Summary
우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.
Abstract
지질은 물에서 불용성 구조적으로 다양한 양과 성 분자입니다. 지질은 생물학적 막의 조직과 기능에 필수적인 기여자, 에너지 저장 및 생산, 세포 신호, 단백질의 포식 수송, 세포 생체 발생, 및 조절 된 세포 사멸. 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae는 철저한 분자 분석을 할 수 있는 단세포 진핵생물이기 때문에, 모형 유기체로 의 사용은 진핵 세포 내의 복잡한 생물학 프로세스에 지질 물질 대사 및 세포내 수송을 연결하는 기계장치를 밝히는 것을 도왔습니다. 효모 세포 내의 주요 지질 류의 강력하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법의 가용성은 이러한 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의 주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 설명된 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 그것은 10 개의 지질 클래스의 각각 내에서 수많은 종 (다른 등심 또는 이소성 형태 포함)의 식별 및 정량화를 가능하게합니다. 이 방법은 민감하고 0.2 pmol /μL의 낮은 농도에서 일부 지질 종의 식별 및 정량을 허용합니다. 이 방법은 전체 효모 세포와 정제 된 소기관의 지질 을 평가하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법에서 전기 분무 이온화 질량 분광법에 대한 대체 이단 첨가제의 사용은 일부 지질 종에 대한 이온화의 효율을 증가시킬 수 있으며 따라서 그들의 식별 및 정량을 향상시키는 데 사용될 수 있다.
Introduction
증거의 몸은 지질, 생체 분자의 주요 클래스 중 하나, 진핵 세포 내에서 많은 중요한 프로세스에 필수적인 역할을 나타냅니다. 이러한 프로세스는 세포 소기관을 둘러싼 혈장 막과 막을 구성하는 지질 이중층의 조립, 세포막을 가로지르는 소분자의 수송, 세포외 환경및 세포내 신호 전이의 변화에 대한 반응, 에너지의 생성 및 저장, 다른 세포기관에 국한된 단백질의 생성 및 수출, 내막 시스템 및 단백질 분비내의 단백질의 반응 인신매매, 여러 세포 세포 분비, 및 단백질 분비의 수강용 인신, 및 여러 세포 세포 내 단백질의 인신 매매를포함합니다. 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
신생 효모 S. cerevisiae,단세포 진핵 생물, 성공적으로 이러한 중요한 세포 과정에서 지질의 필수 역할의 기초메커니즘의 일부를 발견하는 데 사용되었습니다4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae는 포괄적인 생화학적, 유전적, 세포 생물학적, 화학적 생물학적, 시스템 생물학적, 및 미세유체 해부 분석21,22,23,24,25를사용할 수 있기 때문에 이러한 메커니즘을 밝히는 귀중한 모델 유기체이다. 지질 대사와 세포내 수송이 이러한 중요한 세포 과정에 기여하는 이해 메커니즘의 추가 진전은 세포 지질의 정량적 특성화에 대한 민감한 질량 분석 기술을 필요로하며, 지질학 분자 복잡성을 이해하고, 정량적 지질학을 시스템 생물학1,2,3,26의다분야 플랫폼으로 통합합니다. 27,28,29,30.
다른 진핵 생물의 효모 세포 및 세포의 질량 분광법 보조 양적 지질학에 대한 현재 의 방법은 충분히 다재다능하거나, 견고하거나, 민감하지 않다. 더욱이, 이들 현재 사용되는 방법은 서로 다양한 등바성 또는 이소성 지질 종을 분화할 수 없다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 허용하는 다재다능하고, 견고하고, 민감한 방법을 기술합니다.
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Protocol
1. 효모 배양용 멸균제 준비
- 1%(vv) 효모 추출물과 2%(vv) 박토펩톤을 함유한 완전한 YP 배지 90 mL를 준비합니다.
- 아미노산이 없는 0.67%(w/v) 효모 질소 염기를 함유하는 합성 최소 YNB 배지 90 mL, 20 mg/L-히스티딘, 30 mg/L L-류신, 30 mg/L L-리신,20 mg/L-라이신, 20 mg/L 우라실을 준비합니다.
- 전체 YP 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45mL)로 균등하게 나눕니다.
- 합성 최소 YNB 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45 mL)로 나눕니다.
- 사용하기 45분 전에 15 psi/121°C에서 YP 및 YNB 용지로 플라스크를 오토클레이브합니다.
2. 효모 변형
- 야생 형 변형 BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)를사용합니다.
3. 포도당으로 완전한 YP 배지에 효모를 배양하십시오.
- 사용 하기 전에 45 분 동안 15 psi/121 °C에서 포도 당의 20% (w/v) 스톡 용액을 오토클레이브.
- 멸균 YP 배지를 함유한 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 멸균 20% (w/v) 스톡 용액 5 mL을 추가하여 최종 농도2% 포도당(w/v)을 추가합니다.
