Summary
يمكن أن يساهم عزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتوصيفها عن طريق قياس التدفق الخلوي بشكل كبير في فهم نمط الاستجابة المناعية ضد الغرسات. يصف هذا البحث طريقة دقيقة لعزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتلطيخها لتحليل التدفق الخلوي.
Abstract
يخضع نجاح زرع الأنسجة المزروعة في المختبر أو جهاز طبي في الفرد للاستجابة المناعية للمضيف المتلقي. بالنظر إلى الغرسة كجسم غريب ، قد تؤدي الاستجابة المناعية العدائية وغير المنظمة إلى رفض الغرسة ، في حين أن الاستجابة المنظمة واستعادة التوازن يمكن أن تؤدي إلى قبولها. يمكن أن يساعد تحليل البيئات الدقيقة للغرسات التي تم تشريحها تحت إعدادات الجسم الحي أو خارج الجسم الحي في فهم نمط الاستجابة المناعية ، والتي يمكن أن تساعد في النهاية في تطوير أجيال جديدة من المواد الحيوية. قياس التدفق الخلوي هو تقنية معروفة لتوصيف الخلايا المناعية ومجموعاتها الفرعية بناء على علامات سطح الخلية. تصف هذه المراجعة بروتوكولا يعتمد على التقطيع اليدوي والهضم الأنزيمي والترشيح من خلال مصفاة خلوية لعزل معلقات الخلايا الموحدة من أنسجة الزرع المقطعة. علاوة على ذلك ، تم شرح بروتوكول تلطيخ قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، إلى جانب خطوات إعدادات مقياس الخلايا الأولية لتوصيف هذه الخلايا المعزولة وقياسها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Introduction
أدى التقدم في مجال الطب إلى الاستخدام المتكرر للمواد المزروعة لدعم وظيفة أو إعادة نمو الأنسجة التالفة 1,2. وتشمل هذه الأجهزة مثل أجهزة تنظيم ضربات القلب ، والغرسات التجميلية الترميمية ، ولوحات تقويم العظام المستخدمة لتثبيت كسور العظام 3,4. ومع ذلك ، فإن المواد المستخدمة في صنع هذه الغرسات والمواقع التي يتم زرعها فيها تلعب أدوارا مهمة في تحديد نجاح هذه الغرسات5،6،7. كأجسام غريبة ، يمكن أن تولد هذه الغرسات استجابة مناعية من المضيف يمكن أن تؤدي إما إلى الرفض أو التسامح8. دفع هذا العامل أبحاث المواد الحيوية لتوليد مواد يمكنها جذب الاستجابة المناعية المرغوبة بعد الزرع9،10،11،12.
الاستجابة المناعية هي مطلب أساسي في مجال الطب التجديدي ، حيث يتم زراعة نسيج أو عضو حول هيكل عظمي للمواد الحيوية (سقالة) في مختبر لاستبدال الأنسجة أو الأعضاء التالفة13،14،15،16. في الطب التجديدي ، الهدف هو استبدال الأنسجة المفقودة أو التالفة من خلال استخدام الخلايا والإشارات والسقالات ، والتي يمكن تعديل كل منها بشكل كبير من خلال الاستجابات المناعية17. علاوة على ذلك ، حتى عندما يكون نقص الاستجابة المناعية مرغوبا فيه ، نادرا ما يكون غياب النشاط المناعي بدلا من وجود ملف تعريف تنظيمي مرغوب فيه18. يمكن أن تلعب تقنيات مثل قياس التدفق الخلوي دورا مهما في توصيف نمط الاستجابة المناعية للمواد الحيوية المختلفة المستخدمة في طلاء أجهزة الزرع أو لتطوير سقالات لهندسة الأنسجة19.
