Article de méthode

Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

DOI :

10.3791/61376

⸱

5 août 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les communautés polymicrobiales sont omniprésentes dans la nature, mais il est difficile d’étudier leurs interactions au niveau unicellulaire. Ainsi, une méthode basée sur la microscopie a été développée pour observer les interactions inter-espèces entre deux pathogènes bactériens. L’utilisation de cette méthode pour interroger les interactions entre un pathogène gramnégatif motile, Pseudomonas aeruginosa et un pathogène gram-positif non-motile, Staphylococcus aureus est démontrée ici. Ce protocole consiste à co-inoculer chaque espèce entre un couvercle et un tampon agarose, qui maintient les cellules dans un seul plan et permet la visualisation des comportements bactériens dans l’espace et le temps.

En outre, la microscopie en time-lapse démontrée ici est idéale pour visualiser les premières interactions qui ont lieu entre deux espèces bactériennes ou plus, y compris les changements dans la motilité des espèces bactériennes en monoculture et en coculture avec d’autres espèces. En raison de la nature de l’espace d’échantillonnage limité dans la configuration de la microscopie, ce protocole est moins applicable pour étudier les interactions ultérieures entre les espèces bactériennes une fois que les populations cellulaires sont trop élevées. Cependant, il existe plusieurs applications différentes du protocole qui comprennent l’utilisation de la coloration pour l’imagerie des cellules bactériennes vivantes et mortes, la quantification de l’expression des gènes ou des protéines par le biais de reporters fluorescents, et le suivi du mouvement des cellules bactériennes dans les deux espèces individuelles et des expériences multi-espèces.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les communautés polymicrobiales sont communes dans la nature, couvrant une variété del’environnement 1,,2,3 et les niches humaines4,5. Certaines des infections polymicrobiales les plus notoires dans la maladie humaine incluent les biofilms dentaires6, les blessures chroniques7,8, et les infections respiratoires chez les personnes atteintes de la maladie pulmonaire obstructive chronique9, pneumonie contamile associée à ventilateur10, et la mucoviscidose de la maladie génétique (CF)11,12. Ces infections sont souvent composées de diverses espèces microbiennes; cependant, un accent récent sur les interactions entre la bactérie Gram-positive Staphylococcus aureus et la bactérie gram-négative Pseudomonas aeruginosa a émergé. Des études comprenant des patients atteints de ces organismes et des analyses in vitro révèlent des interactions compétitives et coopératives qui peuvent avoir des influences profondes et inattendues sur la progression de la maladie, la survie microbienne, la virulence, le métabolisme et la susceptibilité aux antibiotiques (revues en détail par Hotterbeekx et al.2017 13 et Limoli et Hoffman 20193).

L’intérêt croissant pour les interactions inter-espèces pendant l’infection a donné lieu à une variété de méthodes pour étudier les comportements communautaires polymicrobaires. Typiquement, ces études ont utilisé des essais à base de plaque ou de bouillon pour étudier les différences phénotypiques entre la monoculture et la coculture. Par exemple, la coculture P. aeruginosa et S. aureus sur les surfaces solides a permis la visualisation de l’inhibition de la croissance ou des changements dans la production de phénotype, de pigment ou de polysaccharide de colonie14,15,16. Les biofilms d’espèces mixtes, sur des surfaces biotiques ou abiotiques, ainsi que la coculture d’espèces bactériennes en culture liquide ont également permis de mesurer les changements dans la croissance, le métabolisme, la tolérance aux antibiotiques, la concurrence et la viabilité, en plus de l’expression des gènes et des protéines17,18. Bien que ces expériences culturelles en vrac aient révélé comment P. aeruginosa et S. aureus pourraient s’influencer mutuellement à l’échelle communautaire, ils sont incapables de répondre à des questions importantes sur les interactions qui ont lieu au niveau unicellulaire. La méthode présentée ici ajoute aux approches pour l’étude des interactions inter-espèces en se concentrant sur les changements dans le mouvement, la viabilité cellulaire, et l’expression des gènes des cellules uniques au sein d’une communauté coculturée au fil du temps.

