Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Genetics, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

Abstract

אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות כמעט על ידי כל התאים ומופרשות בכל הנוזלים הביולוגיים. שיטות רבות פותחו לבידוד שלפוחיות אלה, כולל אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. עם זאת, לא כולם מתאימים לטיהור ואפיון אקסוזום בקנה מידה גדול. להלן פרוטוקול לביסוס תרביות של פיברובלסטים ראשוניים שבודדו משרירי השלד של עכברים בוגרים, ולאחר מכן טיהור ואפיון של אקסוזומים מתרבית של תאים אלה. השיטה מבוססת על שימוש בשלבי צנטריפוגה רציפים ולאחריהם שיפועי צפיפות סוכרוז. טוהר התכשירים האקסוזומליים מאומת לאחר מכן על ידי ניתוחי כתמים מערביים באמצעות סוללה של סמנים קנוניים (כלומר, Alix, CD9 ו- CD81). הפרוטוקול מתאר כיצד לבודד ולרכז אקסוזומים ביו-אקטיביים עבור מיקרוסקופ אלקטרונים, ספקטרומטריית מסות וניסויי ספיגה עבור מחקרים פונקציונליים. ניתן בקלות להגדיל או להקטין אותו ולהתאים אותו לבידוד אקסוזום מסוגי תאים, רקמות ונוזלים ביולוגיים שונים.

Introduction

אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות הטרוגניות שגודלן נע בין 30-150 ננומטר. הם שחקני מפתח מבוססים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בהתחשב בתפוצה שלהם בכל מקום ברקמות ואיברים 1,2. אקסוזומים נושאים מטען מורכב של חלבונים, ליפידים, סוגי דנ"א וסוגי רנ"א, המשתנים בהתאם לסוג התאים שמהם הם נגזרים 1,2,3. אקסוזומים מועשרים בחלבונים בעלי תפקידים שונים (כלומר, טטרספאנינים, כולל CD9 ו- CD63) אחראים לאירועי היתוך. לדוגמה, חלבוני הלם חום HSP70 ו- HSP90 מעורבים בקשירת אנטיגן והצגתו. בנוסף, Alix, Tsg101 ושייטת משתתפים בביוגנזה ושחרור אקסוזומים, ונמצאים בשימוש נרחב כסמנים של ננו-שלפוחיות אלה 2,3,4.

אקסוזומים מכילים גם מגוון של רנ"א (כלומר, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א ריבוזומלי) שניתן להעביר לתאים מקבלים, שם הם משפיעים על איתות במורד הזרם3. בהיותה מוקפת בקרום יחידה אחת, פעילות ביולוגית אקסוזום תלויה לא רק במטען של חלבונים וחומצות גרעין, אלא גם ברכיבי שומנים של הממברנה המגבילה1. ממברנות אקסוזומליות מועשרות בפוספטידיל-סרין, חומצה פוספטידית, כולסטרול, ספינגומיילין, חומצה ארכידונית וחומצות שומן אחרות, שכולם יכולים להשפיע על יציבות האקזוזום ועל טופולוגיית הממברנה 2,3. כתוצאה מסידור המטען והשומנים, אקסוזומים יוזמים מסלולי איתות בתאים קולטים ומשתתפים בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של רקמות 1,2,4,5. בתנאים פתולוגיים מסוימים (כלומר, ניוון עצבי, פיברוזיס וסרטן), הם הוכחו כמעוררים ומפיצים גירויים פתולוגיים 4,6,7,8,9,10,11.

בשל יכולתם להפיץ אותות לאתרים שכנים או מרוחקים, אקסוזומים הפכו לסמנים ביולוגיים יקרי ערך לאבחון או פרוגנוזה של מצבי מחלה. בנוסף, אקסוזומים שימשו באופן ניסיוני ככלי רכב של תרכובות טיפוליות 2,12. היישום הפוטנציאלי של ננו-שלפוחיות אלה במרפאה הופך את שיטת הבידוד לחשובה יותר ויותר על מנת להשיג תפוקה מרבית, טוהר ויכולת שחזור. טכניקות שונות לבידוד אקסוזומים פותחו ויושמו. באופן כללי, ניתן לבודד אקסוזומים ממדיה מותנית של תרביות תאים או נוזלי גוף על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ולכידת מערכת החיסון (באמצעות ערכות מסחריות). לכל גישה יתרונות וחסרונות ייחודיים שנדונו בעבר 1,2,13,14.

