Summary
この手順の目的は、ショ ウジョウバエメラノガスターを用いた神経変性疾患モデルにおけるDLM神経筋接合(NmJ)の構造的完全性を評価するために、後方向縦筋(DLM)組織を解剖することである。
Abstract
ショウジョウバエ は、神経変性疾患に関連するシナプス構造および機能を評価するための有用なモデルとして機能する。ショ ウジョウバエ 幼虫の神経筋接合部(NmJ)に焦点を当てた多くの研究が行われていますが、成人 ショウジョウバエ のシナプス完全性を評価することは、あまり注目を集めていません。ここでは、飛行能力に必要な後頭筋(DM)の解剖のための簡単な方法を提供します。行動読み出しとしての飛行に加えて、この解剖は、DLMシナプスと筋肉組織の両方が、目的のシナプスマーカーまたはタンパク質に対して蛍光標識抗体を使用して構造解析に適することを可能にする。このプロトコルは、老化中の成人 ショウジョウバエ におけるシナプスの構造的完全性の評価を可能にし、ほとんどの神経変性疾患の進行性、年齢依存性の性質をモデル化する。
Introduction
シナプス機能障害は、最も主要な神経変性疾患の最も初期の既知の特徴の一つです1,2,3,4,5,,6.しかし、これらの構造的および機能的障害が疾患進行の後期段階にどのように関連しているかについてはほとんど知られていない。ショウジョウバエは、幼虫のNJ7,8,9を用いてシナプスの成長と開発7,8,9を理解するのに有用なモデルシステムであることが証明されている。しかし、第3の幼虫インスター段階は数日しか続らず、進行性の年齢依存性神経変性を研究する上での有用性を制限する。幼虫NmJを評価する代わりに、10便,,,、11便、11便、12便、13,12個13、14頭、15日、16便に必要なドーサル縦筋(DDLM)に形成されたシナプスのような成体ショウジョウバエのシナプス構造を調べることである。,これらの三種シナプスは、哺乳類シナプス17と同様の方法で構造的に組織され、神経変性疾患のモデルを評価するためのユニークな利点を提供する。
ここでは、神経変性のショウジョウバエモデルにおける成人NmJの構造的完全性を分析するための簡単な方法について説明する。以前のDLM解剖方法および研究は、様々な用途のための筋肉組織を保存することの重要性を強調してきました18,,19,,20,21, 22,,22,23.我々のプロトコルは神経変性疾患を調査するために神経組織および筋肉組織両方を保存するための包括的な方法を提供する。これらの疾患を研究するもう一つの主要な要素は、年齢依存的な方法で神経細胞の喪失を理解する能力です。これまでの研究では,、早期成人期11、12、14、15、16、24,12,14,15に対する変容中にDLM NMJがどのように形成されるのかについて、重要かつ詳細な理解を提供しています。16,24我々のプロトコルは、老化および神経変性疾患における年齢依存的な方法でDLM NmJを調査するために、この研究に基づいて構築する方法を確立する。
Protocol
トランスジェニックハエの発生
- この実験のためにトランスジェニックハエを生成するには、OK371-Gal425処女雌ハエとUAS-TDP-43M337V 26の雄を集め、パッド上のCO2でハエを麻酔して並べ替えます。
- 十字架のための標準的なショウジョウバエ媒体とバイアルに麻酔をしたハエを並べ替えます。次世代が出現するために25°Cでバイアルのラベルを付けます。
注:適切な遺伝子型を確保するために子孫が出現する前にバイアルから大人をクリアします。 - 子孫が出現したら、トランスジェニックハエをバイアルに集め、セックスで並べ替え、実験条件の老化を開始します。
- ハエが集まったら、ハエが生後21日になるまで2日ごとに生鮮食品に移ります。
2. 解剖準備
- 解剖の準備のために、室温リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)、シリコンエラストマーでコーティングされた10cmの解剖皿を得て、 ストレートエッジ解剖用はさみ、鈍解解鉗子の1セット、P200ピペットとピペットチップ、2.0 mLマイクロ遠心分離チューブ、標準的なオフィスハサミ、70%エタノール、6cmペトリ皿、および32%ホルムアルデヒドを1x PBSで4%に希釈した。
- 各遺伝子型または条件にラベルチューブを使用し、各チューブに900 μLの1x PBS(室温)と32%ホルムアルデヒド150 μLを加えます。4%ホルムアルデヒド固定剤を準備する際は、手袋と安全メガネを着用してください。
- 6\u201210は、CO2 とバイアルから直接グループごとにハエを麻酔し、70%エタノールで6cmのペトリ皿に飛びます。プレスは、試料が完全に水没していることを確認するために、ペイントブラシを使用してエタノールに飛びます。これは、外側のキューティクルの油の層を削除します。
3. 胸郭の分離と固定
- 各標本を解剖する前に、約7\u201210 mLの1x PBSをシリコーンエラストマーでコーティングされた解剖皿に加えます。この容積はティッシュサンプルが完全に水没することを保障するべきである。
- 鈍い鉗子を使用して、翼または脚のいずれかを握り、70%エタノールから解剖皿に1つのハエを移します。