Les interactions unicellulaires peuvent différer considérablement des interactions qui ont lieu dans une communauté de cellules en vrac. Grâce à l’analyse unicellulaire, l’hétérogénéité au sein d’une communauté peut être quantifiée pour étudier comment le placement spatial des cellules influence la dynamique de la communauté ou comment les niveaux d’expression des gènes et des protéines changent au sein des membres individuels d’un groupe. Les cellules de suivi peuvent également fournir un aperçu de la façon dont les cellules uniques se déplacent et se comportent au fil du temps, à travers plusieurs générations. En suivant simultanément le mouvement cellulaire et les changements dans l’expression des gènes, des corrélations peuvent être faites entre les fluctuations des gènes et les phénotypes correspondants. Des protocoles antérieurs pour l’étude des espèces bactériennes individuelles au niveau unicellulaire ont été décrits. Ces études tirent parti des cellules d’imagerie vivante au fil du temps dans un seul plan, et ont été utiles pour observer des phénotypes comme la division cellulaire et la susceptibilité aux antibiotiques19,20. D’autres microscopies d’imagerie vivante ont été utilisées pour surveiller la croissance, la motilité, la colonisation de surface et la formation de biofilms d’espèces bactériennes simples21,22,23. Cependant, bien que ces études aient été perspicaces pour comprendre la physiologie des bactéries en monoculture, les expériences pour observer le comportement unicellulaire de plusieurs espèces bactériennes au fil du temps dans la coculture sont limitées.

Ici, les protocoles antérieurs utilisés pour l’imagerie par une seule espèce ont été adaptés pour étudier les interactions entre P. aeruginosa et S. aureus. Ces organismes peuvent être différenciés en contraste de phase en fonction de leurs morphologies cellulaires(P. aeruginosa sont bacillis et S. aureus sont cocci). Le développement de cette méthode a récemment permis la visualisation de comportements de motilité précédemment non décrits de P. aeruginosa en présence de S. aureus24. P. aeruginosa s’est avéré capable de détecter S. aureus à distance et de répondre avec des mouvements monocellulaires accrus et directionnels vers des grappes de cellules de S. aureus. P. aeruginosa mouvement vers S. aureus a été trouvé pour exiger le type IV pili (TFP), projections de cheveux dont l’extension coordonnée et la rétraction générer un mouvement appelé motilité twitching25.

Ces études démontrent l’utilité de cette méthode pour interroger les interactions antérieures entre les espèces. Cependant, l’imagerie à des densités cellulaires élevées à des moments d’interaction ultérieurs est difficile étant donné que les couches uniques de cellules ne peuvent plus être identifiées, ce qui pose principalement des problèmes lors de l’analyse post-imagerie. Compte tenu de cette limitation, la méthode est la mieux adaptée pour les interactions antérieures qui pourraient ensuite être suivies avec des tests macroscopiques traditionnels à des densités cellulaires plus élevées représentatives des interactions ultérieures. Les limites supplémentaires de cette méthode incluent la nature à faible débit, puisqu’un seul échantillon peut être photographié à la fois et le coût du microscope, de la caméra et de la chambre environnementale. En outre, la microscopie de fluorescence pose des risques pour les cellules bactériennes comme la phototoxicité et le photobleaching, limitant ainsi la fréquence à laquelle les images de fluorescence peuvent être acquises. Enfin, les coussinets d’agarose utilisés dans cette méthode sont très sensibles aux changements dans l’environnement, ce qui rend essentiel pour contrôler des conditions comme la température et l’humidité, étant donné que les plaquettes peuvent commencer à rétrécir ou se développer si les conditions ne sont pas correctes. Enfin, bien que cette méthode n’imite pas l’environnement hôte, elle fournit des indices sur la façon dont différentes espèces bactériennes réagissent sur les surfaces, qui peuvent être suivies dans des tests conçus pour imiter les conditions environnementales/hôtes.