هذه المعلومات ، بدورها ، ستساعد في النهاية في تطوير المواد الحيوية للزرع التي يمكن أن يتحملها الجهاز المناعي جيدا أو في تطوير سقالات يمكن أن تلعب دورا بناء في هندسة الأنسجة. يعد الإعداد السليم للعينات للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي خطوة مهمة لتجنب النتائج غير الدقيقة في التوصيف المناعي عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية20,21. لذلك ، تقدم هذه المراجعة منهجية مفصلة يمكن استخدامها لعزل الخلايا من أنسجة السقالة ، وتلطيخ تعليق الخلية ، والتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يقدم الشكل 1 لمحة عامة عن بروتوكول قياس التدفق الخلوي.
1) إعداد الكاشف
- تحضير الوسائط لتخفيف الإنزيمات وزراعة الأنسجة.
- أضف 5 مل من محلول عازلة 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينإيثان سلفونيك (HEPES) إلى 500 مل من وسط RPMI ويهز جيدا. قم بتخزين الوسط على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
- احسب حجم محلول الإنزيم.
ملاحظة: حجم محلول الإنزيم هو حجم الوسط الذي يحتوي على الإنزيمات (كولاجيناز و DNase I) التي ستكون ضرورية لهضم الأنسجة المقطعة في ألواح ذات 6 آبار ؛ ذلك يعتمد على عدد العينات.- استخدم المعادلة التالية لحساب الحجم المطلوب:
(عدد العينات المراد هضمها) × 5 مل من RPMI الخالي من المصل مع مخزن مؤقت HEPES 10 مللي متر
ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 0.1 إلى 0.3 جم من الطحال التشريحي ، استخدم 5 مل من الوسط لتحضير محلول الإنزيم. بروتوكول الهضم الأنزيمي الموصوف في هذه المخطوطة هو في المقام الأول للأنسجة الرخوة (تتراوح من 0.1 إلى 1 غرام) تشريح الفئران التي تشمل الدماغ والكلى والجلد والكبد والرئتين والطحال والعضلات ، وكذلك كبسولات حول الغرسات تحت الجلد المصنوعة من مواد اصطناعية أو بروتينات مصفوفة خارج الخلية. قد يتطلب هضم الأنسجة الغضروفية الصلبة ظروفا وأحجاما مختلفة من الإنزيمات الهاضمة ، والتي لا يمكن التأكد منها إلا عن طريق التحسين. - احسب كمية الكولاجيناز وإنزيم DNase التي أحتاجها لمحلول الإنزيم.
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام 0.25 مجم / مل من كولاجيناز و 0.2 مجم / مل من DNase I. يمكن أن تختلف تركيزات العمل المطلوبة للكولاجيناز و DNase لأنواع مختلفة من الأنسجة19.
- استخدم المعادلة التالية لحساب الحجم المطلوب:
- قم بإعداد محلول صبغة قابلية للحياة 1: 1000 عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من صبغة الصلاحية (انظر جدول المواد) إلى 999 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ودوامة المحلول. قم بتخزين المحلول في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
- تحضير المخزن المؤقت تلطيخ عن طريق إضافة 1 غرام من ألبومين مصل البقر (BSA) إلى 100 مل من PBS ، ودوامة الحل حتى يذوب BSA تماما. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
2) إعداد لوحات الهضم الأنزيمية
- قم بإعداد لوحة من 6 آبار مع مصافي خلايا 70 ميكرومتر في كل بئر. أضف 3 مل من الوسط المحضر من الخطوة 1.1.1 إلى كل بئر ، واحتضانه على الجليد.
- قم بتخزين الوسائط المتبقية (2 مل / بئر) في حاضنة أو حمام مائي عند 37 درجة مئوية لتعليق الكمية المحسوبة من كولاجيناز و DNase I (الخطوة 1.2.2).
3) عزل الخلايا
- ضع الغرسات / الأنسجة المقطعة في ألواح ، وقم بتقطيعها إلى مكعبات باستخدام المقص. بدلا من ذلك ، استخدم طريقة الاضطراب الميكانيكي باستخدام مفكك الأنسجة أو الخالط المحمول باليد. نظرا للعدد الكبير من الكريات البيض ، قم بتشريح الطحال لاستخدامه كعنصر تحكم في التلوين في كل جولة.