- 미생물 루프를 사용하여 포도당으로 YP 배지를 함유하는 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 야생형 균주 BY4742의 세포를 접종하였다.
- 200 rpm에서 회전 흔들림으로 30°C에서 밤새 세포를 배양하였다.
- 효모 문화의 알리쿼트. 혈세포계를 사용하여 배양 mL 당 총 효모 세포 수를 결정합니다.
4. 효모를 포도당으로 합성 최소 YNB 배지로 옮기고 배양하십시오.
- 멸균 된 YNB 배지를 함유 한 두 개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 멸균 20 % (w / v) 스톡 용액 5 mL을 최종 농도2 % 포도당 (w / v)에 추가하십시오.
- 멸균 피펫을 사용하여 총 5.0 x 107 세포를 포함하는 하룻밤 효모 배양액을 포도당과 함께 YNB 배지를 함유하는 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 전달한다.
- 200 rpm에서 회전 흔들림으로 30°C에서 적어도 24 시간(또는 실험이 필요한 경우 이상)에 대해 세포를 배양합니다.
5. 지질 추출을위한 시약, 실험실 용품 및 장비 의 준비
- 준비: 1) 고등급(>99.9%) 클로로포름; 2) 고급 등급(>99.9%) 메탄올; 3) 28 % (v / v) 나노 순수에서 수산화 암모늄 용액; 4) 유리 비드 (산 세척, 425-600 μM); 5) 적절한 어댑터가있는 소용돌이; 6) 폴리테트라플루오로에틸렌 라이닝 캡을 가진 15 mL 고속 유리 원심분리기 튜브; 7) 17:1 및 2:1 클로로포름과 메탄올의 혼합물; 8) 0.1% 수산화 암모늄 (v/v)와 클로로포름 / 메탄올 (2 :1) 혼합물; 9) ABC 용액 (155 mM 암모늄 중탄산염, pH = 8.0); 10) 표 1에나타낸 바와 같이 클로로포름과 메탄올의 2:1 혼합물로 제조된 내부 지질 표준의 혼합물; 및 11) 세포 지질의 추출을위한 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 줄 지어 캡 2 mL 유리 샘플 바이알.
6. LC용 시약, 실험실용품 및 장비 준비
- 다음을 준비: 1) 아세토니트릴/2-프로판/나노 순수 (65:35:5) 혼합물; 2) 적절한 어댑터가있는 소용돌이; 3) 초음파 초음파 검사기; 4) 웰 플레이트용 인서트가 있는 유리 바이알; 5) 이진 펌프, 탈기, 및 자동 샘플러가 장착 된 LC 시스템; 6) C18 역상 컬럼(2.1 mm; 75 mm; 기공 크기 130 Å; pH 범위 1-11)을 프리 컬럼 시스템에 결합; 7) 혼합물 A: 아세토니트릴/물 (60:40); 및 8) 혼합물 B: 이소프로판올/아세토니트릴 (90:10).
7. 효모 세포에서 지질 추출
- 효모 문화의 알리쿼트. 혈세포계를 사용하거나 OD600을 측정하여 배양 mL당 총 효모 세포 수를 결정합니다.
- 총 5.0 x 107 셀(3.3 단위 OD600)을포함하는 효모 배양량을 취한다. 이 배양량을 미리 냉각된 1.5 mL 미세원원지 튜브에 넣습니다.
- 4 °C에서 1 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 수확하십시오. 상급제는 버리십시오.
- 얼음 차가운 나노 순수 1.5 mL을 추가하고 4 °C에서 1 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 씻으하십시오. 상급제는 버리십시오.
- 1.5 mL의 얼음 차가운 ABC 용액을 추가하고 4 °C에서 1 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 씻으하십시오. 상급제는 버리십시오. 세포 펠릿은 지질 추출 전에 -80°C에서 보관할 수 있다.
- 지질 추출을 시작하려면 얼음에 세포 펠릿을 해동하십시오.
- 200 μL의 얼음 차가운 나노 순수에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액을 폴리테트라플루오로에틸렌 라이닝 캡으로 15 mL 고강도 유리 나사 상부 원심분리관으로 옮김을 옮김. 이 튜브에 다음을 추가하십시오: 1) 클로로포름/메탄올(2:1) 혼합물로 제조된 내부 지질 표준의 혼합물의 1) 25 μL; 2) 425-600 μM 산 세척 유리 구슬의 100 μL; 및 3) 클로로포름/메탄올(17:1) 혼합물 600 μL.
- 실온(RT)에서 5분 동안 고속으로 튜브를 소용돌이치며 세포를 방해한다.
- 지질의 추출을 용이하게하기 위해 RT에서 1 시간 동안 저속으로 튜브를 소용돌이.
