Summary
Denne protokollen illustrerer 1) isolering og kultur av primære fibroblaster fra den voksne musen gastrocnemius muskel samt 2) rensing og karakterisering av eksosomer ved hjelp av en differensial ultrasentrifugering metode kombinert med sukrose tetthet gradienter etterfulgt av western blot analyser.
Abstract
Eksosomer er små ekstracellulære vesikler frigjort av nesten alle celler og utskilt i alle biologiske væsker. Mange metoder er utviklet for isolering av disse vesiklene, inkludert ultrasentrifugering, ultrafiltrering og størrelsesekskluderingskromatografi. Imidlertid er ikke alle egnet for storskala eksosomrensing og karakterisering. Skissert her er en protokoll for å etablere kulturer av primære fibroblaster isolert fra voksne musskjelettmuskler, etterfulgt av rensing og karakterisering av eksosomer fra kulturmediene til disse cellene. Metoden er basert på bruk av sekvensielle sentrifugeringstrinn etterfulgt av sukrosetetthetsgradienter. Renheten til de eksosomale preparatene valideres deretter ved hjelp av western blot-analyser ved hjelp av et batteri av kanoniske markører (dvs. Alix, CD9 og CD81). Protokollen beskriver hvordan man isolerer og konsentrerer bioaktive eksosomer for elektronmikroskopi, massespektrometri og opptakseksperimenter for funksjonelle studier. Det kan enkelt skaleres opp eller ned og tilpasses for eksosomisolering fra forskjellige celletyper, vev og biologiske væsker.
Introduction
Exosomer er heterogene ekstracellulære vesikler som varierer i størrelse fra 30-150 nm. De er etablerte nøkkelspillere i fysiologiske og patologiske prosesser, gitt deres allestedsnærværende distribusjon i vev og organer 1,2. Eksosomer bærer en kompleks last av proteiner, lipider, DNA-typer og RNA-typer, som varierer i henhold til typen celler som de er avledet fra 1,2,3. Eksosomer er beriket i proteiner som har forskjellige funksjoner (dvs. tetraspaniner, inkludert CD9 og CD63) er ansvarlige for fusjonshendelser. For eksempel er varmesjokkproteiner HSP70 og HSP90 involvert i antigenbinding og presentasjon. I tillegg deltar Alix, Tsg101 og flotillin i eksosombiogenese og frigjøring og er mye brukt som markører for disse nanovesiklene 2,3,4.
Eksosomer inneholder også en rekke RNA (dvs. mikroRNA, lange ikke-kodende RNAer, ribosomale RNAer) som kan overføres til mottakerceller, hvor de påvirker nedstrøms signalering3. Å være omsluttet av en enkelt enhetsmembran, avhenger eksosombioaktivitet ikke bare av lasten av proteiner og nukleinsyrer, men også av lipidkomponenter i begrensningsmembranen1. Eksosomale membraner er beriket i fosfatidylserin, fosfatidsyre, kolesterol, sfingomyelin, arakidonsyre og andre fettsyrer, som alle kan påvirke eksosomstabilitet og membrantopologi 2,3. Som et resultat av last- og lipidarrangementet initierer eksosomer signalveier i mottaksceller og deltar i vedlikehold av normal vevsfysiologi 1,2,4,5. Under visse patologiske forhold (dvs. nevrodegenerasjon, fibrose og kreft) har de vist seg å utløse og forplante patologiske stimuli 4,6,7,8,9,10,11.
På grunn av deres evne til å forplante signaler til nærliggende eller fjerne steder, har eksosomer blitt verdifulle biomarkører for diagnose eller prognose av sykdomsforhold. I tillegg har eksosomer blitt brukt eksperimentelt som kjøretøy av terapeutiske forbindelser 2,12. Den potensielle anvendelsen av disse nanovesiklene i klinikken gjør isolasjonsmetoden stadig viktigere for å oppnå maksimal renhet, renhet og reproduserbarhet. Ulike teknikker for isolering av eksosomer er utviklet og implementert. Generelt kan eksosomer isoleres fra betingede cellekulturmedier eller kroppsvæsker ved differensiell sentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi og immunopptak (ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett). Hver tilnærming har unike fordeler og ulemper som har blitt diskutert tidligere 1,2,13,14.