הפרוטוקול המתואר מתמקד ב 1) בידוד ותרבית של פיברובלסטים ראשוניים משריר גסטרוקנמיוס עכבר בוגר 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים המשתחררים למדיום התרבית על ידי תאים אלה. פרוטוקול מבוסס היטב לבידוד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים למחקרים פונקציונליים חסר כיום. פיברובלסטים ראשוניים אינם מפרישים כמויות גדולות של אקסוזומים, מה שהופך את תהליך הבידוד והטיהור למאתגר. פרוטוקול זה מתאר טיהור של כמויות גדולות של אקסוזומים טהורים מנפחי תרבית גדולים תוך שמירה על שלמותם המורפולוגית ופעילותם התפקודית. אקסוזומים מטוהרים המתקבלים מתווך מותנה שימשו בהצלחה בניסויי קליטה חוץ גופית כדי לגרום למסלולי איתות ספציפיים בתאים המקבלים. הם שימשו גם לניתוח פרוטאומי השוואתי של מטענים אקסוזומליים מדגימות ביולוגיות מרובות4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי בית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת פתרונות ומדיה

  1. הכן את תמיסת העיכול על-ידי ערבוב של 15.4 מ"ל PBS עם 2.5 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל קולגנאז P (ריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל), 2 מ"ל של 11 U/mL dispase II (ריכוז סופי של 1.2 U/mL), ו-100 μL של 1.0 M CaCl2 (ריכוז סופי של 5 mM).
  2. הכן 500 מ"ל של פיברובלסטים ראשוניים בינוניים (DMEM מלא) על ידי ערבוב 440 מ"ל של DMEM עם 50 מ"ל של FBS (10%), 5.0 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (100 U / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) ו 5.0 מ"ל של תוסף גלוטמין (2 מ"ל). סנן וחטא את המדיום באמצעות מסנן ואקום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר.
  3. הכינו סרום נטול אקסוזום על ידי אולטרה-צנטריפוגה בת לילה של FBS בצינורות פוליפרופילן של 38.5 מ"ל ב-100,000 x גרם ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש.
  4. הכן 500 מ"ל של מדיום ללא אקסוזום על ידי ערבוב 440 מ"ל DMEM עם 50 מ"ל של סרום ללא אקסוזום (10%), 5 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (100 U / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל), ו 5 מ"ל של תוסף גלוטמין (2 מ"ל). סנן וחטא את המדיום באמצעות מסנן ואקום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר.
  5. הכן 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4) על ידי המסת 6.057 גרם של בסיס Tris ב 90 מ"ל של dH 2 O והתאמתה- pH ל 7.4 עם HCl. כוונן את עוצמת הקול ל 100 מ"ל עם dH2O.
  6. הכן 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2 solution (תמיסת עבודה סוכרוז) על ידי ערבוב 97.9 מ"ל של dH 2 O עם 2 מ"ל של 0.5 M Tris-HCl (pH = 7.4) ו- 100 μL של 1 M Mg(Ac)2. הוסיפו מעכבי פרוטאז לתמיסה ממש לפני השימוש ושמרו את התמיסה על קרח.
  7. הכינו תמיסות שיפוע צפיפות סוכרוז על קרח לפי טבלה 1. פתרונות אלה מספיקים כדי להכין שני צינורות שיפוע סוכרוז.
  8. מכינים 100% TCA על ידי הוספת 40 מ"ל של dH2O עד 100 גרם אבקת TCA ומערבבים עד להמסה מלאה. כוונן את עוצמת הקול הסופית עם dH2O עד 100 מ"ל.
  9. להכין 80% אתנול על ידי ערבוב 20 מ"ל של dH2O עם 80 מ"ל של 100% אתנול.
  10. הכן את מאגר הריצה של הכתם המערבי על ידי ערבוב 1.8 ליטר של dH2O עם 200 מ"ל של חיץ ריצה 10x.
  11. הכן את מאגר העברת הכתם המערבי על ידי ערבוב 1.4 ליטר של dH2O עם 200 מ"ל של מאגר העברה 10x ו- 400 מ"ל מתנול. מצננים מראש את מאגר ההעברה ל-4°C.
  12. הכן 20x Tris-buffered מלוחים (TBS) על ידי המסת 122 גרם של בסיס Tris ו 180 גרם של נתרן כלורי ב 850 מ"ל של dH2O (pH 8.0). כוונן את עוצמת הקול ל- 1 L עם dH2O.
  13. הכן חיץ חוסם על ידי המסת 5 גרם חלב יבש ללא שומן עם 1 מ"ל של 10% Tween-20, 5 מ"ל של 20x TBS, ו 94 מ"ל של dH2O.
  14. הכן מאגר נוגדנים על ידי המסת 3 גרם של BSA עם 1 מ"ל של 10% Tween-20, 5 מ"ל של 20x TBS, ו 94 מ"ל של dH2O.
  15. הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב 100 מ"ל של 20x TBS ו-20 מ"ל של 10% Tween-20 (10x) עם 1.88 ליטר של dH2O.
  16. הכן את תמיסת הפיתוח על-ידי ערבוב נפח 1 של לומינול/שיפור עם נפח אחד של חיץ מי חמצן יציב.