Cette méthode diffère des études précédentes de suivi du mouvement unicellulaire, en ce que les cellules sont inoculées entre un couvercle et un tampon agarose, limitant les cellules à la surface. Cela permet le suivi cellulaire au fil du temps dans un seul plan; toutefois, limite les cycles d’engagement transitoire de surface observés lorsque les cellules sont submergées dans le liquide26. Un autre avantage des bactéries d’imagerie sous un tampon d’agarose est qu’il imite les essais d’inoculation sub-surface macroscopiques à base de plaques classiquement utilisés pour examiner P. aeruginosa twitching motilité25. Dans ce test, les cellules bactériennes sont inoculées entre le fond d’une boîte de Pétri et l’agar, en gardant les cellules dans un seul plan comme ils se déplacent à travers le fond du plat vers l’extérieur à partir du point d’inoculation, un peu comme ce protocole de microscopie.

Le protocole de microscopie time-lapse pour visualiser les interactions interspécifères présenté ici se compose de 1) la préparation de l’échantillon bactérien et du tampon d’agarose, 2) la sélection des paramètres de microscope pour l’acquisition d’imagerie et 3) l’analyse post-imagerie. La visualisation détaillée du mouvement et du suivi des cellules peut être effectuée par l’acquisition d’images à de courts intervalles de temps par contraste de phase. La microscopie de fluorescence peut également être utilisée pour déterminer la viabilité cellulaire ou l’expression des gènes au fil du temps. Ici, nous montrons un exemple d’adaptation pour la microscopie de fluorescence par l’ajout de colorants de viabilité aux coussinets d’agarose.

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Protocole

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REMARQUE : Une description complète et des numéros de catalogue pour toutes les fournitures de ce protocole se trouvent dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation des supports minimaux M8T

  1. Préparer 1 L de base de sels minimes M8 (5x) en dissolvant 64 g de Na2HPO4·7H2O, 15 g de KH2PO4, et 2,5 g de NaCl dans 800 ml d’eau ultrapure (UPW, résistivité 18 MΩ/cm) dans une bouteille de 2 L. pH à 7,6. Volume complet à 1 L avec UPW. Autoclave pendant 45 min.
  2. Préparer 500 ml d’une solution de glucose (20% w/v) en dissolvant 100 g de glucose dans 400 ml d’UPW dans une bouteille de 1 L. Solution complète à 500 mL avec UPW. Autoclave pendant 45 min.
  3. Préparer 500 mL d’une solution tryptone (20% w/v) en dissolvant 100 g de tryptone dans 400 mL d’UPW. Compléter à 500 mL avec UPW. Autoclave pendant 45 min.
  4. Préparer 1 L de M8 + 10% tryptone (M8T) support minimal en ajoutant 200 mL de 5x M8 sels minimes (1x finale), 10 mL de glucose de 20% (20% de glucose (1x 0,2% final), 1 mL de 1 M MgSO4 (1 mM finale), et 50 mL de tryptone (1% final) à 600 mL d’UPW. Compléter à 1 L avec UPW. Filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 μm dans une bouteille stérile de stockage multimédia de 500 mL.

Jour 1:

2. Préparation des cultures bactériennes du jour au lendemain

  1. Inoculer 5 mL de milieubeux minimaux M8T avec une seule colonie de P. aeruginosa ou S. aureus (y compris les antibiotiques le cas échéant) et incuber toute la nuit à 37 °C avec aération pour pas plus de 16 h.
    REMARQUE : Les agents pathogènes bactériens P. aeruginosa et S. aureus ont été utilisés pour cette méthode, parce qu’ils sont généralement coésolated des infections chroniques, et l’étude de leurs interactions est importante pour comprendre comment ils contribuent aux résultats des patients pendant les infections polymicroboriaux. D’autres espèces bactériennes pourraient être utilisées en fonction de l’objet de l’étude.

Jour 2:

3. Sous-culture de souches bactériennes

  1. Sous-culture P. aeruginosa 1:500 et S. aureus 1:1000 en 5 mL de M8T frais (y compris les antibiotiques le cas échéant). Incuber avec aération à 37 °C jusqu’à ce que les cultures atteignent la phase médiane du journal (OD600 = ~0,3 - 0,5).