- 단백질 침전을 촉진하고 수성 및 유기 상을 서로 분리하기 위해 얼음에 15 분 동안 샘플을 배양하십시오.
- RT에서 5 분 동안 3,000 x g의 임상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다. 이 원심 분리 단계는 모든 지질 클래스를 포함하는 하부 유기 상으로부터 상부 수성 상을 분리 할 수 있습니다.
- 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하여 하부 유기상(~400 μL)을 폴리테트라플루오로에틸렌 라이닝 캡이 있는 다른 15mL 고강도 유리 나사 상부 원심분리관으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 더합니다. 이러한 이송 중에 유리 구슬 또는 상부 수성 상을 방해하지 마십시오. 질소 가스의 흐름 아래 낮은 유기 상을 유지합니다.
- 300 μL의 클로로포름-메탄올(2:1) 혼합물을 남은 상부 수성 상에 첨가하여 스핑크고지질과 PA, PS, PI 및 CL. 소용돌이튜브를 RT에서 5분 동안 힘차게 추출할 수 있도록 한다.
- RT에서 5 분 동안 3,000 x g의 임상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 보로실리케이트 유리 피펫을 사용하여 원심분리 후 형성된 하부 유기상(~200 μL)을 단계 7.13에서 수집된 유기상으로 이송한다.
- 질소 가스의 흐름을 사용하여 결합된 유기 상에서 용매를 증발시보입니다. 질소 가스의 흐름 하에서 지질 막을 포함하는 튜브를 닫습니다. 이 튜브를 -80 °C에 보관하십시오.
8. LC에 의한 추출된 지질의 분리
- 7.16단계에서 얻은 지질 막을 함유하는 튜브에 아세토니트릴/2-프로판/나노 순수(65:35:5) 혼합물 500 μL을 첨가한다. RT에서 10초 동안 튜브 3x를 소용돌이치십시오.
- 15 분 동안 초음파 초음파 에 튜브의 함량을 주제.
- 튜브에서 샘플 100 μL을 가져 와서 웰 플레이트에 사용되는 인서트가있는 유리 병에 추가하십시오. 인서트에 기포를 제거한 후 웰플레이트에 넣습니다.
- LC 시스템을 사용하여 프리컬럼 시스템에 결합된 역상 C18 컬럼 CSH상에서 상이한 지질 종을 분리한다(재료 표참조). 분리 하는 동안, 55 °C에서 0.3 mL/min의 유량에서 컬럼을 유지 하십시오.
- 혼합물 A (아세토니트릴 / 물 [60 :40 [60 : 40 (v /v)])와 혼합물 B (이소 프로판올 / 아세토니트릴 [90 :10 (v / v)]]로 구성된 이면을 사용하십시오. 전기 분무 이온화(ESI) 이온 소스를 사용하여 생성된 모이온의 검출의 양수 모드의 경우, ESI(+) 모드, 이머지 A 및 B는 최종 농도 10 mM에서 암모늄 포메이트를 함유한다. 모이온 검출의 음의 모드의 경우, ESI(-) 모드, 이동상 A 및 B는 10 mM의 최종 농도에서 암모늄 아세테이트를 함유한다.
- ESI(+) 및 ESI(-) 모드모두에 주입할 때 10 μL의 샘플 볼륨을 사용하십시오.
- 다음 LC 구배를 사용하여 LC에 의해 상이한 지질 종을 분리: 0-1 분 10% (상 B); 1-4 분 60 % (단계 B); 4-10 분 68 % (단계 B); 10-21 97% (단계 B); 21-24 분 97 % (단계 B); 24-33 분 10 % (단계 B).
- 추출 공백을 첫 번째 샘플, 4개 샘플 마다 및 마지막 샘플로 실행합니다. 데이터를 정규화하려면 배경을 뺍니다.
- 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 지질의 LC/MS 데이터로부터의 대표적인 총 이온 크로마토그램은 도 1에나타내었다.
9. LC에 의해 분리된 지질의 질량 분광 분석
- HESI(가열된 전기 분무 이온화) 이온 공급원이 장착된 질량 분석기를 사용하여 LC로 분리된 지질을 분석합니다. 표 2에제공된 설정을 사용합니다.
- 푸리에 변환 분석기를 사용하여 60,000D의 해상도와 150-2,000 Da의 질량 범위 내에서 모이온(MS1)을 검출합니다.
- 표 3에 제공된 설정을 사용하여 이차 이온(MS2)을 검색합니다.