ملاحظة: نظرا لأن بعض المواد تحفز مستويات أعلى من التليف ، فإن هذا البروتوكول ينطبق على كل من المواد شديدة التليف والمواد الليفية الدؤوبة. ومع ذلك ، يجب تقييم كل طريقة معالجة لكل من إنتاجية الخلايا وصلاحيتها بعد الهضم قبل التلطيخ. تجنب تلوث الدم المحيطي أثناء التسلخ. - أضف كولاجيناز و DNase I (الحجم المحسوب في الخطوة 1.2.2) إلى RPMI المتبقي (2 مل) الذي تم تسخينه إلى 37 درجة مئوية. أضف 2 مل من محلول الإنزيم الكامل إلى كل بئر.
- ضع الأطباق في شاكر محتضن لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: كن حذرا عند تكديس الألواح لأن ذلك قد يمنع نقل الحرارة بشكل صحيح. - في هذه الأثناء ، قم بإعداد طرف توزيع التعليق عن طريق تقطيع 3-4 مم من نهاية طرف 1000 ميكرولتر بالمقص. بعد الحضانة ، ماصة التعليق في الآبار لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا باستخدام الطرف المفروم. ضع مصفاة الخلية على قمة أنبوب مخروطي سعة 50 مل ومرر المحلول المهضوم عبر مصفاة الخلية.
ملاحظة: مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر كافية لفصل الخلايا عن المواد الحيوية المزروعة ، مثل الجينات. إذا كانت هناك حاجة إلى قدر أكبر من النقاء ، فاستخدم عمليات مثل فصل تدرج الكثافة للحصول على مجموعة غنية من كريات الدم البيضاء. - شطف الآبار بمحلول 1x PBS ، ونقل حجم الشطف من خلال المصفاة ، تليها إضافة غسل المصفاة بمحلول 1x PBS حتى يصل الحجم في الأنبوب إلى 50 مل.
ملاحظة: يجب أن يكون 1x PBS في درجة حرارة الغرفة لمنع أي زيادة في لزوجة الهضم والسماح بتكوير الخلايا أثناء الطرد المركزي. - جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، نضح الطاف بعناية باستخدام ماصة مصلية دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في 1000 ميكرولتر من 1x PBS ، وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي صغير.
- امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق ، وقم بتحميل التعليق على شرائح غرفة العد لعد الخلايا باستخدام عداد خلية أوتوماتيكي أو على مقياس الدم للعد عبر الطريقة التقليدية تحت المجهر. بدلا من ذلك ، استخدم حبات عد خلايا قياس التدفق الخلوي.
4) تلطيخ لقياس التدفق الخلوي
- انظر الشكل 2 للحصول على مثال لتخطيط اللوحة لتجربة مكونة من 14 لونا مع 45 عينة ، وعناصر تحكم مضان ناقص واحد (FMO) ، وضوابط تعويض ، وتحكم في عينة الطحال الملطخة بالكامل. بعد تقدير العدد الإجمالي للخلايا ، احسب حجم تعليق الخلية المطلوب لتلطيخ 1 × 10 6 خلايا لكل عينة ، و 0.5 × 106 خلايا لكل تعويض وتحكم FMO. قم بتوزيع الحجم المطلوب من تعليق الخلية في آبار لوحة بئر ذات قاع V 96 ، وقم بتعويض الحجم إلى 100 ميكرولتر مع 1x PBS.
ملاحظة: على سبيل المثال ، إذا كان 1000 ميكرولتر من تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.6 يحتوي على 40 × 10 6 خلايا ، فعندئذ بالنسبة ل 1 × 10 6 خلايا ، ستكون هناك حاجة إلى 1000/40 × 106 = 25 ميكرولتر من تعليق الخلية. - قم بطرد اللوحة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واستنشق المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الخلايا في آبار العينة وفي بئر التحكم في التعويض لتحديد الصلاحية ، مع 100 ميكرولتر من محلول 1: 1000 من صبغة الصلاحية (انظر جدول المواد).
- بالنسبة للخلايا الموجودة في آبار التعويض الأخرى وكذلك FMO والآبار غير الملوثة ، أعد تعليقها ب 100 ميكرولتر من 1x PBS.
- احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- في غضون ذلك ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة السطحية لتلطيخ العينة وضوابط FMO: 50 ميكرولتر لكل عينة أو FMO. انظر الجدول 1 للحصول على مثال على كوكتيل الأجسام المضادة.
- بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر ، وقم بتدويره لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نضح المادة الطافية وإعادة تعليقها في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (1x PBS + 1٪ BSA) ؛ أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نضح الطافع ، وإعادة تعليق الخلايا في التعويض ، FMO ، والآبار غير الملوثة مع 50 ميكرولتر من 1x PBS. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة إلى آبار العينة المعنية وآبار FMO. أضف الأجسام المضادة المعنية إلى آبار التعويض المختلفة.
- احتضان الطبق لمدة 45 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، أضف 150 ميكرولتر من محلول التلوين في كل بئر ، وطرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نضح المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، والطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- في حالة تحليل العينات دون تثبيت ، أعد تعليقها في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، وانتقل إلى القسم 6 حول إعداد مقياس الخلايا وتحليل العينة. في حالة تثبيت الخلايا ، قم بنضح المادة الطافية بعد الغسيل ، وأضف 100 ميكرولتر من المثبت مثل 4٪ بارافورمالدهايد. في حالة تلطيخ العلامات داخل الخلايا ، انتقل إلى القسم 5 حول التلوين داخل الخلايا ، وقم بإصلاح الخلايا واختراقها (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: نظرا لأن التثبيت يمكن أن يؤثر على شدة التألق لبعض الفلوروفورات ، قم بتقييم كل لوحة مع التثبيت وبدونه. - بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS ، متبوعا بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية قبل تحليل التدفق الخلوي.
5) تلطيخ داخل الخلايا
- استمرارا من الخطوة 4.11 للتثبيت والنفاذية للعلامات داخل الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المناسب. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح المادة الطافية ، وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من محلول عامل التثبيت ؛ أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح الطافع ، وإعادة تعليق الكريات مع الأجسام المضادة داخل الخلايا المخففة في المخزن المؤقت المناسب.
ملاحظة: تعتمد أنواع الأجسام المضادة والتخفيفات على الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال ، إحدى العلامات الشائعة داخل الخلايا هي صندوق رأس الشوكة P3 للخلايا التائية التنظيمية ، والتي تستخدم بشكل متكرر عند تخفيف 1: 100. - احتضان معلق الخلية في الظلام لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت المناسب ، وطرد مركزي التعليق عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول التلوين متبوعا بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي.
6) مقياس الخلايا وإعداد التعويض
- مباشرة قبل تشغيل العينات ، قم بإعداد حبات التعويض (انظر جدول المواد) في حالة استخدام التعويض القائم على الخرز بدلا من التعويض القائم على الخلية.
- قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المنفصلة لكل جسم مضاد مقترن بالفلوروكروم ، وأضف 100 ميكرولتر من 1x PBS متبوعا بقطرة واحدة كاملة من حبات تعويض التحكم السلبي المضادة للفأر وقطرة واحدة من حبات تعويض التحكم الإيجابي لكل أنبوب. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المناسب لكل أنبوب منفصل. دوامة واحتضان لمدة 5 دقائق قبل الاستحواذ.
ملاحظة: نظرا لأن بعض الأصباغ ، مثل BUV737 ، لا يمكن ربطها بالخرز ، استخدم عنصر تحكم قائم على الخلية.
- قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المنفصلة لكل جسم مضاد مقترن بالفلوروكروم ، وأضف 100 ميكرولتر من 1x PBS متبوعا بقطرة واحدة كاملة من حبات تعويض التحكم السلبي المضادة للفأر وقطرة واحدة من حبات تعويض التحكم الإيجابي لكل أنبوب. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المناسب لكل أنبوب منفصل. دوامة واحتضان لمدة 5 دقائق قبل الاستحواذ.
