签 |
| 碰撞引起的分离 [ESI （-） 模式] | CER， CL， FFA， PE， PG， PI， PS |
| 离子 | |
| 高能量引起的碰撞-分离 [ESI （+） 模式] | • H;• NH4;• 纳 |
| 碰撞引起的分离 [ESI （-） 模式] | - H;- 2H;- HCOO |
表4：利用脂质识别软件"脂质搜索"（V 4.1）识别不同脂质类别和物种的搜索参数。缩写：CER = 神经酰胺;CL = 心脂;FFA = 自由（未酯化）脂肪酸;PC = 磷脂酰胆碱;PE = 磷脂乙醇胺;PG = 磷脂甘油;PI = 磷脂酰林醇;PS = 磷脂酰塞林;TAG = 三甘油。
表5：利用我们的LC-MS/MS方法，可以识别和定量的不同脂质类分子物种的最低浓度。每个脂质类别的最低可量化浓度的估计值基于 MS 峰值区域的内部标准（这些 MS 峰区和脂质标准浓度以粗体显示），其代表性的分子形式以最低可检测浓度存在。数据作为两个独立实验的平均值呈现，每个实验都执行了三个技术复制。请点击此处查看此表（右键单击以下载）。
| 脂质标准 | ESI 模式 | Amf | AmF/FA | AmAc | AmAc/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| 体育 | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| 小 灵通 | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| 标记 | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
表6：ESI MS的替代移动相添加剂对不同类别脂质电化效率的影响。通过反向相液色谱法分离不同的脂质。属于不同类别脂质的商业脂质标准在表1中命名。ESI （-） 或 ESI （+） 电化模式用于 MS，存在不同的移动相添加剂。每个脂质标准的电离百分比显示为三个技术复制的平均值。对于每个脂质，电化百分比根据MS峰值区域计算。每个脂质的最高电化效率值以粗体显示。缩写：AmF = 铵用;AmF/FA = 带甲酸的铵;AmAc = 醋酸铵;AmAc/AA = 醋酸铵;AmAc/FA = 醋酸铵;CL = 心脂;FFA = 自由（未酯化）脂肪酸;PC = 磷脂酰胆碱;PE = 磷脂乙醇胺;PG = 磷脂甘油;PHC = 植物酰胺;PHS = 植物肽;PI = 磷脂酰林醇;PS = 磷脂酰塞林;TAG = 三甘油。
| 脂质标准 | ESI 模式 | Amf | AmAc |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| 体育 | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| 小 灵通 | + | 78.4 | 75.2 |
| 标记 | + | 65.7 | 69.7 |
表7：碰撞引起的分离（CID）方法对前体离子（MS1）碎片效率的影响。属于不同类别脂质的商业脂质标准在表1中命名。ESI （-） 或 ESI （+） 电化模式用于 MS，存在铵甲酸酯 （AmF） 或醋酸铵 （AmAc） 移动相添加剂。被分割成MS2产品的MS1脂质离子的百分比显示为三种技术复制的平均值。对于每个脂质，电化百分比根据MS2峰区计算。每个脂质以粗体显示 MS1 脂质离子的最高百分比值（与表 8中提供的数据相比）。如果 MS2 产品 ion 形成的效率最高，则此值最高。缩写： CL = 心脂;FFA = 自由（未酯化）脂肪酸;PC = 磷脂酰胆碱;PE = 磷脂乙醇胺;PG = 磷脂甘油;PHC = 植物酰胺;PHS = 植物肽;PI = 磷脂酰林醇;PS = 磷脂酰塞林;TAG = 三甘油。
| 脂质标准 | ESI 模式 | Amf | AmAc |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| 体育 | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| 小 灵通 | + | 87.1 | 75.1 |
| 标记 | + | 91.4 | 84.9 |