4. Préparation des matériaux pour les moules de tampon

  1. Préparer des spatules métalliques en chauffant l’extrémité d’une spatule de laboratoire plate et arrondie à l’aide d’un brûleur Bunsen jusqu’à ce que la moitié de l’extrémité plate puisse être pliée à un angle de 90°. Chauffer l’extrémité d’une autre spatule de laboratoire plate et arrondie et plier légèrement les 10 derniers mm à un angle de 45 °C.
  2. Couper les quatre coins des moules en silicone de sorte que les moules s’adaptent à l’intérieur d’un plat de 35 mm.
  3. Stériliser les spatules et une paire de pinces à épiler en ajoutant 70% d’éthanol et en les passant à travers la flamme du brûleur Bunsen.
  4. Nettoyez le plat et les moules en silicone avec 70 % d’éthanol et séchez-les avec des lingettes sans peluche.

5. Préparation des coussinets d’agarose

REMARQUE : Les plaquettes sont préparées avec le milieu minimal M8T comme source nutritive pour les bactéries utilisées dans ce protocole. Cependant, les nutriments utilisés dans les plaquettes peuvent être modifiés pour différents organismes.

  1. Faire fondre 2 % d’agarose à faible fusion dans 10 ml de M8T dans une fiole Erlenmeyer propre de 50 ml. Cuire au micro-ondes à intervalles courts (2-5 s) jusqu’à ce que l’agarose soit en solution afin d’éviter que le contenu de la fiole ne bouillonne. Une fois fondu, laisser refroidir dans un bain d’eau de 50 °C pendant au moins 15 min.
  2. Préparer les moules en alignant la découpe en silicone avec l’ouverture dans le plat de 35 mm et appuyez légèrement à l’aide d’une spatule pour fixer le silicone dans le plat, et pour enlever toutes les bulles d’air entre le moule et le plat.
  3. Une fois refroidie, la pipette 915 μL d’agarose fondue dans le moule. Laissez le couvercle entrouvert et laissez sécher le tampon à température ambiante pendant 30 min.
  4. Couvrir le plat avec le couvercle et laisser à température ambiante pendant 2 h supplémentaires.
  5. Préparer les lingettes d’humidité en roulant étroitement vers le haut d’un essuie-tout sans peluche. Placez l’essuie-tout roulé à l’intérieur d’une boîte de Pétri stérile et ajoutez uniformément 500 μL d’eau stérile sur l’essuie-glace. Chauffer à 37 °C pendant 1 h.
  6. Chauffer le tampon et un plat stérile de 35 mm à 37 °C pendant 1 h.

6. Préparation de cellules bactériennes et de plaquettes inoculantes

  1. Mesurer l’OD600 de chaque sous-culture et diluer P. aeruginosa à un OD600 = 0,03 et S. aureus à un OD600 = 0,10 dans M8T préguerre à 37 °C. Mélanger P. aeruginosa et S. aureus dans un rapport de 1:1 et vortex.
    REMARQUE : Si les souches nécessitent des antibiotiques, les antibiotiques peuvent être ajoutés à la nuit et à la sous-culture, mais ne devraient pas être ajoutés lors du mélange d’espèces pour l’imagerie si cela affecte les autres espèces de la coculture. La stabilité plasmide et les effets des antibiotiques sur toutes les espèces de la coculture devront être déterminés pour chaque organisme/plasmide utilisé.
  2. Pipette 1 μL de coculture uniformément sur le fond d’un plat de couverture en verre préchauffé et stérile de 35 mm.
  3. Retirer la découpe en silicone du moule à l’aide de pinces stériles.
  4. Retirer le tampon du plat à l’aide de spatules stériles.
    1. Glissez la spatule légèrement pliée sous le bord du tampon, tout en tenant le moule à l’envers, pour l’déposer sur un couvercle stérile de plaque de Petri.
      REMARQUE : Prenez soin de ne pas forcer le tampon ou il va déchirer. Gardez une trace de quel côté du pad est le fond.
  5. Transférer le tampon dans le plat avec les cellules bactériennes, en bas du côté vers le bas, en glissant la spatule inclinée de 90° sous le tampon et en le plaçant sur le dessus du couvercle inoculé. Utilisez la spatule inclinée à 90° pour faire rincer le tampon contre le couvercle et appuyez doucement sur les bulles d’air.
  6. Retirez l’excès d’humidité des lingettes humides puis placez-le autour du bord du plat, en s’assurant qu’il ne touche pas le tampon. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie.

