Summary
Здесь мы описываем иммунопрецициции рибосом и связанных с ними РНК из отдельных популяций взрослых мужских клеток зародышевой мыши с помощью системы RiboTag. Стратегическое размножение и тщательное иммунопрецициционное обеспечение приводят к чистым, воспроизводимым результатам, которые информируют о транслатоме зародышевых клеток и дают представление о механизмах фенотипов мутантов.
Abstract
Количественная разница в изобилии мРНК является классическим подходом к пониманию влияния данной генной мутации на физиологию клеток. Однако, характеризующие различия в транслатоме (целом переведенных мРНК) обеспечивает дополнительный слой информации, особенно полезной при попытке понять функцию РНК регулирующих или связывающих белков. Для достижения этой цели был разработан ряд методов, включая рибосомное профилирование и полисомный анализ. Однако оба метода несут значительные технические проблемы и не могут быть применены к определенным популяциям клеток в ткани, если в сочетании с дополнительными методами сортировки. В отличие от этого, метод RiboTag является генетическим, эффективным и технически простой альтернативой, которая позволяет идентифицировать рибосомы связанных РНК из конкретных популяций клеток без дополнительных шагов сортировки, при условии, что применимый драйвер Cre для клеток имеется. Этот метод состоит из размножения для генерации генетических моделей, сбора образцов, иммунопрециционности и анализа РНК. Здесь мы излагаем этот процесс во взрослых мужских клетках зародышевых клеток мутант для РНК связывающий белок, необходимый для мужской плодовитости. Особое внимание уделяется вопросам селекции с акцентом на эффективное управление колониями и генерацию правильного генетического происхождения и иммунопреципции в целях снижения фона и оптимизации производства. Обсуждение вариантов устранения неполадок, дополнительных подтверждающих экспериментов и потенциальных приложений вниз по течению также включено. Представленные генетические инструменты и молекулярные протоколы представляют собой мощный способ описания рибосомных РНК конкретных клеточных популяций в сложных тканях или в системах с аномальным хранением мРНК и переводом с целью информирования о молекулярных драйверах фенотипов мутантов.
Introduction
Анализ рнкона клетки или ткани, как и с помощью микроаррей или РНК-секвенирования, оказался мощным инструментом для понимания молекулярных драйверов фенотипов мутантов. Тем не менее, эти относительно неполные инструменты анализа не могут информировать о физиологии или протеоме клетки, особенно в системах, где многие мРНК хранятся до перевода, такие как нервные и зародышевые клетки. В этих системах определение популяции мРНК, активно переводимых в белок, или транслатом клетки, может быть лучшим показателем фактического физиологического состояния клетки1,2. Например, зародышевые клетки на различных стадиях разработки транскрибируют РНК, которые хранятся для последующего перевода, движимые либо развитием3, либо сигналами4. Этот процесс является примером мРНК кодирования протаминов, в котором транскрипт мРНК обнаруживается дней до белка производится1,2,5,6. Аналогичным образом, нервные клетки транскрибируют РНК в ядре и транспортируют ее вниз по аксону, как в случае с Q-actin7. В дополнение к этим специализированным клеточным системам, транскриптомы устойчивого состояния вряд ли будут информативными в моделях, где происходит хранение РНК, рибосомный биогенез или перевод мРНК. Несколько других факторов могут также повлиять на устойчивый состояние РНК пула клетки включают распад мРНК и активность РНК связывающих белков. В этих случаях надежные инструменты для анализа связанных с рибосомами РНК или мРНК при активном переводе с большей вероятностью дают биологически значимые результаты.
С этой целью было разработано несколько методов для выявления связанных с рибосомами или активно переведенных сообщений. Полисом профилирование, которое обеспечивает снимок рибосомы связанных стенограмм, был использован в течение многих десятилетий, чтобы изолировать нетронутыми РНК, связанных с либо рибосомных подразделений или моно-, ди-, и поли-рибосомы комплексов3. Кратко, собранные lysates клетки прикладываются к линейному градиенту сахарозы и центрифугированы как высокая скорость, приводящ к в разделении ингосомных subunits, неповрежденных ribosomes, и polysomes размером. Традиционно, этот метод был применен для изучения одного или нескольких мРНК, но в последнее время этот метод был объединен с РНК-сек исследований для выяснения функции потенциальных регуляторов переводов8,9 В то время как мощный способ различать активно преобразующих и не-преобразующих мРНК10, полисомное профилирование требует трудоемких методов (градиентов фракционное и ультрацентричная сделка) населения, сложное.
Альтернативным подходом к изучению транслатома является рибосомное профилирование, которое определяет части стенограмм, непосредственно связанных с рибосомой. Короче говоря, рибосомы связанные фрагменты РНК генерируются с помощью анализа защиты RNase, отдельные рибосомные комплексы, разделенные через градиент сахарозы, и связанные фрагменты РНК изолированы и преобразованы в РНК-сек теги поддаются глубокому секвенированию11. Одним из ключевых преимуществ рибосомного профилирования является возможность определить конкретные места рибосом во время изоляции, что позволяет идентифицировать места начала перевода, расчет рибосомной занятости и распределения, а также идентификацию рибосомных киосков12. Тем не менее, этот метод имеет несколько присущих недостатков, в том числе потребности в оборудовании (градиентный фракционный и ультрацентрифуг), относительно сложный протокол, который требует обширного устранения неполадок, и вычислительные проблемы не легко обрабатываются неопытным пользователем11. Важно отметить, что рибосомное профилирование в первую очередь применяется к изолированным клеткам в культуре и требует существенного материала, что делает его применение к смешанным тканям клеточного типа или отсортированным клеткам из in vivo ограниченным.