10. LC-MS/MS의 원시 데이터 처리를 통해 다른 지질 등급 및 종의 식별 및 정량화
- 원시 LC-MS/MS 파일에서 다른 지질의 식별 및 정량을 수행 하려면 소프트웨어에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 이 소프트웨어는 150만 개 이상의 지질 이온 전구체(MS1)와 예측 된 단편 이온 (MS2)을 포함하는 가장 큰 지질 데이터베이스를 사용합니다. 이 소프트웨어는 또한 지질 정량에 대한 MS1 피크와 지질 식별MS2를 사용합니다. 두 개의 이소메릭 포스파티딜세린 형태(34:0)의 대표적인 크로마토그램은 m/z 값이 동일하지만 유지 시간은 다르지만 MS1 및 MS2 스펙트럼은 각각 그림 2, 그림 3및 그림 4에나타내었습니다.
- 전체 스캔 MS1 데이터 및 데이터 의존 MS2 데이터를 포함하는 LC-MS 원시 파일을 무료로 검색 (비에스테르화) 지방산 (FFA), 카디오리핀 (CL), 피토스핑고신 (PHC), 피토스핑고신 (PHS), 포스파티딜콜린 (PC), 포스파디딜렌 olamine (PE), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티딜리노시톨 (PI), 포스파티딜세린 (PS), 트리아실글리세롤 (TAG) 지질 클래스는 전구체 이온에 대해 5 ppm의 m/z 허용 오차를 사용하고 제품 이온의 경우 10 ppm입니다. 다른 검색 매개 변수는 표 4에나와 있습니다. 소프트웨어 사용 설명서에 제공된 지침을 따르십시오. 특이한 지방산 조성을 가진 내부 지질 표준 및 지질 종의 정체성은 수동으로 확인될 필요가 있습니다.
- 지질 검색 소프트웨어에 대해 자유롭게 사용할 수 있는 오픈 소스 대안의 도움으로 다양한 지질 클래스 및 종을 식별하고 정량화하려면 지질 데이터분석기(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine2(http://mzmine.github.io/)또는 XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) 소프트웨어를 사용하여 LC-MS/MS에서 원시 데이터를 처리합니다.
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Representative Results
LC-MS/MS의 도움으로 효모 세포 내의 주요 세포 지질의 정량적 평가를 위한 우리의 방법은 다재다능하고 견고했습니다. 처음에는 2% 포도당을 함유하는 합성 최소 YNB 배지에서 배양된 S. 세레비시아세포에서 10개의 상이한 지질 클래스를 식별하고 정량화할 수 있었습니다. 이러한 지질 클래스는 무료(비제스테레화) 지방산(FFA), CL, 피토세라미드(PHC), 피토스핑고신(PHS), PC, PE, PG, PI, PS 및TAG(보충표 1)를포함한다. 이들 클래스의 수많은 분자 종은 이 LC-MS/MS 방법을 사용하여 확인및 정량화되었다(보충표1).
우리의 LC-MS/MS 방법도 민감했습니다. 실제로, 0.165 pmol/μL의 낮은 농도에서 지질의 분자 종의 식별 및 정량화를 가능하게 하였다(표 5의피토세라미드에 대한 데이터 참조). 이 정량의 한계는 광범위한 농도 범위 내에서 상이한 지질 클래스에 대해 다릅니다(표5).
중요한 것은, 우리의 방법은 지질의 다른 이소바릭 또는 이소만 형태의 식별 및 정량화를 허용했다. 지질의 동위원소 형태는 동일한 명목 질량 (즉, 가장 풍부한 동위 원소의 질량의 합)을 가진 지질 종이지만 정확한질량31과는 다르다. 지질의 이소메릭 형태는 동일한 분자 공식을 가진 지질 종이지만 다른 화학구조31을가진다. 예를 들어, PHC (16:0_26:0)와 등심 지질 종 PC (16:0_10:0)를 구별하는 LC-MS /MS 방법의 사용 : 그들은 650의 동일한 공칭 질량 값을 가지고 있지만, 그들의 정확한 질량은 각각 650.6457 과 650.4755입니다. 더욱이, 이 LC-MS/MS 방법은 동일한 분자 식이요법을 가진 이소민 지질 종의 두 쌍 사이에서 구별된다: 1) PC (18:0_18:1) 및 PC (20:0_16:1), 분자 공식 (C44H87N1O8P1) 및 정확한 질량 (788.616); 및 2) PE (16:0_16:0) 및 PE (14:0_18:0), 분자 공식 (C37H75N1O8P1) 및 정확한 질량 (692.5224).
당사의 LC-MS/MS 방법은 모든 종류의 지질에 대한 이온화 효율을 높이는 데 사용할 수 있으므로 주요 세포 지질의 식별 및 정량화를 개선할 수 있습니다. 이러한 개선은 ESIMS(표 6)에대한 대체 이상 첨가제를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 대체 단계에는 암모늄 포르메이트, 포르믹산이 있는 암모늄 포메이트, 암모늄 아세테이트, 아세트산암모늄 아세테이트, 포르미산이 함유된 암모늄 아세테이트 등이 있습니다. 이들 각각의 대체 이상 첨가제는 정상 상 및 역상 LC 컬럼 모두에 사용될 수있다(표 6).