7. Mise en place du microscope pour l’imagerie en direct

  1. Chambre environnementale chaude à 37 °C au moins 2 h avant l’installation expérimentale.
  2. Allumez tous les composants, y compris le microscope, l’ordinateur et les sources lumineuses pour l’imagerie par champ lumineux et la fluorescence.
  3. Ouvrez le logiciel d’imagerie et assurez-vous que les sources lumineuses sont connectées et en cours d’exécution.
  4. Effectuez l’éclairage Köhler27 pour aligner tous les plans d’image.
    1. Tout d’abord, mettre le couvercle marqué au point avec un objectif 20x à l’aide d’un plat « factice ». Assurez-vous que la tourelle de condensateur est définie sur la position « ouverte ».
      REMARQUE : L’éclairage Köhler doit être effectué pour chaque objectif/échantillon unique afin d’aligner correctement les plans d’image. Toutefois, la mise au point et l’alignement avec le plat « factice » sur le grossissement inférieur accélère la mise en place d’échantillons vivants à un grossissement plus élevé afin de limiter le temps entre l’heure de mise en place et l’heure de début de l’expérience.
    2. Concentrez le condenseur.
      1. Fermez le diaphragme du champ.
        REMARQUE : Une ouverture en forme d’octogone doit apparaître. Si le condenseur est complètement flou, tout le champ de vision (FOV) apparaîtra sombre.
      2. Faites pivoter les boutons de mise au point du condenseur jusqu’à ce que les bords de l’octogone soient nets.
        REMARQUE : L’intensité lumineuse augmentera à mesure que les plans d’image approcheront l’alignement correct.
    3. Aligner le condenseur.
      1. Centrez le condenseur de champ en ajustant les boutons d’alignement.
        REMARQUE : L’octogone doit être centré au milieu du FOV. Les boutons d’alignement diffèrent selon le microscope. Par exemple, certains condensateurs de microscope ont des boutons, tandis que d’autres ont des vis nécessitant un conducteur de vis.
    4. Concentrez le filament de lampe et ajustez l’ouverture du condenseur.
      1. Placez un télescope de phase ou une lentille Bertrand dans la trajectoire lumineuse pour observer le plan focal arrière de l’objectif.
        REMARQUE : Il devrait y avoir deux cercles concentriques.
      2. Tournez le bouton de mise au point de l’objectif Bertrand jusqu’à ce que les anneaux semblent croustillants.
      3. Retirez l’objectif Bertrand du chemin lumineux.
    5. Ouvrez le diaphragme du champ jusqu’à ce que l’octogone soit juste à l’extérieur du FOV.
    6. Passer à l’objectif 100x et glisser l’anneau de phase correspondant en place avant d’ajouter une goutte d’huile d’immersion, et placer le plat d’échantillon préparé sur le dessus.
    7. Effectuer l’éclairage Köhler sur l’objectif 100x avec le plat échantillon bactérien.
  5. Concentrez-vous sur les bactéries en utilisant l’ajustement fin seulement. Une fois que les bactéries dans le FOV sont concentrés à travers l’oculaire, passer le chemin de la lumière à la caméra en appuyant sur le bouton de la caméra sur le microscope.
  6. Cliquez sur l’option Phase dans le logiciel d’imagerie.
  7. Ajuster le pourcentage de lumière LED DIA émise en sélectionnant la source lumineuse dans le logiciel et soit en entrant manuellement le pourcentage de lumière souhaité à utiliser ou en glissant la barre sur l’échelle de pourcentage de lumière.
  8. Réglez le temps d’exposition à la lumière LED DIA en cliquant sur la source lumineuse et en entrant manuellement le temps d’exposition souhaité ou en sélectionnant un temps d’exposition dans le menu déroulant fourni.
    REMARQUE : Le temps d’exposition varie en fonction de l’utilisation de la caméra.
  9. Si vous utilisez la fluorescence, réglez les paramètres de la caméra dans chaque canal correspondant (c.-à-d. TxRed, GFP), en cliquant sur le canal fluorescent d’intérêt.
    1. Définissez le pourcentage de lumière de fluorescence émise, puis ajustez le temps d’exposition (tel qu’il est effectué aux étapes 7.7 et 7.8 pour la lumière LED DIA).
    2. Sinon, modifiez la profondeur du bit pour ajuster la plage dynamique en sélectionnant l’une des autres options de profondeur de bit dans le menu déroulant des contrôles de visualisation.
  10. Choisissez les positions d’intérêt XY en cliquant sur l’option XY dans le menu contrôles d’acquisition.
    1. Déplacez la position de la scène avec le joy stick, ou en cliquant et en faisant glisser le FOV sur l’écran, puis cliquez sur la zone vide pour enregistrer les coordonnées X et Y d’une position spécifique.
      REMARQUE : La sélection de pas plus de trois positions XY différentes, aussi étroites que possible, est recommandée pour l’acquisition en time-lapse.
  11. Activez le système de mise au point parfait (PFS) en cliquant sur la zone PFS de l’onglet XY du menu de contrôle d’acquisition ou en appuyant sur le bouton PFS du panneau de commande joy stick.
  12. Faites pivoter les boutons d’ajustement fin pour vous concentrer sur les cellules bactériennes.
  13. Cliquez sur le bouton PFS pour chaque position XY, une fois que les cellules sont dans le plan de mise au point souhaité.
    REMARQUE : Le SFP compense la dérive dans l’axe Z lors d’expériences en time-lapse. Ceci est nécessaire pour maintenir l’accent des cellules bactériennes au fil du temps. Différentes manufactures ont des systèmes de compensation différents.
  14. Choisissez les conditions d’acquisition d’image, y compris l’intervalle d’acquisition et la fréquence de chaque canal (p. ex., contraste de phase et chaque fluorophore) en sélectionnant parmi les options du menu contrôles d’acquisition.
    REMARQUE : Pour les expériences présentées ici, les images de contraste de phase sont acquises à intervalles tous les 5-10 s tandis que les images de fluorescence dans les canaux GFP et TxRed sont acquises toutes les 20 minutes.
  15. Commencez l’imagerie une fois que le microscope et les paramètres d’acquisition sont configurés.