2. דיסקציה של שריר העכבר גסטרוקנמיוס (GA)15,16

  1. הכינו צינורות של 50 מ"ל המכילים PBS של 10 מ"ל על קרח.
  2. הרדימו את העכברים בתאCO2 ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
  3. הסר את שריר הגסטרוקנמיוס משתי הרגליים והעבר אותם לצינור עם PBS על קרח.
    הערה: הסר את שריר הסולאוס משריר GA לפני העברת שריר GA ל- PBS.

3. בידוד ותרבית פיברובלסטים ראשוניים של עכבר

  1. שוקלים את השרירים ומעבירים אותם לצלחת של 10 ס"מ מתחת למכסה מנוע בטיחות ביולוגית. טוחנים את השרירים באזמלים עד שהוא הופך לעיסה דקה.
  2. מעבירים את משחת השרירים הטחונה דק לצינור של 50 מ"ל ומוסיפים לצינור 3.5x רקמת נפח/מ"ג של תמיסת עיכול ודגרים במשך 45 דקות ב-37°C. מערבבים היטב את המתלה עם צינור 5 מ"ל כל 10 דקות (זה יעזור לדיסוציאציה מוחלטת).
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במפיץ רקמות לשלב זה.
  3. הוסף 20 מ"ל של DMEM להשלים את השעיית התא כדי להשבית את פתרון העיכול. מעבירים למסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר המונחת על צינור 50 מ"ל. אסוף את הזרימה ושטוף את מסננת התא עם 5 מ"ל נוספים של DMEM מלא.
  4. צנטריפוגו את מתלה התא ב-300 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות והוציאו בזהירות את הסופרנטנט.
  5. להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל של DMEM להשלים ולזרוע את התאים לתוך צלחת 10 ס"מ.
  6. תרבית את התאים ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2 (מעבר 0 או P0).
    הערה: 1) תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O 2 בשרירי השלד היא סביב2.5%)17. 2) מספר המעבר (למשל, P0) של תרבית תאים הוא תיעוד של מספר הפעמים שהתרבית עברה תת-תרבית. 3) פיברובלסטים ראשוניים ב-P0 מתורבתים באופן שגרתי עד 100% מפגש פלוס יום אחד (ורק עבור P0). זאת כדי לטהר סוגים אחרים של תאים ולהבטיח שהתאים הנמצאים בתרבית הם רק פיברובלסטים, מרוקנים מתאים מיוגניים על סמך בדיקת מיקרוסקופ. שריר השלד של חיה בוגרת בגיל חודשיים מכיל כ -2% אבות מיוגניים4. בנוסף, אבות מיוגנים בדרך כלל אינם מתחברים למנות הלא מצופות; לכן, הם הולכים לאיבוד במהלך subculturing18,19,20. תאים מיוגניים דורשים תווך שונה (F10) בתוספת 20% FBS וגורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF)18. ב DMEM שלם, פיברובלסטים בינוניים יש קצב התרבות גבוה יותר מאשר תאים מיוגניים, אשר גורם חיסול של תאים מזהמים אלה לפני המעבר הראשון.
  7. שטוף את תאי P0 עם PBS כאשר 100% confluent בתוספת 1 יום. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסיניזציה ודגר ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2 כדי לנתק את התאים. עצור את הפעילות האנזימטית באמצעות 10 מ"ל של DMEM מלא.
  8. צנטריפוגות את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT ו resuspend את הגלולה ב 20 מ"ל של DMEM להשלים זרע לתוך צלחת 15 ס"מ (מעבר 1 או P1). התאים גדלים עד 80%-90% מפגש וניתן להרחיב אותם עד מעבר 3.
    הערה: בהתאם לניסויים במורד הזרם, ניתן להשתמש במעבר 1, מעבר 2 (P2) או מעבר 3 (P3).