Den skisserte protokollen fokuserer på 1) isolasjon og kultur av primære fibroblaster fra voksen mus gastrocnemius muskel og 2) rensing og karakterisering av eksosomer frigjort i kulturmediet av disse cellene. En veletablert protokoll for isolering av eksosomer fra primære fibroblaster for funksjonelle studier mangler for tiden. Primære fibroblaster utskiller ikke store mengder eksosomer, noe som gjør isolasjons- og renseprosessen utfordrende. Denne protokollen beskriver rensing av store mengder rene eksosomer fra store kulturvolumer samtidig som deres morfologiske integritet og funksjonelle aktivitet opprettholdes. Rensede eksosomer oppnådd fra betinget medium har blitt brukt med hell i in vitro opptakseksperimenter for å indusere spesifikke signalveier i mottakerceller. De har også blitt brukt til komparative proteomiske analyser av eksosomale laster fra flere biologiske prøver4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer hos mus ble utført i henhold til dyreprotokoller godkjent av St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee og National Institutes of Health retningslinjer.
1. Klargjøring av løsninger og medier
- Tilbered fordøyelsesoppløsningen ved å blande 15,4 ml PBS med 2,5 ml 20 mg/ml kollagenase P (5 mg/ml endelig konsentrasjon), 2 ml 11 E/ml dispase II (1,2 E/ml sluttkonsentrasjon) og 100 μL 1,0 M CaCl2(5 ml endelig konsentrasjon).
- Forbered 500 ml primære fibroblaster medium (DMEM komplett) ved å blande 440 ml DMEM med 50 ml FBS (10%), 5,0 ml penn / streptokokker (henholdsvis 100 U / ml og 100 μg / ml) og 5,0 ml glutamintilskudd (2 mM). Filtrer mediet med et vakuumfilter på 0,22 μm porestørrelse.
- Forbered eksosomfritt serum ved ultrasentrifugering av FBS over natten i 38,5 ml polypropylenrør ved 100 000 x g ved 4 °C og overfør supernatanten til et nytt rør.
- Tilbered 500 ml eksosomfritt medium ved å blande 440 ml DMEM med 50 ml eksosomfritt serum (10 %), 5 ml penn/streptokokker (100 U/ml og 100 μg/ml) og 5 ml glutamintilskudd (2 mM). Filtrer mediet med et vakuumfilter på 0,22 μm porestørrelse.
- Forbered 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) ved å oppløse 6,057 g Tris-base i 90 ml dH 2 O og justere pH til7,4 med HCl. Juster volumet til 100 ml med dH2O.
- Forbered 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) / 1 mM Mg (Ac) 2 løsning (sukrose arbeidsløsning) ved å blande 97,9 ml dH 2 O med 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) og 100 μL av 1 M Mg (Ac)2. Legg proteasehemmere til løsningen like før bruk og hold løsningen på is.
- Klargjør sukrosetetthetsgradientløsninger på is i henhold til tabell 1. Disse løsningene er tilstrekkelige til å fremstille to sukrosegradientrør.
- Klargjør 100 % TCA ved å tilsette 40 ml dH2O til 100 g TCA pulver og bland til det er helt oppløst. Juster det endelige volumet med dH2O til 100 ml.
- Forbered 80% etanol ved å blande 20 ml dH2O med 80 ml 100% etanol.
- Forbered western blot running buffer ved å blande 1,8 l dH2O med 200 ml 10x løpende buffer.
- Forbered overføringsbuffer ved å blande 1,4 liter dH2O med 200 ml 10x overføringsbuffer og 400 ml metanol. Forkjøl overføringsbufferen til 4 °C.
- Forbered 20x Tris-bufret saltvann (TBS) ved å oppløse 122 g Tris-base og 180 g natriumklorid i 850 ml dH2O (pH 8,0). Juster volumet til 1 L med dH2O.
- Forbered blokkeringsbuffer ved å oppløse 5 g fettfri tørr melk med 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS og 94 ml dH2O.
- Forbered antistoffbuffer ved å oppløse 3 g BSA med 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS og 94 ml dH2O.
- Forbered vaskebuffer ved å blande 100 ml 20x TBS og 20 ml 10% Tween-20 (10x) med 1,88 L dH2O.
- Forbered utviklingsløsning ved å blande 1 volum luminol / forsterke med 1 volum stabil peroksidbuffer.
2. Disseksjon av gastrocnemius (GA) musemuskel15,16
- Klargjør 50 ml tuber inneholdende 10 ml PBS på is.
- Avlive musene i et CO2 -kammer etterfulgt av cervikal dislokasjon.
- Fjern gastrocnemius muskelen fra begge bena og overfør dem til røret med PBS på is.
MERK: Fjern soleusmuskelen fra GA-muskelen før du overfører GA-muskelen til PBS.
3. Mus primær fibroblast isolasjon og kultur
- Vei musklene og overfør dem til en 10 cm tallerken under en biosikkerhetshette. Hakk musklene med skalpeller til det blir en fin pasta.