8. Facultatif : Modifications pour l’imagerie vivante/morte

  1. Faire fondre 2 % d’agarose dans 10 mL de M8T et laisser refroidir dans un bain d’eau de 50 °C pendant au moins 15 min.
  2. Ajouter 1 mM d’iodure de propidium à l’agarose fondue.
  3. Une fois refroidi, la pipette 915 μL d’agarose dans le moule préparé.
  4. Laissez le couvercle entrouvert et laissez sécher le tampon à température ambiante pendant 30 min. Protégez-vous de la lumière.
  5. Couvrir le plat avec le couvercle et laisser à température ambiante pendant 2 h supplémentaires.
  6. Préparer les lingettes d’humidité.
    1. Rouler un papier sans peluche essuyez fermement.
    2. Placer l’essuie-glace dans une boîte de Pétri stérile et ajouter 500 μL d’eau stérile à l’essuie-glace.
    3. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
  7. Incuber le tampon et un plat stérile de 35 mm à 37 °C pendant 1 h.
  8. Procéder à l’inoculation du plat comme indiqué à la section 6 : Préparation des cellules bactériennes et des coussinets d’inoculation.

9. Analyse des données

  1. Identification des cellules
    1. Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’imagerie et rognez le fichier pour inclure uniquement les images à utiliser pour le suivi, zoomer sur les cellules d’intérêt, et uniquement dans le canal de contraste de phase.
      REMARQUE : Le fichier rogné peut être enregistré sous la forme d’un nouveau fichier dans lequel les données de suivi peuvent être stockées sans interférer avec le fichier d’origine.
    2. Sélectionnez l’option pour choisir les régions d’intérêt (ROI) dans le menu contrôles d’analyse et définissez les ORI en traçant des cellules bactériennes individuelles ou des grappes de cellules dans le premier cadre à utiliser pour l’analyse.
      REMARQUE : Les ORI peuvent être définis manuellement ou comme binaires.
      1. Définir manuellement le retour sur investissement
        1. Tracer le périmètre de chaque cellule bactérienne individuelle ou des grappes de cellules pour définir manuellement les ORI.
          REMARQUE : Dans le logiciel d’analyse, P. aeruginosa,ou d’autres cellules en forme de tige, peut être tracé manuellement en sélectionnant le roi Ellipse et en dessinant une ellipse ajustée à la taille de la cellule bactérienne. Alternativement, l’option roi polygone peut être sélectionnée pour tracer des ROI de forme non traditionnelle, telles que des amas de cellules.
      2. Identifier les VOI binaires
        1. Cliquez sur l’option Binaire à ROI afin de définir les VOI binaires.
          REMARQUE : Les objets sont définis dans une couche binaire basée sur la séparation des cellules bactériennes pixelisées plus foncées de l’arrière-plan pixelisé plus léger dans le canal de contraste de phase.
        2. Pour mettre à terme les cellules, sélectionnez l’option Seuil dans le menu contrôles d’analyse. Sélectionnez le canal d’intérêt et faites glisser les barres dans l’histogramme de fluorescence pour ajuster les valeurs d’intervalle de seuil.
          REMARQUE : L’identification des objets binaires pour les VOI peut également être définie dans les images fluorescentes en mettant à l’avant les cellules bactériennes. Le seuil établit quelles intensités de fluorescence sont considérées comme des objets et quelles intensités de fluorescence constituent l’arrière-plan.