4. זריעת תאים ואיסוף מדיום מותנה

  1. שטפו את הפיברובלסטים (P1, P2 או P3) עם 10 מ"ל PBS, הוסיפו 2.5 מ"ל של תמיסת טריפסיניזציה לתאים ודגרו ב-37°C, 5% CO 2, 3% O2. עצור פעילות אנזימטית באמצעות 10 מ"ל של DMEM מלא.
    הערה: לאחר קטע 4, תאים ראשוניים מושלכים ואין להשתמש בהם לניסויים נוספים, מכיוון שהם משנים מאפיינים.
  2. אסוף את התאים והצנטריפוגה ב 300 x גרם ב RT במשך 10 דקות.
  3. השהה מחדש את גלולת התא ב -10 מ"ל של תווך נטול אקסוזום וספור את התאים.
  4. זרעו את התאים ב 1.5-2.0 x 106 תאים לצלחת (15 ס"מ) ודגרו ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2.
  5. אספו את התווך המותנה בין 16-24 שעות בצינורות של 50 מ"ל על קרח.
    הערה: אם התאים אינם חופפים ב-80%, ניתן להוסיף שוב תווך חופשי אקסוזומלי טרי ולאסוף אותו לאחר תקופה נוספת של 16-24 שעות. ניתן לשלב את שני האוספים לעיבוד נוסף.

5. טיהור אקסוזומים באמצעות דיפרנציאל ואולטרה-צנטריפוגה

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורה של 4°C או על קרח. אזנו את הצינור עם צינור מלא במים בעת הצורך.

  1. צנטריפוגה את התווך המותנה ב 300 x גרם במשך 10 דקות להסרת תאים חיים ולהעביר את supernatant לצינור חדש 50 מ"ל.
  2. הסר תאים מתים על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור פוליפרופילן 38.5 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 10,000 x גרם במשך 30 דקות להסרת אברונים, גופים אפופטוטיים, ושברי ממברנה. מעבירים את הסופרנאטנט לשפופרת אולטרה-שקופה בנפח 38.5 מ"ל.
  4. אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות כדי לגלול את האקסוזומים.
  5. בזהירות להשליך את supernatant, משאיר כ 1 מ"ל של מדיום מותנה, ולשטוף את גלולה exosome בנפח כולל של 30 מ"ל של PBS קר כקרח.
  6. צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות בזהירות להשליך את supernatant על ידי pipetting, נזהר לא להפריע גלולה exosomal.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב- PBS קר כקרח (~ 25 μL לכל צלחת של 15 ס"מ) ומדדו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA וקורא מיקרו-צלחות ב- 562 ננומטר.
    הערה: ריכוז החלבון נמדד על ידי דילול 1:2 עם 0.1% Triton-X100 ב-dH2O. התפוקה של אקסוזומים מצלחת של 15 ס"מ (20 מ"ל של תווך מותנה) של פיברובלסטים ראשוניים במפגש של 80% היא ~3-4 מיקרוגרם.