- قم بمعايرة مقياس التدفق الخلوي قبل كل تجربة عن طريق تشغيل إعداد مقياس التدفق الخلوي باستخدام حبات التتبع ، والحفاظ على إعدادات مقياس التدفق الخلوي لكل تجربة.
- قبل تحليل العينة ، اضبط مقياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل عينة غير ملوثة لضبط عدد الخلايا على مخطط التشتت الجانبي (SSC) مقابل التشتت الأمامي (FSC) بحيث يقع عدد الخلايا في وسط المخطط وليس خارج النطاق.
- قم بتشغيل العينة الملطخة لفترة وجيزة لضبط الفولتية ل FSC و SSC ولكل قناة للتأكد من عدم وقوع أي أحداث خارج المقياس اللوغاريتمي لكل قناة. سجل 5000 حدث لكل عنصر تحكم في التعويض ، متبوعا ببوابة السكان الإيجابية والسلبية. احسب مصفوفة التعويض ثم قم بتشغيل العينات ، وجمع ما لا يقل عن 1000 حدث للسكان المعنيين.
ملاحظة: يجب التحقق من التعويض على اللوحات ذات الألوان الأكبر ، حيث يمكن أن يكون التعويض الآلي عرضة للتعويض الزائد أو الناقص. يجب رسم كل معلمة بيانيا مقابل كل معلمة أخرى لمراقبة علامات التعويض الزائد أو الناقص ، ويجب تقييم كل عنصر تحكم أحادي اللون. يجب إجراء تعويض معقد للتجارب ذات الألوان الأكبر بمساعدة متعاون أو منشأة أساسية تتمتع بخبرة واسعة في قياس التدفق الخلوي. تستخدم الأنواع الأحدث من مقاييس التدفق الخلوي مثل مقاييس التدفق الخلوي الطيفي الطيف الكامل للفلوروفور من خلال عملية تعرف باسم فك الخلط الطيفي ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تمييز أنظف للتداخل الفلوري مقارنة بالتعويض القياسي وحده22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
غالبا ما تعتمد عملية تطوير لوحات قياس التدفق الخلوي للتحليل المناعي على مقارنة النتائج بالبيانات الموجودة والأدبيات في هذا المجال. إن معرفة كيفية ظهور السكان في قياس التدفق الخلوي أمر بالغ الأهمية للتفسير الصحيح للبيانات. بغض النظر ، يمكن أن تظهر المجموعات وأنواع الخلايا بشكل مختلف في الأنسجة المختلفة ، لذلك من المتوقع حدوث بعض التباين. في سياق أنسجة التحكم المحددة جيدا ، يمكن تقييم تحسين التلوين هذا مقابل الأنسجة المعروفة التي تحتوي على أنواع خلايا مدروسة جيدا. يوضح الشكل 3 نتائج FACS المكون من 14 لونا على أنسجة الفئران الضابطة. في هذه الحالة ، تم استخدام الطحال لتحديد جميع العلامات التي تم تلطيخها ، ولإظهار أن التلوين كان وظيفيا من الناحية الفنية. من هذه النقطة فصاعدا ، أصبح من الأسهل الاختبار في ظروف غير معروفة ، والثقة في اختيار الفلوروفور ، وتحسين البروتوكول لمصادر الأنسجة المختلفة. يوضح الشكل 3 أيضا تجمعات من أنواع مختلفة من الخلايا معزولة من طحال الفئران19.