Метод млекопитающих RiboTag, разработанный Sanz et al. в 2009 году13,устраняет ряд проблем, присущих как полисомного, так и рибосомному профилированию. В этом методе, рибосомы связанных РНК могут быть изолированы от конкретных типов клеток, позволяющих для исследования клеточного типа конкретных транслатомов в сложных тканях без дополнительных методов изоляции и специализированного оборудования, как это необходимо в других методах13,14. Основой метода RiboTag является трансгенная модель мыши (RiboTag), несущая модифицированный локус для 60S рибосомного субъемаального белка гена Rpl22. Этот локус(Rpl22-HA) включает в себя флоксс терминал азон с последующим дополнительной копией терминала экзон с поправками, чтобы включить C-терминал гемагглютинин (HA) тег в области кодирования. При пересечении с мышью, выражающей клеточную cre Recombinase, флоксированный экзон удаляется, позволяя выражение HA-тегами RPL22 в клеточном порядке(рисунок 1). Тег HA может быть использован для иммунопреципитата (IP) рибосом и связанных с ними РНК из выбранного типа клеток.
В дополнение к первоначальной публикации, которая разработала метод, несколько других лабораторий использовали модель RiboTag. Разнообразные ткани, такие как мыши Sertoli и Leydig клетки15, микроглии16, нейроны17,18, ооциты19, и культивированные клетки20 были профилированы и изучены. Хотя этот протокол, безусловно, в состоянии успешно изолировать рибосомы и связанные с ними РНК через различные типы тканей Есть еще области, нуждающиеся в улучшении, особенно при применении к мутантным системам. В частности, общая зависимость от свежей ткани приводит к увеличению технических изменений, которые могут значительно уменьшить мощность анализа. Во-вторых, уверенная идентификация дифференциально переведенных целей становится более сложной, когда высокий фон иммунопреципиции происходит отне-Cre рекомбинированных типов клеток, как сообщалось ранее13. В то время как Sanz et al. спроектировали основную предпосылку метода, в этой рукописи лаборатория Снайдера представляет оптимизацию протокола, чтобы уменьшить эти проблемы, делая метод более практичным и эффективным.
Цель этой статьи состоит в том, чтобы объяснить шаги для разведения мышей, выражающих клеток конкретных HA-тегами рибосомы, иммуноподготовки этих рибосом от флэш-замороженных образцов, и очистка их связанных РНК для дальнейшего анализа вниз по течению. По мере того как mammalian мыжская клетка зародыша и изученная мутация неплодородности обеспечивают уникально возможности, усилия были сделаны для того чтобы осветить дороги этот метод можно приспособить к другим системам клетки.
Protocol
Все методы использования и обращения с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Рутгерского университета (IACUC).
1. Разведение мышей
- Порода самок мышей гомозигодляной для РНК связывающей мутации белка, что приводит к мужскому бесплодию (рукопись в подготовке, упоминается в настоящем качестве гена интереса) в трио спаривания с мужчинами hemizygous для Аллеля Stra8-iCre (B6. FVB-Tg (Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Креа),как спаривание двух самок с каждым самцом повышает эффективность размножения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мутант ген интереса (M) был принят матерински, по мере того как женщины homozygous для M имеют нормальную плодородность. Это имеет дополнительное преимущество, позволяя отцовской передачи мужской зародышевой клетки Cre (hemizygous), как рекомендуется21 и оптимизации процентов потомства с желаемой аллельной комбинации. Поскольку гомозиготКрес Крес exhibit зародышевых клеток токсичности22, рекомендуется аллель поддерживаться и передается в гетерозиготном или гемизиготном состоянии. Важно, Cre выражение не должно со-происходить с аллелем Rpl22-HA до экспериментального населения. Неспособность изолировать аллель Rpl22-HA от Cre в разведении животных приведет к потомству, что глобально выразить Rpl22-HA из-за активности зародышевых клеток Cre. Эта проблема характерна для зародышевых клеток. Кроме того, Stra8-iCre специфичен для группы клеток авторов, представляющих интерес22, ориентируясь на клетки, переходят в мейоз и очень рано, включая прелептотены и лептотены. Вместо этого можно использовать другой драйвер Cre, специфичный для другого типа интересов ячейки. Распространенная практика диктует мужской зародышевой клетки, выраженные Крес быть переданы на отцовской стороне. Тем не менее, возможно, материнская передача Stra8-iCre приведет к аналогичному трансгену выражение у мужского потомства. Независимо от схемы размножения выбрано, для того чтобы произвести отродье с эквивалентным Выражениеcre Cre, все экспериментальные образцы должны быть произведены через передачу Cre от такой же родительской стороны (или всегда материнской или всегда отцовской). - Генотип в результате мужчины щенки, как описано в разделе 2.4. Выберите тех, кто несет аллель M и положительный для Cre (Q /M:Cre)) для разведения вниз по течению.