- 解剖顕微鏡の下で解剖皿のサンプルを焦点を合わせます。次に、サンプルを1x PBSに沈め、鈍いデュモン#5細かい鉗子を使用して翼を慎重に取り除きます。
- Vannasストレートエッジスプリング解剖はさみを使用して、キューティクルの腹側に小さな切開を作成することによって脚を取り除きます。ステップ3.8では、この切開はホルムアルデヒドが組織に浸透することを可能にする。
- ハサミを片手に持ち、もう一方の手で鉗子を持ってフライ腹側を上に置きます。鈍い鉗子で標本を所定の位置に保持しながら、解剖はさみで頭と腹部を取り除きます。
- ステップ3.2から、変更されたピペットチップを使用して分離された胸郭をラベル付きチューブに移します。
注:固定液に余分な1x PBSを追加しないようにピペットを40 μLに設定します。 - 各標本について、上記の手順 3.2\u20123.6 を繰り返します。
- 室温で30分間サンプルを固定します。
- パスツールピペットを使用して修正を取り除き、ヒュームフードの下の適切な廃棄物容器に捨てます。パスツールピペットを使用して、それぞれ1.5 mLの1x PBSで3回サンプルをすすいでください。わずか750 μLで4回目のすすを完成させ、1x PBSに組織を残します。
注:この時点で、組織サンプルは、次のステップに進む前に、最大3日間4°Cに留まることができます。
4. フラッシュ凍結と胸郭二分
- 二項を開始する前に、適切な凍結保護手袋と安全眼鏡を着用した液体窒素でデュワーフラスコを満たしてください。ブレードブレーカ、羽根刃、細かい鉗子、氷、氷冷1x PBS、極低温ピンセットを1足取ります。
- 1倍のPBSを冷たく保つためにアイスバケツを準備します。
- ブレードブレーカを使用して羽根を斜めにつかみ、ブレードを曲げて小片を壊します。ブレードブレーカは、小さなメスとして使用するためにブレードを所定の位置にロックすることができます。
注: すべてのグループに対して 1 つのブレードが必要です。ブレードが壊れたり、鈍くなったりした場合に切り替えます。 - P200にきれいなピペットチップを加え、サンプルを輸送するために先端の1/5分の1を 取り除きます。
- 各グループに新しいマイクロ遠心チューブを用意し、各チューブに200 μLの1x PBSを加えます。この2番目のチューブは、最終的なDLM準備を収集するために使用されます。
- パスツールピペットを使用してチューブからすべての1x PBSを取り除く。
- 適切な保護具を着用し、極低温ピンセットで10 sの液体窒素フラスコにチューブを沈めます。
注:チューブが爆発しないようにチューブをしっかりと閉じる必要があります。 - 液体窒素からチューブを取り出し、約300 μLの氷冷1x PBSをパスツールピペットでサンプルに加えます。サンプルを氷の上に置いておきなさい。
- シリコンエラストマーでコーティングされた10 cmの解剖皿に氷冷1x PBSを加え、変更された200 μLピペットで最初の胸郭を分配します。
- 胸部腹側を上に置きます。一方では、鈍い鉗子を使用して胸郭を配置し、もう一方では細かい鉗子を使用して胸郭の正中線を露出させるために胸郭神経節の一部を取り除きます。
- 胸郭の正中線をガイドとして使用して、胸郭の1/3rdをブレードrdで浅く切り抜けます。
- 胸郭からブレードを取り外し、鈍い鉗子で45°の角度で胸郭を配置します。ブレードを再挿入し、胸郭の正中線をまっすぐに切ります。これは2つのヘミトレースになります。
- 一度に1つのヘミトラックスを取り、DLM筋線維F(図1B)、最も腹側繊維の下で余分な組織を除去する。ブレードを使用して、1つまたは2つのカットを慎重に行い、DVMを損傷することなく余分な組織を取り除きます。
- 分離したら、1x PBSで正しいチューブにヘミトラックスを移します。
- グループごとに10の解剖されたヘミトレースが作られるまで、ステップ4.6\u20124.14を繰り返します。
5. 構造染色
- 胸郭サンプルを二分した後、組織をブロッキングバッファー(1x PBSは通常のヤギ血清0.1%、トリトンX-100はpH7.4)に入れて組織を透過させ、非特異的な染色を防ぎます。パスツールピペットを使用して余分な1x PBSを除去し、各チューブに1.5mLのブロッキングバッファーを追加します。4°Cで少なくとも1時間の組織をブロックする。
- 蛍光結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ488(抗HRP-488)を希釈して1:200、ファロイジン-647をそれぞれ1:1000の希釈で、運動ニューロンと筋肉組織を染色するためのブロッキングバッファーで、構造染色用サンプルを調製します。チューブあたり150 μLを持つのに十分な汚れを作ります。汚れを汚す準備ができるまで、ホイルで覆われた4°Cまたは暗い箱に汚れを保管してください。
- ブロッキング後、ガラスパスツールピペットで余分なブロッキングバッファーを除去します。
- 構造染色を分配する前に、汚れを渦液にする。各チューブに150μLの汚れを加えます。サンプルを室温で、回転器の暗い箱に2時間置きます。
- 汚れを取り除き、暗い箱のローテーターで5分間0.3%トリトンX-100で部屋温度1x PBSの1.5 mLでティッシュを4回洗います。サンプルをスライドにマウントする準備ができました。