6. אפיון אקסוזומים על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז

  1. טען את שיפוע הסוכרוז בצינור אולטרה-ברור של 13 מ"ל על ידי פיפטציה (מלמטה למעלה) את הדברים הבאים: 1.5 מ"ל של 2.0 מטר, 2.5 מ"ל של 1.3 מטר, 2.5 מ"ל של 1.16 מטר, 2.0 מ"ל של 0.8 מטר ו-2.0 מ"ל של תמיסות סוכרוז 0.5 מטר.
  2. ערבבו 30–100 מיקרוגרם של אקסוזומים עם תמיסת סוכרוז 0.25 מ' וכווננו את הנפח ל-1 מ"ל.
  3. טען בזהירות את האקסוזומים על גבי שיפועים ואולטרה צנטריפוגה את הדגימות במשך 2.5 שעות ב 100,000 x גרם ו 4 ° C.
  4. הסר את הצינורות מהאולטרה-צנטריפוגה והנח אותם על קרח ואסוף שברים של 1.0 מ"ל החל מראש השיפוע. העבר אותם צינורות 1.7 מ"ל על קרח.
  5. הוסיפו 110 μL של 100% TCA לכל צינור, ערבבו היטב ודגרו במשך 10 דקות ב-RT.
  6. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 10,000 x גרם ו RT בזהירות להשליך את supernatant.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של אתנול 80% מקורר מראש ולהשאיר את הדגימות לשטוף במשך 10 דקות ב -20 ° C.
  8. צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם ו-4°C והשליכו את הסופרנטנט.
  9. יבש את הגלולה למשך 10-15 דקות ב- RT והשהה מחדש את הגלולה ב- PBS לניסויים במבחנה. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA או השהה מחדש את הגלולה ישירות ב- 14.5 μL של dH2O, 5 μL של 4x Laemmli buffer ו- 0.5 μL של 1 M DTT עבור ניתוחי כתמים מערביים.

7. זיהוי אקסוזום על ידי ניתוח כתמים מערביים

  1. ערבבו 5-10 מיקרוגרם של אקסוזומים משלב 5.7 עם 5 μL של 4x Laemmli buffer, ו-0.5 μL של 1 M DTT, ולאחר מכן התאימו את הנפח הסופי ל-20 μL עם dH2O. חממו את כל הדגימות, כולל אלה בשלב 6.9, למשך 5 דקות ב-98°C.
  2. יש להעמיס את הדגימות לג'ל 10% TGX ללא כתמים ולהעמיס את סולמות החלבונים בהתאם להמלצות היצרן.
    הערה: בחר את אחוז הג'ל בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון המעניין.
  3. הפעל את הג'ל ב 100 V במשך ~ 1 שעות במאגר ריצה עד צבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל.
    הערה: זמן הפעולה עשוי להשתנות בהתאם לציוד שבו נעשה שימוש או לסוג ולאחוז הג'ל.
  4. דמיינו את הג'ל. תמונות של הג'לים נטולי הכתמים משמשות כבקרת העמסה עבור אימונובלוטים.
  5. העבירו את הג'ל באמצעות קרום PVDF למשך שעה וחצי ב-80 וולט או למשך הלילה ב-30 וולט ב-4°C.
  6. חסום את הממברנות במאגר חוסם למשך שעה אחת ב- RT.
  7. יש לדגור על הממברנות לאיתור נוגדנים ספציפיים (טבלה 2) במאגר נוגדנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם תסיסה.
  8. שטפו את הממברנות בחיץ השטיפה ודגרו על הממברנות עם הנוגדנים המשניים המתאימים (טבלה 2) למשך שעה אחת ב- RT עם תסיסה.
  9. שטפו את הממברנות במאגר הכביסה ודמיינו את הממברנות באמצעות תמיסת פיתוח ומצלמה מבוססת מצלמה. לחלופין, השתמש בסרט רנטגן כדי לפתח את הממברנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאים לטיהור אקסוזומים מכמויות גדולות של מדיום מותנה בצורה חסכונית. ההליך הוא מאוד לשחזור ועקבי. איור 1 מראה תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של אקסוזומים שטוהרו ממדיום התרבית של פיברובלסטים ראשוניים בעכברים. איור 2 מראה את תבנית ביטוי החלבונים של סמנים אקסוזומליים קנוניים, ואת היעדרם של מזהמים חלבוניים ציטוסוליים (LDH) ו-ER (קלנקסין). איור 3 מראה את ההתפלגות של סמנים אקסוזומליים קנוניים (Alix, CD9 ו-CD81) לאחר שיפועים של צפיפות סוכרוז.