  2. Suivi cellulaire
    1. Pour suivre manuellement les VOI, sélectionnez le cadre suivant dans la séquence d’imagerie et ajustez la position des ROV en cliquant et en faisant glisser chaque roi pour s’aligner sur la nouvelle position de la cellule bactérienne d’origine.
      REMARQUE : Si les cellules bactériennes n’ont pas changé de position, les ROI n’ont pas besoin d’être déplacés.
    2. Répétez dans toutes les images séquentielles pour lesquelles les cellules doivent être suivies.
    3. Au fur et à mesure que les cellules se divisent, définissez les cellules filles comme de nouveaux ROI, comme décrit à l’étape 9.1, et commencez à suivre les cellules nouvellement divisées.
      REMARQUE : Si les cellules sont identifiées comme binaires, utilisez la fonction Track Binaries pour suivre automatiquement les VOI dans les images sélectionnées.
    4. Une fois que les cellules ont été suivies à travers tous les cadres sélectionnés, exportez les données à analyser.
    5. Ouvrez la feuille de calcul de données et identifiez les mesures requises pour l’analyse (c.-à-d. la vitesse de l’objet, l’accélération ou la longueur du chemin d’accès).
      REMARQUE : Dans le cas de la mesure de la direction, les mesures de longueur et de longueur de la ligne sont nécessaires. La longueur de la ligne est une mesure de la distance eucliide, ou la distance droite entre l’origine de la voie et le bord de la colonie de S. aureus. La longueur du chemin d’accès est une mesure de la distance accumulée, ou la somme des segments de piste de tous les cadres. La direction peut être calculée comme un rapport de la distance Eucidienne, D(E), (Longueur de la ligne), sur la distance accumulée, D(A), (Longueur du chemin).
  3. Quantification de la fluorescence
    1. Définir les ROV pour les cellules bactériennes fluorescentes telles que décrites à l’étape 9.1.
    2. Répétez le traçage ou le mouvement des ORI pour les cellules bactériennes ou les grappes dans les cadres fluorescents restants.
    3. Exportez la table générée vers un fichier de feuilles de calcul pour analyse de l’intensité fluorescente.
    4. Dans la feuille de calcul des données, recherchez la colonne avec « Intensité moyenne » qui représente l’intensité moyenne de fluorescence pour le(s) roi(s) bactérien(s) tracé.
    5. Graphiquez les valeurs d’intensité moyenne pour examiner les changements dans la fluorescence au fil du temps.
      REMARQUE : Les changements dans la fluorescence au fil du temps représentent la fluctuation de l’expression génique pour le gène d’intérêt fluorescent.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’utilisation réussie de la méthode décrite se traduira par une série d’images qui génèrent une vidéo dans laquelle les interactions inter-espèces peuvent être observées au fil du temps. Le schéma de la figure 1 fournit un visuel pour mettre en évidence les étapes clés de la préparation des matériaux pour l’imagerie. L’utilisation de cette méthode a permis la démonstration de cellules P. aeruginosa présentant différents comportements en monoculture par rapport à la coculture avec