هنا ، يمكن ملاحظة العديد من المجموعات السكانية الواضحة ، مثل العدلات Ly6G + ، ومستويات التعبير المختلفة ل Ly6C على فئات وحيدات مختلفة. كانت الخلايا المتغصنة CD11chiMHCII + واضحة بسهولة عند البوابات ضد CD11b لاستبعاد الضامة وخلايا النسب النخاعية الأخرى مثل العدلات والوحيدات. يمكن العثور على مجموعة فرعية من الخلايا المتغصنة CD206 + CD86 + من خلال التركيز على مجموعة CD11c + هذه. تم تضمين CD86 و CD206 في الخلايا النخاعية ذات النمط الظاهري على أنها في حالة استقطاب أكثر شبها ب M1 (CD86hi) مقابل حالة استقطاب تشبه M2 (CD206hi). أظهر F4 / 80 تدرجا في التعبير ، يمكن ملاحظته بشكل شائع في مجموعات البلاعم المختلفة. كان Siglec-F موجودا في مجموعتين ، F4 / 80 + و F4 / 80- ، على الأرجح يتوافق مع مجموعة فرعية من البلاعم والحمضات ، على التوالي. على الرغم من أنه يمكن إجراء هذه التسميات لأنواع الخلايا ، فمن المهم ملاحظة أن الخلايا التي تعبر عن علامات مختلفة يجب أن ينظر إليها بطريقة وظيفية بدلا من التصنيف الثنائي. إن الاعتراف بأن ما يعتبر بلاعم قد يختلف في الطحال وكبسولة الجسم الغريب حول الغرسة ، أمر مهم ويتجنب التفسير الخاطئ المحتمل للنتائج.
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول تلطيخ قياس التدفق الخلوي. يشمل التحضير تشريح الأنسجة ذات الأهمية متبوعا ب 1) التقطيع اليدوي ، 2) الهضم الأنزيمي ، 3) إجهاد الخلايا وغسلها ، و 4) تلطيخ بالأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت متبوعا بتحليل التدفق الخلوي. تم عمل الرسم التوضيحي باستخدام Biorender. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على تخطيط لوحة لتلطيخ قياس التدفق الخلوي. يتضمن هذا التخطيط العينات ، وعناصر التحكم الفلورية ناقص واحد (FMO) ، وضوابط التعويض ، وعينة أنسجة التحكم (الطحال). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية من تلطيخ FACS المكون من 14 لونا على أنسجة الفئران الضابطة. التنميط الظاهري للخلايا النخاعية لخلايا طحال الفئران مع أمثلة على خوارزمية تجميع الجيران العشوائية والآلية (t-SNE) لعرض البيانات. تم استنساخ هذا الرقم من Sadtler و Elisseeff19. الاختصارات: FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلورة ؛ SSC = مبعثر جانبي ؛ CD = مجموعة التمايز ؛ PE = فيكوريثرين. CCR = نوع مستقبلات كيموكين C-C ؛ MHC = مجمع التوافق النسيجي الرئيسي ؛ PerCP = مركب بروتين الكلوروفيل بيريدينين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف / الأجسام المضادة | ميكرولتر لكل عينة |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| سيجليك إف BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c لكل CP / Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE / Dazzle594 | 0.125 |
| F4 / 80 PE / Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| كتلة إف سي | 1 |
| BD بريليانت وتين بلس | 10 |
| 1x برنامج تلفزيوني | 35.975 |
| الحجم الإجمالي: | 50 ميكرولتر |
الجدول 1: مثال على كوكتيل الأجسام المضادة السطحية. مثال كوكتيل الأجسام المضادة للتنميط الظاهري النخاعي لأنسجة الفأر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه المراجعة منهجية مفصلة لعزل الخلايا من غرسات المواد الحيوية للحصول على تعليق خلية موحد. بالإضافة إلى ذلك ، تم توفير بروتوكول مفصل لتلطيخ تعليق الخلية لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، إلى جانب خطوات تكوين مقياس التدفق الخلوي للحصول على أفضل النتائج. يمكن أن تتضمن طرق عزل الخلايا خطوات متعددة ، وغالبا ما تستخدم تشريح الأنسجة اليدوي متبوعا بالهضم الأنزيمي مع الإنزيمات المحللة للبروتين لفصل المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة وتعطيل تقاطعات الخلايا الخلوية لتحرير الخلايا الفردية من الأنسجة. بعد الهضم ، هناك حاجة إلى مزيد من المعالجة ، مثل إجهاد الخلايا ، لإزالة الحطام المتبقي وضمان تعليق خلية واحدة. قد تتطلب بعض العينات التي تحتوي على مستويات عالية من الحطام أو أنواع الخلايا الأخرى (مثل الأورام) تنظيفا أكثر شمولا من خلال استخدام وسائط فصل الكثافة23. بدون تنظيف مناسب للعينة ، قد تنحرف البيانات بسبب الحطام أو مجموعات الخلايا الأخرى التي تحجب السكان موضع الاهتمام. يمكن أن يؤدي الحطام الزائد أيضا إلى انسداد كامل أو جزئي لسوائع مقياس الخلايا.