- Overfør finhakket muskelpasta til en 50 ml tube og tilsett 3,5x volum/mg vev av fordøyelsesoppløsning til tuben og inkuber i 45 minutter ved 37 °C. Bland suspensjonen grundig med en 5 ml pipet hvert 10. minutt (dette vil hjelpe til med fullstendig dissosiasjon).
MERK: Alternativt kan en vevsdissosiator brukes til dette trinnet. - Tilsett 20 ml DMEM komplett til cellesuspensjonen for å inaktivere fordøyelsessystemet. Overfør til en 70 μm nyloncellesil plassert på et 50 ml rør. Samle gjennomstrømningen og vask cellesilen med ytterligere 5 ml DMEM komplett.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g ved romtemperatur (RT) i 10 minutter og fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender pelleten i 10 ml DMEM komplett og frø cellene til en 10 cm tallerken.
- Dyrkning av cellene ved 37 °C, 5% CO2, 3%O2 (passasje 0 eller P0).
MERK: 1) Disse kulturene må opprettholdes på et lavt oksygennivå for å sikre fysiologisk-lignende forhold (O2-nivå i skjelettmuskulatur er rundt 2,5%)17. 2) Passasjenummeret (f.eks. P0) til en cellekultur er en oversikt over antall ganger kulturen har blitt subkulturert. 3) Primære fibroblaster ved P0 dyrkes rutinemessig til 100% konfluens pluss 1 dag (og bare for P0). Dette er for å rense andre typer celler og sikre at cellene som er tilstede i kulturen, bare er fibroblaster, utarmet av myogene celler basert på mikroskopundersøkelse. Skjelettmuskulaturen fra et voksent dyr ved 2 måneders alder inneholder ca 2% myogene progenitorer4. I tillegg festes myogene progenitorer vanligvis ikke til de ubelagte rettene; Derfor går de tapt under subkulturering18,19,20. Myogene celler krever et annet medium (F10) supplert med 20 % FBS og basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF)18. I DMEM komplett har medium fibroblaster en høyere proliferasjonshastighet enn de myogene cellene, noe som resulterer i eliminering av disse forurensende cellene før første passasje. - Skyll P0-cellene med PBS når de er 100% sammenflytende pluss 1 dag. Tilsett 1 ml trypsiniseringsløsning og inkuber ved 37 °C, 5% CO2, 3%O2 for å løsne cellene. Stopp den enzymatiske aktiviteten ved å bruke 10 ml DMEM complete.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 minutter ved RT og resuspender pelleten i 20 ml DMEM komplett og frø til en 15 cm tallerken (passasje 1 eller P1). Cellene dyrkes til 80%-90% samløp og kan utvides til passasje 3.
MERK: Avhengig av nedstrøms eksperimenter kan passasje 1, passasje 2 (P2) eller passasje 3 (P3) brukes.
4. Såing av celler og innsamling av betinget medium
- Vask fibroblastene (P1, P2 eller P3) med 10 ml PBS, tilsett 2,5 ml trypsiniseringsløsning til cellene og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2. Stopp enzymatisk aktivitet ved å bruke 10 ml DMEM komplett.
MERK: Etter passering 4 kasseres primære celler og bør ikke brukes til videre eksperimenter, da de endrer egenskaper. - Samle cellene og sentrifugen ved 300 x g ved RT i 10 minutter.
- Resuspendert cellepelleten i 10 ml eksosomfritt medium og telle cellene.
- Frø cellene ved 1,5-2,0 x 106 celler per tallerken (15 cm) og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2.
- Samle det kondisjonerte mediet mellom 16-24 timer i 50 ml rør på is.
MERK: Hvis cellene ikke er 80% konfluerende, kan friskt eksosomalt fritt medium tilsettes igjen og samles etter en ytterligere 16-24 timers periode. De to samlingene kan kombineres for videre bearbeiding.
5. Rensing av eksosomer ved bruk av differensial og ultrasentrifugering
MERK: Alle trinn utføres ved 4 °C eller på is. Balanser røret med et rør fylt med vann når det trengs.
- Sentrifuger det kondisjonerte mediet ved 300 x g i 10 minutter for fjerning av levende celler og overfør supernatanten til et nytt 50 ml rør.
- Fjern døde celler ved sentrifugering ved 2000 x g i 10 minutter og overfør supernatanten til et 38,5 ml polypropylenrør.
- Sentrifuge supernatanten ved 10 000 x g i 30 minutter for fjerning av organeller, apoptotiske legemer og membranfragmenter. Overfør supernatanten til et 38,5 ml ultraklart rør.