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes présentées ici décrivent un protocole pour l’imagerie à cellules vivantes des interactions des espèces bactériennes au niveau unicellulaire avec des modifications pour d’autres applications, y compris le suivi cellulaire et la viabilité des cellules. Cette méthode ouvre de nouvelles avenues pour étudier les comportements unicellulaires des micro-organismes en coculture avec d’autres espèces au fil du temps. Plus précisément, le protocole démontre l’utilité de cette méthode de coculture dans l’observation des...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été appuyé par le financement du Prix de transition postdoc-faculté de la Fondation de la fibrose kystique LIMOLI18F5 (DHL), du Prix de recrutement junior des professeurs de la Fondation de la fibrose kystique LIMOLI19R3 (DHL) et de la Bourse de formation T32 des NIH 5T32HL007638-34 (ASP). Nous remercions Jeffrey Meisner, Minsu Kim et Ethan Garner d’avoir partagé les protocoles initiaux et les conseils pour l’imagerie et la fabrication de plaquettes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
35 mm avec couvercle en verre Micro-well #1.5 de 20 mmCellvisD35-20-1.5-NUn pour moules à tampons d’agarose, un pour l’expérience
KimWipesKimberly-Clark Professional06-666A
Low-Melt AgaroseNu-Sieve GTG/Lonza50081Pour la fabrication de tampons
d’agaroseSpatules à fond rondVWR82027-492
Spatules rondes coniquesVWR82027-530
Isolateurs en silicone, Press-to-Seal, 1 puits, Diamètre D 2,0 mm 20 mm, silicone/adhésifSigma-AldrichS6685-25EAPour moules à tampons d’agarose
Plaques de Petri stériles, 85 mmKord-Valmark /vendu par RPI2900
Pince à épilerVWR89259-944
M8T Minimal Media
D (+) GlucoseRPIG32045
KH2PO4RPIP250500
MgSO4Sigma-Aldrich208094
NaClRPIS23025
Na2HPO4<.7Hsub>2OSigma-Aldrich230391
TryptoneBD BiosciencesDF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11Andor77026135Camera. 4,2 mégapixels Rétroéclairé sCMOS, 11 &mu ; m pixel, 95 % QE, 48 ips, USB 3.0, monture F.
Cube de filtre GFPNikon96372Cube de filtre
Cube de filtre TxRedNikon96375Cube de filtre
H201-NIKON-TI-S-EROkolab77057447Incubateur de scène
Nikon NIS-Elements AR avec GA3 et suivi 2D et 3DNikon77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950Logiciel pour l’analyse de données
Nikon Ti2 EclipseNikonModèle Ti2-EMicroscope
CFI Plan Apo ƛ ; Objectif 20x (0.75NA)ObjectifMRD00205
Nikon CFI Plan Apo ƛ ; Objectif 100x à l’huile Ph3 DM (1.45NA)ObjectifMRD31905
Nikon ThermoBox avec radiateurs soufflants intégrésBoîtier Tokai HitTI2TB-E-BK
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)PMID : 7604262Prototrophe
non mucoïdePseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)PMID : 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2PMID : 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)PMID : 23404398USA300 CA-Methicilline souche LAC résistante sans plasmides
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)PMID : 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC Δ ; agrBDCAPMID : 31713513
Viability Stain
Propidium IodideInvitrogenL7012LIVE/DEAD&trade ; BacLight&commerce ; Kit de viabilité bactérienne
Plat à fond en verre

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
  2. Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
  3. Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
  4. Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
  6. Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
  7. Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
  8. Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
  9. Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
  10. Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232(2014).
  11. Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
  12. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
  13. Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
  14. Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
  15. Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
  16. Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56(2015).
  17. Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
  18. Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
  19. Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
  20. Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976(2018).
  21. Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
  22. Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
  23. Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
  24. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365(2019).
  25. Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
  26. Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
  27. Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).

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Suivi de cellule uniquemicroscopie en lapse de tempsPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureuspr paration de coussinets d agaroseimagerie par fluorescencemarquage de la viabilit cellulaireanalyse de l expression g niquequantification de la motilit

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