- Порода самок мышей гомозигодляных для M аллель в трио спаривания с мужчинами гомозиготные для Rpl22-HA (B6J.129 (Cg) -Rpl22tm1.1Psam/SjJ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фон Rpl22-HA очень смешанный, поэтому следует проявлять осторожность при оценке финомерных фенотипов. - Генотип в результате женщин ыщения для выявления тех, кто несет аллель M и положительные для Rpl22-HA (Q /M:Rpl22-HA )(см. раздел 2.3). Выберите этих самок для размножения ниже по течению.
- Креста /M: Cre ' мужчины с q /M:Rpl22 "женщины в трио спаривания. Генотип результирующих щенков (см. разделы 2.3 и 2.4) для выявления мужчин, которые являются как Кре, так и Rpl22 и либо дикими, либо M/M.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эта работа фокусируется на мутации, приводящей к полному мужскому бесплодию, в схеме размножения были приняты особые соображения для наиболее эффективного получения желаемых экспериментальных генотипов. Такие соображения могут быть ненужными в других экспериментальных моделях. См Рисунок 2 для полной схемы разведения и сопровождающих легенды для дополнительного обсуждения разведения соображений.
2. Коллекция образцов
- Сбор яичек от мышей мужского пола в 21 дней после родов (dpp).
- Пожертвование мышей CO2 ингаляции с последующим вывихом шейки матки. Сделайте вентральный разрез (3 см) на каждом животном, обрамленном двумя более короткими (по 2 см каждый), соединенными боковыми разрезами. Потяните кожу и перитонеум назад, чтобы выявить яички.
- Используя щипчи, вытяните эпидимальную жировую подушечку с одной стороны полости тела, чтобы выявить эпидидимии и яички. С тенотомией ножницы, акциз яичка, заботясь, чтобы обрезать от эпидидимис, окружающий жир, и любой внешней сосуды. Поместите нетронутые яички в чистую трубку 1,7 мл.
- Повторите с другой стороны, добавив второй яички в первую трубку. Cap эту трубку и сразу же погрузить его в жидкий азот, чтобы флэш-заморозить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть сохранены при -80 градусах Цельсия до использования.
- Соберите дополнительные образцы кончика хвоста для каждого животного (2 мм) для подтверждения генотипирования.
- Чтобы извлечь ДНК, добавьте 100 мкм 50 мм NaOH к кончику хвоста 2 мм в трубке 1,7 мл и кипятите при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Добавить 100 мм HCl и 20 мл 1 M Tris-HCl pH 8.0 и центрифуги образцов в течение 3 мин при 10000 х г. Сохранить супернатант (содержащий геномную ДНК) и хранить извлеченные ДНК при 4 градусах Цельсия до использования в качестве шаблона для следующих генотипийных реакций.
- Выполните Rpl22-HA генотипирования по методу, адаптированному из Sanz et al.13 с использованием следующих грунтовков: вперед: 5' GGGAGGCTGCTGGATG 3'; обратный: 5' TTTCCAGAGAGAGAGGCTAAGTACAC 3'.
- Подготовьте реакционную смесь, состоящую из 2 зЛ ДНК, извлеченной в шаге 2.2.1, 0.08 л 25 мМ dNTPs, 0,1 л 10 мМ передний грунт, 0,1 мМ реверсная грунтовка, 2 qL буфера полимеразной цепной реакции (PcR) (650 мм Tris pH 8,8, 165 мМ (NH4)2SO4, 30 мМ MgCl2, и 0,1% Tween, 0,2 мл L Taq polymerase, и нук-лизh H
- Используйте следующие условия термоциклора: 30 s грунтовка плавления шаг при 95 КС, 30 s anneal при 64 C и 30 с удлинением при 72 градусах Цельсия, повторяется 37 раз с окончательным 5 мин удлинения при 72 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это дало размер продукта 260 bp для образцов wildtype и 292 bp для образцов которые были Rpl22-HA
- Выполните Cre генотипирования с помощью следующих грунтовок: вперед: 5' GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3'; обратный: 5' AGGGACACCATCATGGAGTC 3'. Подготовьте реакцию PCR как описано в шаге 2.3.2 используя primers Cre вместо. Используйте следующие условия термоциклора: 30 s грунтовка плавления шаг при 95 КС, 30 s anneal при 60 c и 15-дюймовый удлинение при 72 градусах Цельсия, повторяется 35 раз с окончательным 5 мин удлинение при 72 градусах По Цельсию.
- Провести ген генотипирования интересов, как это стандартно для гена в вопросе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автор в генотипирования протокол использует концентрированный пользовательский Taq, и как таковой, другие пользователи, возможно, придется изменить условия в соответствии с их ферментативными требованиями. Для того, чтобы лучше понять влияние потери этого гена интереса на перевод, мужчины, которые были либо wildtype или гомозиготные для мутантов аллель интереса, и которые были также Cre и Rpl22 "были отобраны, чтобы быть экспериментальными образцами. Выбор генотипа далее обсуждается выше в разделе 1.
3. Подготовка решений
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка решений и всех последующих шагов должна быть выполнена в строгих условиях.
- Для подготовки буфера гомогенизации (HB) добавьте 2,5 мл 1 М Трис рН 7,4, 5 мл 1 М ККЛ, 600 л 1 М МГКлал2и 500 л NP-40 в трубку 50 мл. Доведите до объема (50 мл) в диэтил-пиробкарбонат (DEPC) H2O и перемешайте до тех пор, пока не будут включены все компоненты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации будут следующими: 50 мМ Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2, и 1% NP-40. - Для подготовки буфера высокой промывки соли (HSWB) добавьте 2,5 мл 1 М Tris pH 7,4, 15 мл 1 М ККЛ, 600 л 1 М MgCl2и 500 л NP-40 в трубку 50 мл. Доведите до объема (50 мл) в DEPC H2O и перемешайте до тех пор, пока не будут включены все компоненты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации будут следующими: 50 мм Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2, и 1% NP-40Протокол может быть приостановлен здесь, и решения могут храниться при комнатной температуре до использования.
4. Подготовка тканей
- Preweigh все пробы труб, запись веса, и precool в жидком азоте.
- Precool стерильный раствор, пестик, и взвешивание шпателя на сухом льду.
- Измельчите флэш-замороженные образцы тканей в мелкий порошок с помощью предварительно охлажденных, стерильный раствор и пестик на сухом льду.
- Поместите флэш-замороженную ткань в предварительно охлажденный раствор на сухой лед. Аккуратно разбить ткани на большие куски с помощью пестика и измельчить медленно, пока ткань мелкого порошка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя свежие ткани также могут быть использованы, в рамках первоначального протокола13, никаких существенных различий в результате наблюдается с использованием флэш-замороженных тканей. Подробности смотрите в результатах и обсуждениях. - Тщательно перенесите пробу грунта в предварительно охлажденную трубку сбора, выскабливая порошок из раствора с помощью предварительно охлажденных шпателем. Убедитесь, что только ткани собраны, а не влаги на хранение на холодный раствор.
- Взвешивание трубки с тканью, заботясь, чтобы держать на сухом льду, когда это возможно. Рассчитайте массу ткани, вычитая первоначальный вес трубки из веса трубки с образцом в нем. Запишите это значение для последующего расчета объемов буфера лисиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, и образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до использования.
- Поместите флэш-замороженную ткань в предварительно охлажденный раствор на сухой лед. Аккуратно разбить ткани на большие куски с помощью пестика и измельчить медленно, пока ткань мелкого порошка.
5. Гомогенизация образца
- Подготовка лизис буфера (10 мл HB и добавки) путем добавления 10 зл и о 1 М дитиотрейтол (DTT), 1 таблетка ингибитора протеазы, 50 qL ингибитора RNase (40 000 единиц/мл), 200 л 5 мг/мл циклогексидида и 100 л 100 мг/мл гепарина до 10 мл HB. Смешайте до тех пор, пока все компоненты не будут включены и держать на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации добавок в 10 мл HB будет следующим: 1 мМ DTT, 200 U/mL RNase ингибитор, 100 мкг /мл циклогексидида, и 1 мг/мл гепарина. Это решение должно быть использовано в течение 24 ч от добавления добавок и может храниться при 4 градусах Цельсия или на льду до использования. - На каждые 100 мг образца добавьте 1 мл буфера из лисиса. С той же пипеткой, используемой для добавления буфера лисиса, тщательно пипетка в результате lysate вверх и вниз, чтобы фрагмент клетки и перемешать. Продолжайте трубацию до тех пор, пока образец не станет вязким, как правило, 25-30 штрихов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку решение очень вязкое на первый, пипетка большого диаметра должна быть использована для смешивания раствора. Стандартный 1000 л, как правило, достаточно для 100 мг ткани. - Установите образцы на льду на 10 мин до лиза. Затем, спина образцов в предварительно охлажденных центрифуги (4 КК) в течение 10 мин при 10000 х г. В нижней части трубки должны образовываться большие, рыхлые, мутные гранулы.
- Стараясь не беспокоить гранулы, соберите лизат в новую трубку и запишите громкость для каждого образца. Для предотвращения дегредариации образцов убедитесь, что образцы остаются прохладными на протяжении всего оставшегося протокола, сохраняя на льду или при 4 градусах по Цельсию, когда это возможно.
6. Равновесие бисера
- Используя объем лисата со ступени 5.2, вычислите необходимый объем магнитных бусинв в сочетании с соответствующим связывающим антителом белком (в данном случае белком G). Для 1 мл лисата используйте 375 л белковых шариков G (30 мг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор конъюгированных шариков будет варьироваться в зависимости от анти-HA антитела используются; например, если кролика генерируемых анти-HA антитела выбран, белок бусы будут предпочтительнее. - Используя магнитную трубку стойки, удалить бисером растворителя и добавить равный объем свежего буфера лисиса в бисер. Поверните 5 мин при 4 градусах по Цельсию для мытья. Выполните все шаги вращения с помощью вращателя трубки скамейки, установленной до 20 об/мин.
- Поместите трубку на стойку магнитной трубки и удалите буфер стирки.
- Повторите шаги 6.1-6.3 еще два раза.
- Добавьте буфер лисиса в исходном объеме к уравновештым бусинкам. Хранить при 4 градусах по Цельсию или на льду до использования.
7. Предварительная клиринговая проба
- Добавьте 50 юаней равновесных бусинок на каждые 1 мл лисата к супернатанту лизои (лизат) и поверните при 4 кв. м на 1 ч.
- Поместите трубку на магнит стойку и собирать lysate в свежую трубку. Отбросьте использованные бусы.
- К лисату добавить 25 л равновесных бусин ок на каждые 1 мл и повернуть при 4 кв. м на 1 ч. Храните оставшиеся уравновешие бусы белка G при 4 градусах Цельсия за одну ночь.
- Поместите трубку на магнитную стойку и соберите лизат в свежую трубку. Отбросьте использованные бусы. От очищенного лизата, сохраните 50 Зл, чтобы действовать в качестве элемента контроля входных данных. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Входный образец действует как контроль, представляющий общую популяцию РНК образца, включая РНК, связанные с другими типами клеток в ткани, которые будут использоваться во время анализа вниз по течению для коррекции изменений экспрессии генов как функции мутации.
8. Инкубация антител
- На каждые 1 мл очищенного лизата добавьте 5 мкг анти-HA антитела. Чтобы предотвратить потерю образца, запечатайте крышку трубки лабораторной пленкой. Поверните образцы 16-18 ч при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации антител и концентрация не были оптимизированы. Авторы обнаружили, что ночной инкубации с 5 мкг достаточно; однако, вполне возможно, что более короткая инкубация или меньше антитела будут адекватными, или что более длительная инкубация или больше антител улучшит связывание.
9. Инкубация бисера
- На каждые 1 мл очищенного лисата добавьте 300 л белка G шариков. Запечатать трубную крышку лабораторной пленкой и повернуть в течение 2 ч при 4 градусах Цельсия.
10. Мытье бисера
- Поместите образец трубки на магнит стойку, чтобы бисер отделиться от IPed lysate. Пипетка от потока через лизат и отбросить, сохраняя бисер.
- Нанесите 800 л HSWB на бисер и дайте повернуть в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Поместите образец трубки на магнит стойку и позволяют бисера отделитьот от мытья. Удалите и сбросьте смыть.
- Нанесите еще 800 л HSWB на бисер. Закройте образец и дайте повернуть сяпоните в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Поместите образец трубки на магнит стойку и позволяют бисера отделитьот от мытья. Удалите и сбросьте смыть.
- Повторите шаг 10.3 еще раз.
11. Добыча РНК
- Поместите образец трубки на магнит стойку и позволяют бисера отделитьот от мытья. Пипетка снимите и откажитесь от мытья, сохраняя бусы для извлечения РНК. Добавьте 3,5 л из 14,2 М бета-меркаптоэтанола (bME) в бисер и перемешайте путем вихря в течение 15 с.
- Извлекайте РНК с помощью коммерческого комплекта для очистки РНК, в том, что касается инструкций производителя. Элуте образца в 30 Зл RNase бесплатно H2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя 10 Л / образец DNase лечение является необязательным для большинства комплектов, это настоятельно рекомендуется. Этот дополнительный шаг очистки значительно снижает фон, что позволяет более точной конечной концентрации. Это сильно recommened использовать комплект, который содержит бета-меркаптоэтанол (bME) в буфере лизиса. bME действует как дополнительный ингибитор RNase для предотвращения деградации образцов во время изоляции РНК. - Храните образец при -80 градусах по Цельсию или немедленно проанализируйте.
12. Количественная оценка и анализ выборки
- Используя уф-вис спектрофотометр, количественное измерение концентрации РНК и предварительного качества.
- Анализ качества РНК, извлеченных из образцов с помощью биоанализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная РНК может быть использована для РНК-секвенирования или других анализов вниз по течению, таких как северный промотирующий сяртинг или количественная обратная транскрипция PCR (qRT-PCR).
Representative Results
Предыдущие доклады предложили неспецифических иммунопреципиции из клеток, не хватает Cre14. Для того, чтобы определить, если это было так в нашем измененном протоколе, эффективность ИС была определена в образцах, полученных от животных, перевозящих как Cre и Rpl22-HA и животных, перевозящих только один, но не другой в надежде, что без как Cre-драйвери Rpl22-HA, иммунопрогифицированной РНК должна быть минимальной. Как показано на рисунке 3, очень мало РНК изолирована от образцов, не хватает либо Cre или Rpl22-HA, демонстрирующих эффективность этого протокола для уменьшения ФОНа ИС и изолировать подлинные HA-тегами рибосомных РНК. Кроме того, как Cre-только и Rpl22-HA-толькообразцы представляют подходящий отрицательный контроль.
Учитывая потенциал для источника реагентов, чтобы существенно повлиять на эффективность ИС, ряд антител и протоколов изоляции РНК были протестированы(рисунок 4) в Cre и Rpl22-HA положительных образцов. Эти результаты показывают, что выбор реагентов может оказать значительное влияние на эффективность ИС, поэтому любые изменения в выборе реагентов должны быть сделаны с осторожностью.
Для того, чтобы проверить этот протокол в контексте РНК связывающего белка мутант, дикий тип-Cre'Rpl22-HA (дикий тип) и ген интереса-/--Cre'Rpl22-HA » (Ген интерес-/-) тестбыли для эффективности системы RiboTag, чтобы изолировать рибосому связанных РНК (Рисунок 5). Когда концентрация РНК ввода дикого типа и ИС сравнивалась с геном интереса-/- ввод и ИС, между генотипами не наблюдалось существенной разницы. Для обоих генотипов, однако, концентрация входных данных была значительно выше, чем концентрация ИС, что свидетельствует о том, что в входная проба была больше РНК(рисунок 5В). Этот результат ожидается, так как не все мРНК, присутствующие в клетке, связаны с рибосомой в любой момент времени, особенно в случае зародышевых клеток, где РНК могут быть транскрибированы задолго до их перевода.
Для подтверждения качества образцов РНК, отправленных для секвенирования, пробы запускались на биоанализаторе. Номера целостности РНК (RINs), обычно рассчитанные как соотношение пиков 28S и 18S rRNA, были сопоставлены в разных образцах. В общем объеме РНК-пулов значения RIN, как ожидается, будут близки к 10 с более высоким RIN, что коррелирует с более высокой достоверностью и качеством взятых на себя образцов. Хотя образцы ИС имели более низкий RIN, чем входные данные, RINs все еще находились в пределах приемлемого диапазона и не зависели от генотипа образцов(рисунок 5C). Снижение значений RIN для образцов IPed, вероятно, является результатом деградации РНК, хотя и очень незначительным, учитывая относительно небольшое снижение средней длины нуклеотидов анализируемых РНК. С учетом продолжительности протокола и температуры, необходимых для иммунопротебова, ожидается некоторое ухудшение. Возможно также, что уменьшенная длина РИН и РНК является функцией обогащения для видов, не относящихкся к РНК, таких как мРНК.
Рисунок 1: Метод RiboTag. Предпосылка метода биологически проста. Новый Exon 4 вставляется в последовательность для локуса Rpl22 вниз по течению от оригинального Exon 4. В присутствии драйвера Cre, loxP сайтов по обе стороны от первоначального Exon 4 вырезать, иссечение флоксированный экзон. HA-tagged Exon 4 теперь включен в Rpl22 mRNA, генерируя HA помеченный RPL22 в клетках, выражающих CRE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема размножения образцов для мышей RiboTag. Показана схема размножения, используемая для создания экспериментальных животных. Была использована двухсторонная схема. В поколении 1 были созданы два параллельных набора селекционеров трио. Одна сторона совмещала аллель интереса (снесенная матерински по мере того как эта специфическая перегласовка приводит к в мыжом неплодородности) с hemizygous Cre и с другой совмещая аллель интереса, снова снесено матерински, с Rpl22-HA. Затем, в поколении 2, мужчины из первого спаривания, которые несут аллель интереса и Cre перечеркивают на женское потомство второго спаривания, которые несут аллель интереса и Rpl22-HA. Определены генотипы полученного потомства и выбраны экспериментально соответствующие животные (в данном случае либо дикий тип, либо гомозигоусный мутант, несущий как аллели Cre, так и Rpl22-HA). Важно отметить, для зародышевых клеток, выражающих Cre-драйверов, Cre и Rpl22-HA аллели не должны размножаться вместе до экспериментального поколения. Воздействие аллеля Rpl22-HA на зародышевые клетки выраженные Cre в разведении поколений будет управлять зародышевой клетки Rpl22-HA иссечение. Любое полученное потомство будет глобально выражать Rpl22-HA, таким образом предотвращая клеточную изоляцию рибосом. В описанной в настоящем проекте системе n q 4 на генотип обеспечиваетдостаточную статистическую мощность для анализа ниже по течению. Биологическое число репликации должно быть определено для каждой экспериментальной системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Подтверждение отрицательного контроля. Образцы, которые Cre и Rpl22-HA' показывают более высокий вытягивание РНК, чем образцы, которые Cre или Rpl22-HA ' в одиночку. Существует никакой существенной разницы между Cre и Rpl22-HA' образец РНК вытягивания эффективности, что свидетельствует о том, что образцы не хватает либо Cre или Rpl22-HA являются подходящими отрицательными элементами управления. В "Я" указывается, что в этих образцах присутствовал соответствующий аллель или трансген, и "-" означает его отсутствие. IP/input представляет собой соотношение РНК иммунопреципицитированных (IP) над общей (вводной) РНК. Значение, рассчитанное по концентрации в нанограммах. - означает p zlt; 0025. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Реагенты влияют на успех протокола. (A) Flash замороженных тканей приводит к иммунопреципции эффективности похож на свежие ткани. (B) эффективность IP для 2 коммерчески антител были определены, обозначены как Антитела 1 и Антитела 2(Таблица материалов). При тестировании, Антитела 1 был более эффективным при потянув вниз РНК, чем антитела 2, которые, как представляется, не в состоянии различать отрицательные (не выражая ни Cre или Rpl22-HA) и положительные элементы управления (выражение как Cre и Rpl22-HA )). Точки, свидетельствуют о соотношении IPed и входно-РНК для отдельных биологических репликаций. (C) Когда комплекты извлечения РНК (Таблица материалов) были сравнены, Комплект 2 значительно превзошел Kit 1. Хотя оба комплекта IPed аналогичное количество РНК от отрицательного контроля, Kit 2 привело к значительно более высокой доходности РНК из положительных образцов. - указывает на p qlt; 0,05,. р.; 0,025, п.л.; 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Применение метода к модели мутантов. (A) Образец генотипа подтверждения интереса через западное blotting используя изготовление таможни в-домашнее антитело против гена протеина интереса демонстрирует ген интереса-/- (M/M) мужчины не сумеют произвести associated протеин. GAPDH показан как контроль нагрузки. (B) Графический биоанализатор выход из парных входных и IPed образцов для диких типов и мутантов. (C) Сравнение rnA-группцелостности (RIN) по типу образца и генотипу. (D) Средняя нуклеотидная длина видов РНК, анализируемых биоанализатором по типу образца и генотипу. - указывает на p qlt; 0,05, qs p lt; 0,025, р-р; 0,01, N.S. не значительный. N - 4 за генотип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Пример подтверждения драйвера Cre. Количественная оценка гена, переведенного на ранних стадиях развития зародышевых клеток(Stra8) и двух генов, переведенных в конце в развитии зародышевых клеток(Tnp1 и Prm1), проанализированная qRT-PCR из РНК иммунопреципитивом от RPL22-HA, движимой двумя различными зародышевыми клетками Cres, Stra8-iCre (выражена в начале развития зародышевых клеток) и Hspa2-Cre (выраженная позже в процессе развития). Здесь, HA-IP Stra8 достигается с раннего водителя зародышевой клетки Cre, но не с более поздним драйвером зародышевой клетки Cre, демонстрирующей клеточную специфичность иммунопреципиции. В отличие от этого, HA-IP стенограммы переведены в конце зародышевых клеток достигается как Stra8-iCre и Hspa2-Cre. Это, как ожидается, как клетки, которые выражают Stra8-iCre будет генерировать HA-тегами RPL22 на протяжении всей их развития в то время как те, выражающие Hspa2-Cre будет делать это только в течение более поздних частей их развития. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Понимание транслатома определенного типа клеток имеет неоценимое значение для более точного понимания физиологии клетки в нормальном или мутантном состоянии. Особая польза наблюдается в системах, в которых перевод разъединяется от транскрипции, например, в нервной ткани, где перевод происходит очень далеко от транскрипции, или в зародышевых клетках, где транскрипция происходит задолго до перевода. По сравнению с другими методами анализа транслатомов, наибольшее преимущество системы RiboTag происходит от использования системы рекомбиназы Cre. Это позволяет свободно ориентироваться на любую популяцию клеток, которая имеет соответствующий драйвер Cre. Во-вторых, IIP RiboTag, как описано в настоящем документе, является эффективным и гораздо менее технически сложным и трудоемким, чем полисомного или рибосомное профилирование. Наконец, RiboTag IP может быть легко выполнена на скамейке.
В этом протоколе есть ряд важных шагов. Главным из них является создание линии мыши RiboTag и создание экспериментальных животных для изучения. Что касается всех генетических моделей, тщательное отслеживание лиц в колонии мыши, а также тщательного генотипирования протоколы должны быть применены. ПЦР генотипирования в соответствии с Sanz et al. должны включать в себя грунтовки ориентации loxP сайт 5' из дикого типа экзон 4 различать wildtype аллелей (260 bp) и мутант (290 bp)13. Для анализа RiboTag в моделях зародышевых клеток следует соблюдать очень специфические требования к разведению. Во-первых, в случае мутантов, которые приводят к бесплодию, продуманные стратегии разведения должны включать методы оптимизации количества потомства с желаемым генотипом в промежуточных и экспериментальных поколениях. Во-вторых, в случае зародышевых клеток конкретных Cres, следует принимать меры в отношении Cre-zygosity учитывая чувствительность зародышевых клеток Cre токсичности. В зародышевой клетке, высокий уровень белка Cre может иметь вредные эффекты22, запрещая использование Cre / Cre животных в схеме размножения. Наконец, при использовании зародышевой клетки Cres, важно, чтобы изолировать аллель RiboTag от Cre до последнего поколения, как Cre выражение в зародышевой клетке промежуточного поколения приведет к потомству, выражая Rpl22-HA во всем мире.