Figure 1
איור 1: תמונת TEM מייצגת של אקסוזומים שבודדו ממדיום התרבית של פיברובלסטים ראשוניים של עכברים. מוצגים הגדלים האחידים יחסית של ננו-שלפוחיות אלה. מעבר לקווים שחורים מציינים את קוטר השלפוחיות הבודדות. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימונובלוטים של ליזטים אקסוזומיים שנבדקו עם נוגדנים כנגד סמנים אקסוזומים, ציטוסוליים ו-ER. Alix, CD81, CD9, flotillin1, syndecan1, syntenin1 (exosome), cytosolic (LDH) ו- ER (calnexin) סמנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אקסוזומים מופרדים על-ידי שיפוע צפיפות סוכרוז. שברים בודדים נבדקו בכתם מערבי עם נוגדנים נגד אליקס, CD9 ו-CD81. בהתבסס על תבנית השברים של הסמנים, אקסוזומים משקעים באופן עקבי בשברים 3–6, המתאימים לצפיפויות של 1.096–1.140 גרם/מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סוכרוז (גרם) פתרון עבודה סוכרוז (מ"ל)
2.0 מטר 2.74 4.0
1.3 מטר 2.67 6.0
1.16 מ' 2.38 6.0
0.8 מטר 1.37 5.0
0.5 מטר 0.86 5.0
0.25 מטר 0.26 3.0

טבלה 1: פתרונות שיפוע צפיפות סוכרוז.

נוגדן מארח חברה מספר קטלוגי
CD9 חולדה BD Biosciences 553758
CD81 עכבר סנטה קרוז ביוטכנולוגיות SC-166029
אליקס ארנב מעבדת ד'אזו אליקס
פלוטילין1 עכבר BD Biosciences 610820
סינדקאן1 ארנב לייף טכנולוגיות 36-2900
סינטנין1 ארנב מיליפור/סיגמא AB15272
LDH עז כימקון AB1222
קלנקסין עז סנטה קרוז ביוטכנולוגיות SC-6465
חולדה-HRP חמור ג'קסון אימ. מעבדת Res 112-035-003
עכבר-HRP עז ג'קסון אימ. מעבדת Res 115-035-044
Rabbit-HRP עז ג'קסון אימ. מעבדת Res 111-035-144

טבלה 2: נוגדנים ראשוניים ומשניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעד קריטי לבידוד מוצלח של אקסוזומים מאמצעי התרבות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, הוא הקמה ותחזוקה נכונה של תרביות פיברובלסטים ראשוניים של עכברים משרירי שלד בוגרים. תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O2 בשרירי השלד היא ~2.5%)15. פיברובלסטים ראשוניים ישנו מאפיינים כאשר הם מועברים בתרבית פעמים רבות מדי. לפיכך, מספר מעבר נמוך הוא הכרחי עבור תשואה אקסוזום אידיאלי. אקסוזומים מטוהרים יש להשתמש מיד למטרות ניסיוניות או לשמור קפוא ב aliquots ב -80 ° C עד הצורך. צעד חשוב נוסף בפרוטוקול הוא שימוש בתמיסות סוכרוז המוכנות טריות בכל פעם. מגבלה של השיטה היא שהיא גוזלת זמן, מכיוון שפיברובלסטים ראשוניים אינם מפרישים בדרך כלל כמויות גבוהות של אקסוזומים, כמו תאים מפרישים אחרים. לכן, יש להשתמש בתרבויות גדולות, מה שמביא לעיבוד כמויות גדולות של מדיה מותנית.

היתרון של צנטריפוגה דיפרנציאלית המשמשת כאן הוא שהיא מייצגת גישה ניתנת להרחבה (עד ליטרים) והיא שיטת הבחירה לבודד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים. שיטה חלופית לנפחים גדולים יותר (עד 100 מ"ל לעמודה) היא כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). שיטה זו מהירה ויכולה להפריד חלבונים מאקסוזומים. העמוד אינו פולט אקסוזומים, ולכן נדרשים שלבי ריכוז או צנטריפוגות נוספים. אחד החסרונות של שיטת SEC הוא שהעמודה יכולה להיות סתומה לאורך זמן ולהעמיס יתר על המידה. שיטות עכשוויות אחרות מבוססות על שימוש בכמויות קטנות של נוזלים ביולוגיים (כלומר, שתן, CSF, סרום, פלזמה) וערכות זמינות מסחרית. למרות שערכות אלה מבטיחות יכולת שחזור, הן יקרות ולא תמיד מייצרות תפוקה גבוהה של אקסוזומים טהורים. הפרוטוקול המתואר לטיהור אקסוזום הוא פשוט וניתן ליישם אותו על סוגים שונים של תאים, רקמות ואיברים שלמים, או נוזלים ביולוגיים אחרים בהתאם לצורך הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