6. 取り付けティッシュ
- PBSTでサンプルを洗浄した後、顕微鏡スライドを調製し、染色用のティッシュを取り付けます。ガラスカバースリップ、P200ピペット、200 μLピペットチップ、はさみ、透明な補強、ストレートエッジ鉗子、アンチフェード蛍光実装メディア、マニキュア、およびスライドを覆うダークボックスを含む追加の供給を準備します。
- スライドにラベルを付けてサンプルを識別し、スライドをスキミをクリーニングして、汚れがないようにします。
- カバースリップでヘミトホラックスのサンプルが破損しないように、補強ラベルを使用して「ブリッジ」を構築します。補強ラベルを1枚取り、半分に切り、各半分を約15mm離します。この距離は、カバースリップの幅よりも小さくなければなりません。この手順を 4 回繰り返して、5 つのラベルの高い「ブリッジ」を完了します。
- P200ピペットを取り、サンプルをスライドに移すために先端の1/5番目 を切り落とすことによって先端を修正します。サンプルはブリッジの中央のスライドに移す必要があります。
- ラボワイプの端を取り、余分なPBSTを取り除きます。鉗子を使用して、すべてのサンプルが筋肉側を上向きにし、キューティクル側を下に向けになるようにDDLを配置します。
- 標準的なP200ピペットチップを使用して、70 μLの取り付けメディアをスライドに塗布し、気泡を避けます。メディアを外側から中心に向けて、援軍の内側の円形パターンで分配します。
- 補強材の上にカバースリップを置きます。
- マニキュアを使用して、カバースリップの周囲の外側の端をコーティングします。組織の完全なシールを形成するために寛大に適用します。
- スライドを暗闇の中で平らな表面に置き、少なくとも10分で乾燥させ、光の漂白や蛍光の損失を防ぎます。スライドは、すぐにイメージングに使用したり、後で見たりするために-20°Cのスライドフォルダに保存したりすることができます。
7. 代替: 一次抗体で染色する
注: このセクションは オプション で、必要に応じてセクション 4 と 5 の間で直接使用する必要があります。
- 一次抗体で組織を染色するには、少なくとも1時間ブロッキング緩衝液中の組織を沈下する。
- ブロッキングバッファーに適切な希釈を備えた一次抗体を調製します。少なくとも、グループあたり150 μLを持つ十分な抗体混合物を調製してください。サンプルはそのまま保持されることに注意してください。4°Cで使用できる状態になるまで保管してください。
- パスツールピペットで余分なブロッキングバッファーを除去します。一次抗体を簡単にボルテックスし、各群に150 μLの抗体混合物を加え、一晩4°Cでサンプルを配置します。
- 翌日、一次抗体を取り除き、PBSTで4回、回転器で5分間洗浄します。
- ブロッキングバッファーに二次染色を準備します。サンプルに二次染色を加え、回転器の暗い箱の中で2時間室温に保ちます。
注:二次染色はまたHRPおよびファロイドンを含むことができる。 - 2hインキュベーション後、PBSTで5分間洗浄した組織を4回除去し、装着に進む。
Representative Results
ヒトタール結合タンパク質を発現するトランスジェニックハエの生成は、43kDa変異体(TDP-43M337V)の概略図(図1A)によって表される。これは、ショウジョウバエ27のバイナリGal4 / UASシステムの適用を示しています。この図は、6つの筋線維を有するヘミトホアを示しており、A\u2012Fは最も側側繊維Aから最も腹側F(図1B)11,12に向かっている。11,12Figure 1Bシナプスの完全性を評価するために、NMJはHRPとファロイジンで染色された(図1C\u2012E)。TDP-43M337V変異体の運動ニューロン(図1F)は21日目までにHRP染色がほとんどないし、WT(オレゴン-R)はそのまま残っている(図1C)。筋肉染色には目に見える違いはありません (図 1D,G)。TDP-43M337V変異体で観察された総形態の変化は、成人DLMモデルを用いた筋萎縮性側索硬化症(ALS)の神経変性疾患モデルにおいてシナプス完全性がどのように関与するかを示している。構造染色に加えて、DLM NMJを染色すると、シナプス前(図2A\u2012R)およびシナプス後(図2S\u2012X)マーカーFigure 2を使用してシナプスの完全性を評価することもできます。これらの結果は、この解剖プロトコルが神経変性疾患におけるDLM組織の研究にどのように適用できるかを示している。
この解剖の重要な側面の1つは、二分を容易にするために組織をフラッシュフリーズさせる液体窒素の適用である。液体窒素の有用性は、筋肉組織が損傷またはニック繊維を持たない液体窒素を持つWTハエで実証されている(図3A\u2012C)。液体窒素がなければ、組織を解剖することがより困難になる可能性があります。例えば、このプロトコルに従って液体窒素フラッシュ凍結ステップをスキップすると、組織が損傷したニューロン(図3D)または損傷した筋線維などの解剖ツールによる損傷を受けやすくなります(図3E)。液体窒素の適用は、試料の遺伝子型に関係なくDLM組織を扱う際に起こりうる組織損傷を防ぐのに役立つ(図3Cおよび3F)。