表8：高能碰撞分离（HCD）方法对前体离子（MS1）碎片效率的影响。属于不同类别脂质的商业脂质标准在表1中命名。ESI （-） 或 ESI （+） 电化模式用于 MS，存在铵甲酸酯 （AmF） 或醋酸铵 （AmAc） 移动相添加剂。被分割成MS2产品的MS1脂质离子的百分比显示为三种技术复制的平均值。对于每个脂质，电化百分比根据MS2峰区计算。每个脂质以粗体显示 MS1 脂质离子的最高百分比值（与表 7中提供的数据相比）。如果 MS2 产品 ion 形成的效率最高，则此值最高。其他缩写： CL = 心脂;FFA = 自由（未酯化）脂肪酸;PC = 磷脂酰胆碱;PE = 磷脂乙醇胺;PG = 磷脂甘油;PHC = 植物酰胺;PHS = 植物肽;PI = 磷脂酰林醇;PS = 磷脂酰塞林;TAG = 三甘油。
补充表1：在我们的LC-MS/MS方法的帮助下，在S.cerevisie细胞中确定和定量的10个不同脂质类的分子物种列表。这些脂质类包括自由（未酯）脂肪酸（FFA）、心利平（CL）、植物酰胺（PHC）、植物人平肽（PHS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷酸 苯乙酰甲酰胺（PE）、磷脂乙酰乙酰乙酰乙酰二醇（PG）、磷脂酰胺醇（PI）、磷脂酰乙酰胺（PS）和三乙二甘二醇（TAG）。S. cerevisiae细胞在最初含有2%葡萄糖的合成最小YNB介质中培养。酵母细胞的脂肪提取和提取脂质的LC-MS/MS分析在培养的第1天、2天、3天、第4天、第6天、第8天和10天被回收。显示了在不同培养日恢复的酵母细胞中确定的每个脂质类的所有脂质物种。其中一些脂质物种只存在于在培养第1-4天恢复的按时间顺序排列的年轻酵母细胞中，另一些只存在于在6-10天恢复的按时间顺序发现的酵母细胞中，而有些则存在于按时间顺序排列的幼叶细胞和老年酵母细胞中。显示了在培养某一天确定的每个脂质类别的最高MS峰区。用于定量此脂质类中其他物种的不同脂质等级的脂质标准以红色显示。计算出的 m/z 值用于脂质的附着。缩写：ESI （-） = MS 的 ESI （-） 模式;ESI （+） = MS 数据的 ESI （+） 模式作为两个独立实验的平均值呈现，每个实验都执行了三个技术复制。请点击此处查看此表（右键单击以下载）。
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Discussion
以下预防措施对于成功实施此处介绍的协议非常重要：
1. 氯仿和甲醇是有毒的。它们有效地从表面提取各种物质，包括实验室塑料制品和皮肤。因此，请谨慎处理这些有机溶剂，避免在与氯仿和/或甲醇接触的步骤中使用塑料，在这些步骤中使用硼硅酸盐玻璃移液器，并在使用前用氯仿和甲醇对这些移液器进行压毛。
2. 在甲醇/氯仿（17：1）混合物提取脂质时，使用硼硅酸盐玻璃移液器将较低的有机相（±400 μL）转移到带多氟乙烯内衬盖的15 mL高强度玻璃螺钉顶部离心管。在此类转移过程中，请勿干扰玻璃珠或上水相。在氮气流动下保持较低的有机相。
3. 在制备LC-MS/MS样品时，在将小瓶插入孔板之前，必须消除玻璃瓶中的所有气泡。
4. 在LC将脂质分离之前，在移动阶段A和B中实现活性铵和醋酸铵的完全溶解，将每种盐溶解在500μL的纳米纯水中，然后将溶液与移动相混合，并声波20分钟。
5. 在运行前，请勿在溶剂蒸发后长时间储存脂质膜。我们将这种薄膜储存在-80°C不超过一个星期，然后溶解在醋酸酯/2-丙醇/纳米纯水（65：35：5）混合物中，然后将脂质置于LC-MS/MS。
此处描述的LC-MS/MS方法是一种多功能、健壮和敏感的技术，用于定量评估许多脂质物种，包括酵母或任何其他真核生物体的细胞脂质。该方法能够识别和定量不同的异质或异质脂质，允许使用ESI MS的替代移动相添加剂，促进脂质电化，使脂质识别和定量更有效率，并可以使用HCD和CID方法对MS1脂质离子进行分裂或活化。
我们使用这种LC-MS/MS方法研究在萌芽酵母S.cerevisiae的时间顺序老化期间细胞和细胞系统脂肪质的年龄变化。我们还采用这种方法来研究有多少延老化的遗传、饮食和药理干预如何影响整个S.cerevisae细胞及其各种细胞器的脂质组成。由于其多功能性、鲁棒性和灵敏度，该LC-MS/MS方法可成功地用于对跨植原的真核生物体内的细胞和细胞藻质质的定量评估。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的财务利益。
Acknowledgments
我们感谢蒂托连科实验室的现任和前任成员进行讨论。我们感谢质谱生物学应用中心和结构和功能基因组学中心（都位于康科迪亚大学）提供出色的服务。这项研究得到了加拿大自然科学和工程研究理事会（RGPIN 2014-04482）和康科迪亚大学主席基金（CC0113）的资助。K.M.获得康科迪亚大学功绩奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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