بينما يمكن أيضا إجراء توصيف الخلايا المناعية بطرق أخرى ، مثل الفحص المجهري الضوئي ، عن طريق إجراء عدد الخلايا التفاضلي على تحضير الخلايا الخلوية ، يوفر قياس التدفق الخلوي توصيفا أكثر دقة للخلايا بناء على علامات سطح الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد بيانات قياس التدفق الخلوي أكثر دقة لأنها يمكن أن تميز وتحدد ملايين الخلايا المعلقة ويمكن أن توفر تقديرات دقيقة لمجموعات فرعية متميزة من الخلايا بشكل أسرع بكثير من العد التفاضلي اليدوي بناء على 400 خليةفقط 24. تعتمد النتائج الموضحة في هذا البحث على تصميم لوحة تكرارية مع اختيار الأجسام المضادة التي تتم باستخدام أدوات متعددة عبر الإنترنت لمقارنة أطياف الإثارة والانبعاث والتداخل النظري اعتمادا على تكوين مقياس الخلايا. عند تصميم تجارب ألوان أكبر ، من الأفضل أن تبدأ من قائمة نظيفة ، بدلا من الإضافة إلى لوحة ألوان أصغر ، وذلك للنظر بشكل كامل في وفرة المستضد ، وسطوع الفلوروفور ، والتداخل الطيفي.
تتطلب الدراسات التي تحلل مجموعات فرعية متميزة من خلايا مناعية محددة عددا كافيا من الخلايا الكلية لإجراء قياس التدفق الخلوي ، حيث أن وجود عدد أقل من الخلايا يمكن أن يشكل تحديا كبيرا في عزلها عن طريق فرز الخلايا أو الحصول على تقديرات دقيقة. يمكن التغلب على هذا التحدي باستخدام حبات مغناطيسية لعزل وإثراء خلايا مناعية معينة ، مثل العدلات ، في فترات أقصر وبغسل محدود25. يمكن أن تحتوي الخلايا المعزولة من أنسجة الأعضاء مثل الرئتين على كميات كبيرة من المخاط ، مما قد يجعل تعليق الخلية "لزجا" ويؤدي إلى زيادة عدد الأحداث المزدوجة أثناء قياس التدفق الخلوي26,27. يمكن أن تؤدي إضافة عوامل مخلبية مثل حمض رباعي الخليك 2 mM من الإيثيلين ديامين إلى المخزن المؤقت للتلطيخ إلى منع تجمع الخلايا في مثل هذه العينات.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تعليق الخلايا في حجم متزايد من المخزن المؤقت أيضا إلى الحد من الإنشاء المزدوج عن طريق تقليل تفاعلات الخلايا والخلايا. يجب تحسين إجراءات التلوين تماما لكل نسيج مختلف ، وبروتوكول تلطيخ ، ومقياس التدفق الخلوي ، ولوحة الأجسام المضادة. يمكن أن تكون بعض الفلوروفورات أكثر حساسية للمثبتات ، وبعض أنواع الخلايا أكثر حساسية لعزل الخلايا المختلفة وطرق المعالجة ، والعديد من أنواع الخلايا تتصرف بشكل مختلف في الأنسجة المختلفة والمواقع المختلفة. من خلال التحضير المناسب والتحليل الدؤوب ، يمكن أن يؤدي قياس التدفق الخلوي إلى تحليل مفصل على مستوى الخلايا والبروتين لتوصيف البيئة الدقيقة المناعية للسقالة والمواد الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، بما في ذلك المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية. إخلاء المسؤولية: لا توصي المعاهد الوطنية للصحة ومسؤولوها وموظفوها أو تصادق على أي شركة أو منتج أو خدمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