図1:ALSのショウジョウバエモデルにおけるDLMシナプスの進行性脱熱(A)43kDaのヒト変異型のタール結合タンパク質を発現するALSトランスジェニックハエの生成(TDP-43)を概略図に示す。(B) この図は、成人ショウジョウバエにおけるヘミトラックスの形状と向きを描いている。プロトコルを使用して、HRP(緑色)とファロイジン(マゼンタ)と筋肉組織を有する運動ニューロンの構造染色を通じてDLM NMJシナプスのシナプス完全性の進行性損失を観察することができます。我々のモデルは、運動ニューロンにおけるヒトTDP-43 M337V(図1F\u2012E)のヒトTDP-43M337Vからの変異体を発現するALSの成体モデルにおけるシナプス完全性の喪失を、WT(図1C)の筋肉繊維で飛ぶのと比較して描写している(図1C)スケールバー=63倍の倍率で20 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成人NmJでシナプス前マーカーを使用してシナプス完全性を評価する。シナプス完全性はまた、筋線維Cで生後14日であるWTハエのシナプス前および心内ナプティックマーカーを使用して評価することができる。シナプス前マーカーシナプシン(B),シンシン (H), およびブルッフパイロット (BRP) (N) は HRP (A, G, M)と共に染色されます。染色は、これらのマーカーをシナプス前端子(C、I、O)に局在化することを I示していますO。C高い倍率では、画像はシナプシン(E)、シンセニン(K)、およびBRP(Q)QとHRP(D、J、およびP)のローカリゼーションをより詳細に示しています( J図F、L、およびR)。 我々はまた、ポストナプスマーカーグルタミン酸受容体III(GluRIII)(T)HRP(S)と共に染色Sを示す。T共同染色は、これらのマーカーの有用性を示す(U)。より高い拡大では、代表的な画像は、それぞれ、心筋組織およびシナプス前末端にW対するGluRIII(W)およびHRP(V)の局在(X)を例示する。VパネルA\u2012C、G-I、M\u2012O、S\u2012Uのスケールバーは63倍の倍率で20 μmを表します。パネルD\u2012F、2J-2L、2P-2R、および2V-2Xのスケールバーは、63倍の拡大で10 μmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DLM解剖のための液体窒素の有用性。DLMの切除に対する液体窒素の有用性を示すために、我々は、筋線維Cからの液体窒素の有無にかかわらず21日目のWTハエの比較を示す。液体窒素を使用すると、ファロイジン(B)はそのまま残り、HRP染色(A、C)を C損なわない。液体窒素がなければ、筋組織はひも状になり、二分(E)が困難になり、HRP染色(D、F)は技術的な誤りにより損なわれる。 白い矢印は、液体窒素(B)と損傷した筋肉組織(E)で筋肉損傷のない領域を示しています。スケールバー= 63倍の倍率で20 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルで説明した方法を用いて、DLM組織の解剖のための簡単なアプローチを提供し、これが成人ショウジョウバエにおける構造染色およびシナプスマーカーを通じてシナプス完全性を評価するためにどのように適用できるかを実証する。DLM組織を解剖しやすくするプロトコルの重要なステップの1つは、液体窒素でのフラッシュ凍結です。このステップがなければ、図3に示すように組織の固さや切断が困難になります。このプロトコルは、運動ニューロンと筋肉組織の両方の保存を可能にする以前の解剖方法に基づいて構築されます18,,19,,20,21,22,,23.22このプロトコルの1つの制限は、二分の中間線をカットダウンさせると、胸郭当たり2つのきれいな準備を得ることは困難である。1フライあたり少なくとも1つのヘミトラックスを確保する1つの方法は、意図的に胸郭の片側に切断して1つのきれいな準備をすることができます。この改変により、ブレードブレーカでサンプルをクリーンアップするために、カットから余分な組織を除去する必要があるかもしれません。この技術に新しい人のために、継続的な練習で、二分の正確さが増加します。
ここで説明する方法は、研究者が簡単に彼らの寿命を通じていつでも成人DLM NmJの構造的完全性を評価することができます.このプロトコルの主な利点は、シナプスマーカーを使用して神経変性疾患モデルのシナプス完全性にアクセスする能力である。このアプリケーションが構造染色でグロス形態の変化を可視化できることを実証します (図1C\u2012H)。さらに、シナプス完全性は、シナプシン28(図2A\u2012F)、シンコシン29(図2G\u2012L)およびBRP30(図2Figure 2M\u2012R)を含むがこれらに限定されないシナプスマーカーの染色で評価することができる。ポストナプティック筋組織は、グルタミン酸受容体IIIサブユニット抗体31(図2S\u2012X)を用いて評価することもできるが、このプロトコルの有用性を示す。