- Ultrasentrifuge supernatanten ved 100 000 x g i 1,5 time for å pelletere eksosomene.
- Kast forsiktig supernatanten, etterlater ca. 1 ml kondisjonert medium, og vask eksosompelleten i et totalt volum på 30 ml iskald PBS.
- Sentrifuge ved 100 000 x g i 1,5 time og kast forsiktig supernatanten ved pipettering, pass på at du ikke forstyrrer den eksosomale pelleten.
- Resuspender pelleten i iskald PBS (~ 25 μL per 15 cm parabolen) og mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA-proteinanalysesettet og en mikroplateleser ved 562 nm.
MERK: Proteinkonsentrasjonen måles ved en 1: 2 fortynning med 0,1% Triton-X100 i dH2O. Utbyttet av eksosomer fra en 15 cm tallerken (20 ml betinget medium) av primære fibroblaster ved 80% sammenløp er ~ 3-4 μg.
6. Karakterisering av eksosomer ved sukrose tetthetsgradient
- Legg sukrosegradienten i et 13 ml ultraklart rør ved å pipettere (nedenfra og opp) følgende: 1,5 ml 2,0 m, 2,5 ml 1,3 m, 2,5 ml 1,16 m, 2,0 ml 0,8 m og 2,0 ml 0,5 m sukroseløsninger.
- Bland 30-100 μg eksosomer med 0,25 M sukroseoppløsning og juster volumet til 1 ml.
- Legg forsiktig eksosomene på toppen av gradientene og ultrasentrifuge prøvene i 2,5 timer ved 100 000 x g og 4 °C.
- Fjern rørene fra ultrasentrifugen og legg dem på is og samle 1,0 ml fraksjoner fra toppen av gradienten. Overfør dem til 1,7 ml rør på is.
- Tilsett 110 μL 100% TCA til hvert rør, bland godt og inkuber i 10 minutter ved RT.
- Sentrifuge i 10 minutter ved 10 000 x g og RT og kast forsiktig supernatanten.
- Oppløs pelleten på nytt i 500 μL forkjølt 80 % etanol og la prøvene vaske i 10 minutter ved -20 °C.
- Sentrifuge i 10 minutter ved 10 000 x g og 4 °C og kast supernatanten.
- Tørk pelleten i 10-15 min ved RT og resuspender pelleten i PBS for in vitro-eksperimenter. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA-proteinanalysesett eller resuspender pelleten direkte i 14,5 μLdH2O, 5 μL 4x Laemmli-buffer og 0,5 μL 1 M DTT for vestlige blotanalyser.
7. Eksosomdeteksjon ved western blot-analyse
- Bland 5–10 μg eksosomer fra trinn 5,7 med 5 μL 4x Laemmli-buffer og 0,5 μL 1 M DTT, og juster deretter det endelige volumet til 20 μL med dH2O. Varm opp alle prøvene, inkludert de i trinn 6,9, i 5 minutter ved 98 °C.
- Legg prøvene i en 10% TGX flekkfri gel og legg proteinstigene i henhold til produsentens anbefalinger.
MERK: Velg prosentandelen av gelen i henhold til molekylvekten av proteinet av interesse. - Kjør gelen på 100 V i ~ 1 time i løpende buffer til lastevæsken er i bunnen av gelen.
MERK: Driftstiden kan variere i henhold til utstyret som brukes eller type og prosentandel av gel. - Se for deg gelen. Bilder av de flekkfrie gelene brukes som lastekontroll for immunblotter.
- Overfør gelen ved hjelp av en PVDF-membran i 1,5 timer ved 80 V eller over natten ved 30 V ved 4 °C.
- Blokker membranene i blokkeringsbuffer i 1 time ved RT.
- Inkuber membranene for spesifikke antistoffer (tab 2) i antistoffbuffer over natten ved 4 °C ved omrøring.
- Vask membranene i vaskebuffer og inkuber membranene med passende sekundære antistoffer (tabell 2) i 1 time ved RT med omrøring.
- Vask membranene i vaskebuffer og avbilde membranene ved hjelp av en løsningsløsning og et kamerabasert bildeapparat. Alternativt kan du bruke en røntgenfilm for å utvikle membranene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen er egnet for rensing av eksosomer fra store mengder betinget medium på en kostnadseffektiv måte. Prosedyren er svært reproduserbar og konsistent. Figur 1 viser transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilde av eksosomer renset fra dyrkningsmediet av primære fibroblaster fra mus. Figur 2 viser proteinuttrykksmønsteret til kanoniske eksosomale markører, og fravær av cytosoliske (LDH) og ER (calnexin) proteinforurensninger. Figur 3 viser fordelingen av kanoniske eksosomale markører (Alix, CD9 og CD81) etter sukrosetetthetsgradienter.