Независимо от клеточной системы, ряд рекомендуемых элементов управления можно проверить надежность как Cre выражения и специфичности. Правильное выражение вашего Cre и ожидаемое иссечение Rpl22-HA можно определить несколькими методами. В первом, ткани, изолированные от экспериментальных животных могут быть окрашены для HA с помощью либо иммуногистохимии или иммунофлуоресценции15. Этот метод является оптимальным в том, что он не требует априорных знаний переведенных мРНК в типах целевых клеток. Второй метод, пример которого показан на рисунке 6,требует некоторых знаний о переводчески регулируемых сообщениях в типах целевых ячеек. В этом методе обогащение для известной переводно регулируемой мРНК может быть подтверждено выбранным Драйвером Cre,используя количественные ПЦР IPed по сравнению с входиной РНК. Аналогичным образом, надежное выражение Rpl22-HA может быть подтверждено сравнением образцов Cre/Rpl22 (положительный контроль) с cre-/Rpl22 или Cre/Rpl22- образцами, которые действуют как эффективные отрицательные элементы управления (см. рисунок 3). Эти сравнения могут быть сделаны либо по общей IPed РНК или обогащения для известных переводически регулируемых мРНК оценивается qRT-PCR или какой-либо другой количественный метод.
Общие проблемы при исполнении протокола, как правило, становятся очевидными только тогда, когда доходность РНК неожиданно низка яснее или высока. Наиболее распространенной причиной этих сбоев являются неправильные генотипирования лиц. Мы рекомендуем сохранить дополнительную ткань из собранного образца для подтверждения генотипов всех образцов в случае непредвиденных урожаев РНК. После подтверждения следует рассмотреть другие возможности, включая возможность загрязнения RNase или деградации образцов. Тщательное хранение образцов и обработка и обслуживание свободных зон RNase в лаборатории может значительно уменьшить или устранить эти проблемы. Хотя вопросы изоляции РНК являются еще одной потенциальной проблемой в этом протоколе, использование коммерческих комплектов значительно снижает эту проблему, хотя следует позаботиться о том, чтобы они были сохранены как RNase бесплатно и не содержат решений с истекшим сроком годности. Наконец, как и во всех антителах на основе процедур, изменения в партии, условия хранения, концентрации, или даже судоходства имеют потенциал, чтобы негативно повлиять на качество антитела и последующий успех вырубки. В результате, после тщательного и повторного тестирования, мы выбрали наиболее последовательные и эффективные антитела доступны.
Этот протокол содержит два основных изменения по сравнению с другими опубликованными протоколами RiboTag, которые значительно повышают вероятность успеха. Одним из них является возможность использования флэш замороженных тканей, тем самым смягчая любые проблемы, связанные с много, техник, или технические вариации запуска. Образцы могут быть собраны и сохранены, что позволяет изоляцию HA-рибосом ы от всех образцов одновременно, снижая то, что может быть основным источником вариации. Во-вторых, добавление преклирного шага существенно снижает фон, о который сообщают другие пользователи системы RiboTag. Недавно, протокол доклада Sanz et al. указывает на наличие высокого фона из-за обилия рибосомы связанных стенограмм изне-Cre-управляемыхклеток14. Наш протокол устраняет эту проблему, включая предочистный шаг, эффективно устраняя присутствие РНК в образцах ИС.
Как и все системы, следует иметь в виду присущие системе RiboTag ограничения. При использовании нехарактерных драйверов Cre, анализ экспрессии должен быть выполнен до экспериментального производства образца. С точки зрения перевода следует отметить несколько нюансов этого метода. Во-первых, RiboTag не допускает дифференциации между мРНК, готовых к переводу, и теми, кто активно переводит. Таким образом, современные методы, основанные на RiboTag, не позволяют количественно определить эффективность перевода как функцию отдельных мРНК. Если эффективность перевода представляет интерес, она может быть измерена на основе клеточной основе, если метод RiboTag сочетается с другими инструментами анализа транслатомов, такими как полисомное профилирование. Во-вторых, принципиально важно учитывать общие изменения изобилия РНК, вытекающие из индивидуальной или генотипной зависимости дисперсии. Именно по этой причине тщательная изоляция входной РНК сопровождает иммунопрециционные пробы, а образцы, полученные из каждого из них, остаются в паре на протяжении всех анализов вниз по течению. Наконец, и что касается анализа на основе RiboTag, следует помнить, что связь с рибосомой не обязательно доказывает перевод. Следует проводить вторичные методы анализа для подтверждения трансляционного регулирования целевых показателей, представляющих интерес.
Этот протокол описывает изоляцию рибосомных РНК от зародышевых клеток мышей мужского пола с использованием модели RiboTag. Не учитывая разведение мышей и сбор проб, протокол занимает два дня, с трех часов в первый день, лучше всего сделать во второй половине дня, ночная инкубация, а затем пять часов работы последующее утро. Настоятельно рекомендуется заранее готовить биржевые растворы (HB и HSWB), а также шлифовку тканей. Общий успех протокола зависит от правильного генотипирования и строго без RNase условий. Способность исследовать транслатом конкретных типов клеток позволит будущим исследованиям лучше понять взаимосвязь между транскрипцией, переводом и протеомом в бесчисленных типах клеток и мутантных фонах.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована грантом NIH NICHD R00HD083521 для EMS и внутренней поддержкой от Ратгерского университета до EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