研究者はまた、機能データを補完するために、この解剖法を利用して、多種多様な疾患に関連するシナプスの構造的完全性を包括的に調べることができます。これらのシナプスはまた電気生理学的記録32、33、3433および34飛行アッセイ10を通して機能分析を可能にする。32このプロトコルはまた多くの適用およびアッセイのためのティッシュへのアクセスの容易さを提供できる。将来の研究は、例えば、このプロトコルを使用して、シナプスの密度とシナプス数を定量化してシナプスの変化を定量化することができます15,,16.ここで説明するプロトコルは、特に運動ニューロンのシナプス完全性を調べるが、筋細胞喪失を評価するための相補的なプロトコルは、TUNEL染色35を用いてこの解剖を用いても行うことができる。神経細胞の喪失を調べるために、胸部神経節36の解剖もTUNEL染色に使用することができる。ここで説明した解剖は、加齢に伴う病理および神経変性疾患を評価する将来の研究へのより多くの応用を期待する。
Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(R01 NS110727)によってD.T.Bに支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
| Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
| Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
| anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
| anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
| anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
| anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
| BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
| Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
| cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
| cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
| cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
| dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
| Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
| Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
| FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
| freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
| glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
| glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
| mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
| nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
| normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
| paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
| PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
| Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
| plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
| reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
| sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
| slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
| standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
| Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
| Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |
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