LC-MS/MS 방법의 또 다른 장점은 MS2 제품으로 지질의 전구체 이온(MS1)의 단편화를 위한 두 가지 방법을 사용하는 능력에 있습니다. 이들 두 가지 방법은 고에너지 충돌 해리(HCD) 및 충돌-유도 해리(CID)32이다. 이러한 조건하에서 PHC, CL, FFA, PE, PG, PI 및 PS에 대한 MS2 제품으로의 MS1 지질 이온 단편화의 효율을 증가시킬 수 있으므로 MSI(-) MS의 ESI(-) 모드에 대한 암모늄 아세테이트 이상 첨가제와 함께 사용하는 경우 CID 방법이 유익하다는 것을 발견하였다(표7). 대조적으로, HCD 방법은 MS의 ESI(+) 모드에 대한 암모늄 포메이트 이상 첨가제와 함께 사용하는 경우 유리하며, 이러한 조건 하에서 PC, PHS 및 TAG용 MS2 제품으로의 MS1 지질 이온 단편화의 효율을 증가시킬 수있다(표 8).
도 1: 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 지질의 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS) 데이터로부터의 총 이온 크로마토그램(TIC). 지질의 TIC는 역상 컬럼 CSH C18상에서 LC에 의해 분리되고 음의 전기 분무 이온화 모드를 사용하여 생성된 모이온의 MS에 의해 검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 762.5294의 m/z 값(M-H)을 가지지만 7.65분과 8.49분의 유지 시간이 다른 두 개의 이소메릭 포스파티딜세린 형태(34:0)의 크로마토그램. 지질은 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출하고 역상 컬럼 CSH C18상에서 액체 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 762.5294의 m/z 값(M-H)을 가지지만 7.65분 과 8.49분의 다른 유지 시간을 가지는 두 개의 이소메릭 포스파티딜세린 종(34:0)의 MS1 스펙트럼. 지질은 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출되었고, 역상 컬럼 CSH C18상에서 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고(도 2에도시된 바와 같이) 음의 전기 분무 이온화 모드를 사용하여 생성된 모(MS1) 이온의 질량 분석법에 의해 검출되었다. (A)762.5294의 m/z 값(M-H)과 7.65분의 체류 시간을 가진 포스파티딜세린 형태(34:0)의 MS1 스펙트럼.(B)762.5294의 m/z 값(M-H)과 8.49분의 유지 시간을 가진 포스파티딜세린 형태(34:0)의 MS1 스펙트럼은 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 4: 762.5294의 m/z 값(M-H)을 가지지만 7.65분과 8.49분의 유지 시간이 다른 두 개의 이소메릭 포스파티딜세린 종(34:0)의 MS2 스펙트럼. 지질은 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출하였고, 역상 컬럼 CSH C18상에서 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고(도 2에도시된 바와 같이) MS1 이온의 질량 분석법에 의해 검출되었다(도 3에도시된 바와 같이). 이차 이온(MS2)은 질량 분석법에 의해 검출되었다. (A)포스파티딜세린 형태(34:0)의 MS2 스펙트럼과 m/z 값(M-H)은 762.5294이고 유지 시간은 7.65분이다. 세린 모에티의 손실은 675.6149의 m/z 값(M-H)으로 이온을 생성했습니다. (B)762.5294의 m/z 값(M-H)과 8.49분의 체류 시간을 가진 포스파티딜세린 형태(34:0)의 MS2 스펙트럼. 세린 모에티의 손실은 675.8843의 m/z 값(M-H)으로 이온을 생성했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 감지 모드 | 지질 클래스 | 소수성 꼬리 조성 | 계산된 m/z 값 | 농도 (페몰 / μl) |
| 부정적인 | 세라미드 | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| 부정적인 | 카세리핀 | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| 부정적인 | 자유 지방산 | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| 부정적인 | 포스파티딜레탄올라민 | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| 부정적인 | 포스파티딜리세롤 | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| 부정적인 | 포스파티디올리노시톨 | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| 부정적인 | 포스파티딜세린 | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| 긍정적인 | 포스파티딜콜린 | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| 긍정적인 | 피토스핑고신 | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| 긍정적인 | 트리아실글리세롤 | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
표 1: 내부 지질 표준의 혼합물의 조성. 내부 지질 기준은 클로로포름/메탄올(2:1) 혼합물로 제조하였다. 검출 모드는 전기 분무 이온화(ESI) 이온 공급원이 장착된 Orbitrap Velos 질량 분광계를 사용하여 모이온 검출의 양극 또는 음수 모드를 말합니다. 계산된 m/z 값은 지질의 유도체에 대한 값입니다.
| FTMS + p 해상도 | 60000 |
| 질량 범위(달톤) | 150-2000 |
| 이온 소스 타입 | 헤시 ()에시 (주) |
| 모세관 온도(°C) | 300 |
| 소스 히터 온도 (°C) | 300 |
| 시스 가스 흐름 | 10 |
| 보조 가스 흐름 | 5 |
| 양극성 전압(kV) | 3 |
| 음극성 전압(kV) | 3 |
| 소스 전류(μA) | 100 |
표 2: ORBITrap 벨로스 질량 분광계의 설정은 LC에 의해 분리된 지질을 분석하는 데 사용됩니다. 약어: FTMS + p = ESI(+) 모드에서 푸리에 변환 기반 질량 분석법; HESI = 가열 된 전기 스프레이 이온화.
| 계측기 극성 | 긍정적인 | 부정적인 |
| 정품 활성화 유형 | 고에너지 유도 충돌 해리 | 충돌 유발 해리 |
| 최소 신호 필요 | 5000 | 5000 |
| 절연 폭 | 2 | 2 |
| 정규화된 충돌 에너지 | 55 | 35 |
| 기본 충전 상태 | 2 | 2 |
| 활성화 시간 | 0.1 | 10 |
| FTMS + C 해상도 | 7500 | |
| 5 가장 강렬한 피크는 MS / MS에 대해 선택되었다 |
표 3: 이차 이온(MS2)을 검출하는 데 사용되는 Orbitrap Velos 질량 분광계의 설정입니다. 약어: FTMS + C = ESI(+) 모드에서 푸리에 변환 기반 질량 분석법.
| 식별 | |
| 데이터베이스 | 궤도 랩 |
| 피크 감지 | 리콜 동위원소 (ON) |
| 검색 옵션 | 제품 검색 궤도 랩 |
| 검색 유형 | 제품 |
| 실험 유형 | LC-MS |
| 전구체 공차 | 10 ppm |
| 제품 허용 오차 | 고에너지 유도 충돌 해리 [ESI(+) 모드]: 20 ppm |
| 충돌 유도 해리 [ESI (-) 모드]: 0.5 달톤 | |
| 정량화 | |
| 정량 실행 | 에 |
| m/z 공차 | -5.0; +5.0 |
| 공차 유형 | Ppm |
| 필터 | |
| 최상위 순위 필터 | 에 |
| 주 노드 필터 | 주요 이소머 피크 |
| m 점수 임계값 | 5 |
| c-점수 임계값 | 2 |
| FFA 우선 순위 | 에 |
| ID 품질 필터 | A: 지질 류 & 모든 지방산은 완전히 확인 |
| B: 지질 클래스 & 일부 지방산은 확인 | |
| C: 지질 클래스 또는 FA식별 | |
| D: 다른 단편 이온으로 확인된 지질(H2O 등) | |
| 지질 클래스 | |
| 고에너지 유도 충돌 해리 [ESI(+) 모드] | PC, 태그 |
| 충돌 유도 해리 [ESI(-) 모드] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| 이온 | |
| 고에너지 유도 충돌 해리 [ESI(+) 모드] | + H; + NH4; + Na |
| 충돌 유도 해리 [ESI(-) 모드] | - H; - 2H; - HCOO |
표 4: 지질 식별 소프트웨어 "지질 검색"(V 4.1)의 도움으로 상이한 지질 클래스 및 종을 식별하는 데 사용되는 검색 파라미터. 약어: CER = 세라마이드; CL = 카디오리핀; FFA = 자유 (비스테라화) 지방산; PC = 포스파티딜콜린; PE = 포스파티딜레탄올아민; PG = 포스파티딜리세롤; PI= 포스파티딜리노시톨; PS = 포스파티딜세린; 태그 = 트리 아실 글리세롤.
표 5: LC-MS/MS 방법의 도움으로 식별되고 정량화될 수 있는 다른 지질 클래스의 분자 종의 가장 낮은 농도. 각 지질 클래스에 대한 가장 낮은 정량화 농도의 추정치는 내부 표준(이러한 MS 피크 영역 및 지질 표준 농도가 굵게 표시)에 대한 MS 피크 영역과 가장 낮은 검출 가능한 농도로 존재하는 대표적인 분자 형태를 기반으로 합니다. 데이터는 각각 3개의 기술 복제가 수행된 두 개의 독립적인 실험의 평균 값으로 표시됩니다. 이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).
| 지질 표준 | ESI 모드 | Amf | AmF/FA | Amac | 암Ac/AA | 암Ac/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| 태그 | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
표 6: 상이한 클래스의 지질에 대한 이온화의 효율성에 대한 ESI MS에 대한 대체 이동상 첨가제의 효과. 상이한 지질은 역상 액체 크로마토그래피에 의해 서로 분리되었다. 다른 종류의 지질에 속하는 상업적 지질 표준은 표 1에명명되어 있다. ESI(-) 또는 ESI(+) 이온화 모드는 상이한 이상 첨가제가 존재하는 MS에 사용되었다. 각 지질 표준에 대한 이온화의 백분율은 3개의 기술적 복제물로부터평균값으로 도시된다. 각 지질에 대해, 이온화 백분율은 MS 피크 영역에 기초하여 계산되었다. 각 지질에 대해 가장 높은 이온화 효율의 값이 굵게 표시됩니다. 약어: AmF = 암모늄 포메이트; 암프/FA = 포산이 있는 암모늄 포메이트; 암Ac = 암모늄 아세테이트; 암Ac/AA= 아세트산을 함유한 암모늄 아세테이트; 암Ac/FA= 포산이 있는 암모늄 아세테이트; CL = 카디오리핀; FFA = 자유 (비스테라화) 지방산; PC = 포스파티딜콜린; PE = 포스파티딜레탄올아민; PG = 포스파티딜리세롤; PHC = 피토세라마이드; PHS = 피토스핑고신; PI= 포스파티딜리노시톨; PS = 포스파티딜세린; 태그 = 트리 아실 글리세롤.
| 지질 표준 | ESI 모드 | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| 태그 | + | 65.7 | 69.7 |
표 7: 전구체 이온(MS1) 단편화의 효율에 대한 충돌 유발 해리(CID) 방법의 효과. 다른 종류의 지질에 속하는 상업적 지질 표준은 표 1에명명되어 있다. ESI(-) 또는 ESI(+) 이온화 모드는 MS를 위해 사용되었고, 암모늄 포메이트(AmF) 또는 암모늄 아세테이트(AmAc) 이상 첨가제의 존재하였다. MS2 제품으로 단편화된 MS1 지질 이온의 백분율은 3개의 기술적 복제물로부터 평균 값으로 나타내었다. 각 지질에 대해, 이온화 백분율은 MS2 피크 영역에 기초하여 계산되었다. 단편화된 MS1 지질 이온중 가장 높은 백분율의 값은 각 지질에 대해 굵게 표시됩니다(표 8에제시된 데이터와 비교). 이 값은 MS2 제품 이온 형성의 효율이 가장 높은 경우 가장 높습니다. 약어: CL = 카디오리핀; FFA = 자유 (비스테라화) 지방산; PC = 포스파티딜콜린; PE = 포스파티딜레탄올아민; PG = 포스파티딜리세롤; PHC = 피토세라마이드; PHS = 피토스핑고신; PI= 포스파티딜리노시톨; PS = 포스파티딜세린; 태그 = 트리 아실 글리세롤.
| 지질 표준 | ESI 모드 | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| 태그 | + | 91.4 | 84.9 |
표 8: 고에너지 충돌 해리(HCD) 방법의 효과는 전구체 이온(MS1) 단편화의 효율에 대한 것이다. 다른 종류의 지질에 속하는 상업적 지질 표준은 표 1에명명되어 있다. ESI(-) 또는 ESI(+) 이온화 모드는 MS를 위해 사용되었고, 암모늄 포메이트(AmF) 또는 암모늄 아세테이트(AmAc) 이상 첨가제의 존재하였다. MS2 제품으로 단편화된 MS1 지질 이온의 백분율은 3개의 기술적 복제물로부터 평균 값으로 나타내었다. 각 지질에 대해, 이온화 백분율은 MS2 피크 영역에 기초하여 계산되었다. 단편화된 MS1 지질 이온중 가장 높은 백분율의 값은 각 지질에 대해 굵게 표시됩니다(표 7에제시된 데이터와 비교). 이 값은 MS2 제품 이온 형성의 효율이 가장 높은 경우 가장 높습니다. 기타 약어: CL = 카디오리핀; FFA = 자유 (비스테라화) 지방산; PC = 포스파티딜콜린; PE = 포스파티딜레탄올아민; PG = 포스파티딜리세롤; PHC = 피토세라마이드; PHS = 피토스핑고신; PI= 포스파티딜리노시톨; PS = 포스파티딜세린; 태그 = 트리 아실 글리세롤.
보충 표 1: 우리의 LC-MS/MS 방법의 도움으로 S. cerevisiae 세포에서 확인되고 정량화된 10개의 다른 지질 클래스의 분자 종의 목록. 이러한 지질 클래스 포함 무료 (비 스테레화) 지방산 (FFA), 카디오리핀 (CL), 피토 세라 미드 (PHC), 피토스핑고신 (PHS), 포스 파티 딜 콜린 (PC), 포스프 atidylethanolamine (PE), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티딜리노시톨 (PI), 포스파티딜세린 (PS), 및 트리아실 글리세롤 (TAG). S. 세레비시아세포는 초기에 2% 포도당을 함유하는 합성 최소 YNB 배지에서 배양하였다. 추출된 지질의 지질 추출 및 LC-MS/MS 분석을 위한 효모 세포의 Aliquots는 배양의 1일, 2, 3, 4, 6, 8 및 10일에 회수되었다. 배양의 다른 날에 회수된 효모 세포에서 확인된 각 지질 클래스의 모든 지질 종들이 도시된다. 이러한 지질 종 중 일부는 배양의 일 1-4 일에 회복 연대순으로 젊은 효모 세포에 존재했다, 다른 사람은 배양의 일에 회복 연대순으로 오래된 효모 세포에서 만 6-10, 반면 일부는 연대순으로 젊고 오래된 효모 세포 모두에 존재했다. 배양의 특정 일에 확인된 각 지질 클래스의 각 지질 종에 대한 가장 높은 MS 피크 영역이 도시된다. 이 지질 클래스 내에서 다른 종의 정량에 사용 된 다른 지질 클래스의 지질 표준 붉은 색으로 표시 됩니다. 계산된 m/z 값은 지질의 유도체에 대한 값입니다. 약어: ESI (-) = MS의 ESI (-) 모드; ESI (+) = MS. 데이터의 ESI (+) 모드는 각각 3개의 기술 복제가 수행된 두 개의 독립적인 실험의 평균 값으로 표시됩니다. 이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 는 다음과 같은 예방 조치가 중요합니다.
1. 클로로포름과 메탄올은 독성이 있습니다. 실험실 플라스틱 제품 및 피부를 포함한 표면에서 다양한 물질을 효율적으로 추출합니다. 따라서 이러한 유기 용매는 클로로포름 및/또는 메탄올과 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 않고, 이러한 단계에 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하고, 사용하기 전에 엽록소와 메탄올로 피펫을 헹구어 주의하십시오.
2. 메탄올 /클로로 폼 (17 :1) 혼합물에 의한 지질 추출 중에 보로 실리 케이트 유리 파이펫을 사용하여 낮은 유기 상 (~ 400 μL)을 폴리테트라 플루오로에틸렌 줄 지어있는 15 mL 고강도 유리 나사 상단 원심 분리 튜브로 옮니다. 이러한 이송 중에 유리 구슬 또는 상부 수성 상을 방해하지 마십시오. 질소 가스의 흐름 아래 낮은 유기 상을 유지합니다.
3. LC-MS/MS의 시료 준비 중에 유리병을 웰플레이트에 삽입하기 전에 유리 바이알의 모든 기포를 제거하는 것이 중요합니다.
4. LC에 의한 지질 분리 전에 이순상 A와 B에서 암모늄 포메이트와 암모늄 아세테이트의 완전한 용해화를 달성하려면, 용액을 이동상과 혼합하고 20 분 동안 초음파 처리하기 전에 나노 순수 500 μL에 각 소금을 용해시다.
5. 용매 증발 후 형성된 지질 막을 실행하기 전에 장시간 보관하지 마십시오. 우리는 아세토니트릴/2-프로판/나노 순수(65:35:5) 혼합물에서 용해한 다음 지질을 LC-MS/MS에 적용하기 전에 이 필름을 -80°C에 1주일 이상 보관합니다.
여기서 설명된 LC-MS/MS 방법은 효모 또는 임의의 진핵 생물의 세포 지질을 포함하는 많은 지질 종의 정량적 평가를 위한 다재다능하고, 견고하며, 민감한 기술이다. 이 방법은 상이종 이소바릭 또는 이소메릭 지질 종의 식별 및 정량화를 가능하게 하고, ESI MS에 대한 대체 이동상 첨가제를 사용하여 지질 이온화를 촉진하고 지질 식별 및 정량화를 보다 효율적으로 만들 수 있으며, MS1 지질 이온의 단편화 또는 활성화를 위한 HCD 및 CID 방법을 모두 사용할 수 있다.
우리는 신진 효모 S. cerevisiae의연대순 노화 동안 세포 및 오르가넬라 리피도메의 연령 관련 변화를 연구하기 위해이 LC-MS / MS 방법을 사용합니다. 우리는 또한 얼마나 많은 노화 지연 유전, 식이 요법 및 약리학적 인 개입이 전체 S. 세레비시아 세포 및 다양한 세포기관의 지질 조성에 영향을 미치는지 조사하기 위해이 방법을 사용합니다. 그것의 다양성, 견고성 및 감도 때문에, 이 LC-MS/MS 방법은 필라를 가로질러 진핵 생물에 있는 세포와 유기체 lipidomes의 정량적인 평가를 위해 성공적으로 이용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 토론을 위해 Titorenko 실험실의 현재 및 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분석의 생물학적 응용 을위한 센터와 구조 및 기능 유전체학 센터 (모두 콩코르디아 대학에서) 뛰어난 서비스를 인정합니다. 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482) 콩코르디아 대학 의자 기금 (CC0113). K.M.은 콩코르디아 대학 공로상을 수상했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