Figur 1: Representativt TEM-bilde av eksosomer isolert fra dyrkningsmedium av primære fibroblaster fra mus. Vist er de relativt ensartede størrelsene på disse nanovesiklene. Over svarte linjer angir diameteren til de enkelte vesiklene. Skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Immunoblotter av eksosomlysater undersøkt med antistoffer mot eksosom-, cytosol- og ER-markører. Alix, CD81, CD9, flotillin1, syndecan1, syntenin1 (eksosom), cytosolisk (LDH) og ER (calnexin) markører. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksosomer atskilt med en sukrosetetthetsgradient. Individuelle fraksjoner ble undersøkt på en western blot med antistoffer mot Alix, CD9 og CD81. Basert på markørenes fraksjoneringsmønster sedimenterer eksosomene konsekvent i fraksjonene 3–6, som tilsvarer tettheter på 1,096–1,140 g/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sukrose (g) | Sukrose arbeidsløsning (ml) | |
| 2,0 M | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 M | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 M | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 M | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 m | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 m | 0.26 | 3.0 |
Tabell 1: Sukrose tetthetsgradientløsninger.
| Antistoff | Vert | Firma | Katalognummer |
| CD9 | Rotte | BD Biovitenskap | 553758 |
| CD81 | Mus | Santa Cruz Bioteknologi | SC-166029 |
| Alix | Kanin | d'Azzo lab | Alix |
| Flotilin1 | Mus | BD Biovitenskap | 610820 |
| Syndecan1 | Kanin | Livssyn | 36-2900 |
| Syntenin1 | Kanin | Millipore/Sigma | AB15272 |
| LDH | Geit | Chemicon | AB1222 |
| Kalnexin | Geit | Santa Cruz Bioteknologi | SC-6465 |
| rotte-HRP | Esel | Jackson Imm. Res Lab | 112-035-003 |
| Mus-HRP | Geit | Jackson Imm. Res Lab | 115-035-044 |
| Kanin-HRP | Geit | Jackson Imm. Res Lab | 111-035-144 |
Tabell 2: Primære og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skritt for vellykket isolering av eksosomer fra kulturmediene, som beskrevet i denne protokollen, er riktig etablering og vedlikehold av primære musfibroblastkulturer fra voksen skjelettmus. Disse kulturene må opprettholdes på et lavt oksygennivå for å sikre fysiologisk-lignende forhold (O2-nivå i skjelettmuskulatur er ~ 2,5%)15. Primære fibroblaster vil endre egenskaper når de passerer i kultur for mange ganger. Derfor er et lavt passasjetall avgjørende for ideelt eksosomutbytte. Rensede eksosomer bør enten brukes umiddelbart til eksperimentelle formål eller oppbevares frosset i alikoter ved -80 °C til det trengs. Et annet viktig skritt i protokollen er bruken av sukroseløsninger tilberedt frisk hver gang. En begrensning av metoden er at den er tidkrevende, fordi primære fibroblaster vanligvis ikke utskiller høye mengder eksosomer, som andre sekretoriske celler. Derfor bør store kulturer anvendes, noe som resulterer i store mengder betingede medier som skal behandles.
Fordelen med differensialsentrifugering som brukes her er at den representerer en skalerbar tilnærming (opptil liter) og er den valgte metoden for å isolere eksosomer fra primære fibroblaster. En alternativ metode for større volumer (opptil 100 ml per kolonne) er size exclusion chromatography (SEC). Denne metoden er rask og kan skille proteiner fra eksosomer. Kolonnen pelletserer ikke eksosomer, så det er nødvendig med ytterligere konsentrasjons- eller sentrifugeringstrinn. En av ulempene med SEC-metoden er at kolonnen kan tettes over tid og overbelastes. Andre aktuelle metoder er basert på bruk av små mengder biologiske væsker (dvs. urin, CSF, serum, plasma) og kommersielt tilgjengelige sett. Selv om disse settene sikrer reproduserbarhet, er de kostbare og produserer ikke alltid et høyt utbytte av rene eksosomer. Den skisserte protokollen for eksosomrensing er enkel og kan brukes på forskjellige typer celler, hele vev og organer eller andre biologiske væsker, avhengig av eksperimentelt behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Alessandra d'Azzo har Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair i genetikk og genterapi. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH-tilskudd R01GM104981, RO1DK095169 og CA021764, Assisi Foundation of Memphis, og American Libanese Syrian Associated Charities.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