אלסנדרה ד'אזו מחזיקה בקתדרה לתכשיטנים לילדים (JFC) בגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH R01GM104981, RO1DK095169 ו-CA021764, קרן אסיזי מממפיס וארגוני הצדקה האמריקניים הלבנוניים הסוריים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm dishes Midwest Scientific, TPP TP93100
15 cm dishes Midwest Scientific TP93150
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific, Pierce 23225
Bovine serum albumin Fraction V Roche 10735094001
CaCl2 Sigma C1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 Eppendorf 022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging system BioRad 12003154
Collagenase P Sigma, Roche 11 213 857 001 100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktail Millipore/Sigma, Roche 11697498001
Criterion Blotter with plate electrodes BioRad 1704070
Criterion TGX stain-free protein gel BioRad 5678034 10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi) BioRad NC0165100
Dispase II Sigma, Roche 04 942 078 001 neutral protease, grade II
Dithiothreitol Sigma/Millipore, Roche 10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles Medium Corning 15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Corning 21-031-CV
Ethanol 200 proof Pharmco by Greenfield Global 111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes Corning 352070
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate reader BMG Labtech
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific, Gibco 35050-061
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Immobilon-P Transfer membranes Millipore IPVH00010
Laemmli sample buffer (4x) BioRad 1610747
Magnesium acetate solution Sigma 63052-100ml
Non-fat dry milk LabScientific M-0842
O2/CO2 incubator Sanyo MC0-18M
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Gibco 15140-122 10,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubes Fisher Scientific, Midwest Scientific AVSC1510 1.7 mL
Protected disposable scalpels Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker 372610
Running buffer BioRad 1610732
Sodium Chloride Fisher Scientific, Fisher Chemical S271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system Millipore S2GPU05RE 500 mL
Sterile cell strainer (70 mm) Fisher Scientific, Fisher brand 22-363-548
Sucrose Fisher Scientific, Fisher Chemical S5-500
SuperSignal west Femto Thermo Fisher Scientific 34096
Thin wall Polypropylene tubes Beckman Coulter 326823
Transfer buffer BioRad 16110734
Trichloroacetic Acid Sigma 91228-100G
Tris base BioRad 1610719
Triton-X100 solution Sigma 93443-100mL
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific, Gibco 12604-013 No phenol red
Tween-20 BioRad #1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM Beckman Coulter A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm) Beckman Coulter 344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm) Beckman Coulter 344058
Water bath Isotemp 220 Fisher Scientific FS220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  2. Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
  3. Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
  4. van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
  5. Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
  6. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  7. Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
  8. Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
  9. Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
  10. Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
  11. Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
  12. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
  13. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
  14. Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
  16. Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
  17. Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
  18. Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
  19. Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
  20. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).

Tags

בידוד אפיון אקסוזומים פיברובלסטים של שרירי השלד שלפוחיות חוץ-תאיות נוזלים ביולוגיים אולטרה-צנטריפוגה אולטרה-סינון כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל טיהור אקסוזום בקנה מידה גדול פיברובלסטים ראשוניים שרירי שלד עכברים בוגרים מדיה תרבותית שלבי צנטריפוגה רציפים שיפועי צפיפות סוכרוז תכשירים אקסוזומליים אנליזות כתמים מערביים סמנים קנוניים (Alix CD9 CD81) מיקרוסקופ אלקטרונים ספקטרומטריית מסות ניסויי קליטה פונקציונלי לימודים
בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van de Vlekkert, D., Qiu, X.,… More

van de Vlekkert, D., Qiu, X., Annunziata, I., d'Azzo, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts. J. Vis. Exp. (159), e61127, doi:10.3791/61127 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter