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Immunology and Infection

फेकल (माइक्रो) आरएनए अलगाव

Published: October 28, 2020 doi: 10.3791/61908
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

Summary

यह प्रोटोकॉल पशु और मानव विषयों के फेकल नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को अलग करता है। एक वाणिज्यिक एमआईआरएनए अलगाव किट का उपयोग अनुकूलित मात्रा और गुणवत्ता के साथ शुद्ध आरएनए को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण अनुकूलन के साथ किया जाता है। आरएनए आइसोलेट्स अधिकांश डाउनस्ट्रीम आरएनए परख जैसे अनुक्रमण, माइक्रो-सरणी और आरटी-पीसीआर के लिए अच्छे हैं।

Abstract

यह स्पष्ट हो रहा है कि आरएनए जानवरों और मनुष्यों में आंत लुमेन और मल में मौजूद है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल पशु और मानव विषयों के फेकल नमूनों से माइक्रोआरएनए सहित कुल आरएनए को अलग करता है। इसका उद्देश्य आरएनए अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और माइक्रो-सरणी जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च शुद्धता और मात्रा के साथ कुल आरएनए को अलग करना है। एमआईआरएनए अलगाव में इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के फायदे वर्णित अतिरिक्त धोने के चरणों के साथ अत्यधिक शुद्ध आरएनए उत्पादों को अलग करने की क्षमताएं हैं, नमूने के पुन: निलंबन में एक बेहतर विधि के साथ प्राप्त आरएनए की मात्रा में वृद्धि, और परिशोधन के महत्वपूर्ण सुझाव। एक सीमा 200 मिलीग्राम से अधिक के बड़े नमूने को संसाधित करने और शुद्ध करने में असमर्थता है क्योंकि ये नमूना आकार इंटरफेज़ के स्पष्ट गठन में कठिनाई पैदा करेंगे। नतीजतन, बड़े नमूने का आकार कार्बनिक पदार्थों के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित जलीय चरण को दूषित कर सकता है जो अंत में पृथक आरएनए की गुणवत्ता को प्रभावित करता है। हालांकि, 200 मिलीग्राम तक के नमूने से आरएनए आइसोलेट्स अधिकांश डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त हैं।

Introduction

एक्स्ट्रासेल्युलर आरएनए को एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में पहचाना जा रहा है जो कई जैविक प्रक्रियाओं की मध्यस्थता करता है। मल में एक्स्ट्रासेल्युलर आरएनए को पहली बार 2008 में बृहदान्त्र कैंसर और सक्रिय अल्सरेटिव कोलाइटिस2 के लिए एक मार्कर के रूप में रिपोर्ट किया गया था, और यह हाल ही में आंत लुमेन और मल के एक सामान्य घटक के रूप में सामने आया था और मेजबान-माइक्रोब संचार 3,4,5 की मध्यस्थता करता है। इस आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल का उद्देश्य पशु और मानव विषयों से एकत्र किए गए फेकल नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले बाह्य आरएनए को निकालना है। प्रोटोकॉल को एक वाणिज्यिक एमआईआरएनए आइसोलेशन किट से अनुकूलित किया गया था। अधिग्रहित आरएनए का उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण जैसे आरएनए अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और माइक्रो-सरणी के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल में जानवरों और मनुष्यों के मल में पाए जाने वाले आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए कई महत्वपूर्ण और उपयोगी सुझाव शामिल हैं। आरएनए (माइक्रोआरएनए सहित) अलगाव की इस विधि को विकसित करने और अनुकूलित करने का कारण मल में माइक्रोबियल आरएनए को कम करना, अनुसंधान अध्ययनों में चर को सीमित करना और विभिन्न भ्रामक कारकों और संदूषण के स्रोतों को लेखांकन किए बिना आंत में आरएनए संरचना का विश्लेषण करना है। ध्यान दें, यह आरएनए अलगाव जीवित कोशिका और जीवित रोगाणुओं (सेलुलर आरएनए) से आरएनए की रिहाई को कम करता है। यह बाह्य आरएनए पर केंद्रित है जो आंत कोशिकाओं द्वारा जारी किए गए हैं या भोजन सेवन के माध्यम से अधिग्रहित किए गए हैं। मुख्य रूप से, यह विधि उन अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं है जहां माइक्रोबियल ट्रांसस्क्रिप्टम की जांच की जाती है।

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Protocol

यहां वर्णित अनुसंधान जानवरों से जुड़े सभी तरीकों को ब्रिघम और महिला अस्पताल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

यहां वर्णित मानव अनुसंधान विषयों से जुड़े सभी तरीके पार्टनर्स ह्यूमन रिसर्च कमेटी द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार हैं।

1. फेकल नमूना संग्रह

  1. एक प्रयोग में प्रत्येक पशु विषय के लिए स्क्रू कैप के साथ एक बाँझ और न्यूक्लियस मुक्त 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
    1. मानव विषयों के लिए, प्रत्येक विषय के लिए एक उपयुक्त, न्यूक्लियस-मुक्त और बाँझ मल नमूना संग्रह उपकरण प्रदान करें।
  2. बाँझ वातावरण में प्रत्येक पशु विषय से 25-100 मिलीग्राम (माउस फेकल नमूनों के लिए लगभग 1-4 फेकल छर्रों) फेकल नमूने एकत्र करें।
    नोट: उच्चतम शुद्धता के आरएनए प्राप्त करने के लिए दो या दो से अधिक फेकल छर्रों (~ 50 मिलीग्राम या भारी) को प्राथमिकता दी जाती है।
    1. सभी आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) और सामग्री का उपयोग करें, उदाहरण के लिए: प्रयोगशाला दस्ताने की एक जोड़ी, एक कीटाणुनाशक स्प्रे और एक बाँझ पेपर तौलिया, कार्य क्षेत्र को निष्फल करने के लिए, जहां पशु अनुसंधान विषय रखा गया है, फेकल नमूना संदूषण से बचने के लिए।
      1. मानव विषयों के लिए, प्रत्येक शोध विषय / कलेक्टर को यथासंभव बाँझ वातावरण में 100-200 मिलीग्राम मल के नमूने एकत्र करने का निर्देश दें। मानक बाँझ ऑपरेशन का उपयोग करें और मल नमूना संदूषण से बचें।
  3. संदूषण से बचने के लिए किसी भी अन्य सतहों को छूने के बिना स्क्रू कैप के साथ प्रत्येक पशु विषय से फेकल नमूने सीधे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र करें।
    1. मानव विषयों के लिए, संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक विषय को सीधे प्रदान किए गए लागू संग्रह उपकरण (जैसे, एक बाँझ मल नमूना संग्रह किट) में शौच करने का निर्देश दें।
      नोट: शौचालय की सतहों, पानी, मूत्र, या किसी अन्य गैर-बाँझ सतहों / वस्तुओं द्वारा संदूषण से बचने के लिए निर्देश दें।
  4. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र किए गए फेकल नमूनों को तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें या मल पुन: निलंबन से पहले आरएनए की बेहतर मात्रा और गुणवत्ता के लिए सूखी बर्फ की बाल्टी में रखें जैसा कि नीचे दिए गए चरणों में वर्णित है।
    1. मानव मल के नमूनों के लिए, 200 मिलीग्राम के प्रत्येक ताजा नमूने को स्क्रू कैप के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में मिलाएं और नीचे वर्णित मल पुन: निलंबन से पहले उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
      1. स्क्रू कैप के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में नहीं मल के नमूनों के भंडारण के लिए, 100-200 मिलीग्राम जमे हुए नमूनों को 100-200 मिलीग्राम वजन करें और मल पुन: निलंबन से पहले स्क्रू कैप के साथ अलग-अलग 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
        नोट: मानव मल के नमूनों के लिए, आरएनए अलगाव के लिए 200 मिलीग्राम से अधिक मल नमूने लेने से बचें क्योंकि इससे निम्नलिखित चरणों में कठिनाइयां हो सकती हैं। 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक अतिभारित नमूने के साथ, जलीय चरण, कार्बनिक चरण और इंटरफेज स्पष्ट रूप से नहीं बन सकते हैं और अलग नहीं हो सकते हैं। प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है।

2. धोने के समाधान की तैयारी

  1. 30 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए एमआईआरएनए आइसोलेशन किट ( सामग्री की तालिका देखें) में प्रदान किए गए वॉश सॉल्यूशन 1 में अमेरिकन केमिकल सोसाइटी (एसीएस) ग्रेड 100% इथेनॉल के 21 एमएल जोड़ें, जैसा कि बोतल पर दिखाया गया है। भंवर तब तक जब तक कि सब कुछ बोतल में घुल न जाए।
  2. बोतल पर दिखाए गए अनुसार, 50 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रदान किए गए वॉश सॉल्यूशन 2/3 में एसीएस ग्रेड 100% इथेनॉल का 40 एमएल जोड़ें। 5 सेकंड के लिए या जब तक अंतिम मिश्रण अच्छी तरह से मिश्रित नहीं हो जाता।

3. उपकरण और सामग्री की तैयारी

  1. कार्य क्षेत्र और उपकरणों को स्प्रे करें, उदाहरण के लिए: प्रयोगशाला बेंच, रासायनिक फ्यूम हुड में कार्य क्षेत्र और माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रैक, एक राइबोन्यूक्लिज़ (आरएनएस) परिशोधन समाधान (उदाहरण के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनएस परिशोधन समाधान) के साथ। संदूषण से बचने के लिए, सतहों पर आरएनएस परिशोधन समाधान के साथ लागू करें, जहां भी और जब भी आवश्यक हो।
  2. एक साफ प्रयोगशाला कोट पहनें, चेहरे का मास्क पहनें, और मानव त्वचा पर मौजूद न्यूक्लियस से फेकल नमूनों में आरएनए की रक्षा के लिए उपयुक्त प्रयोगशाला दस्ताने पहनें। आरएनएस परिशोधन समाधान के साथ दस्ताने स्प्रे करें और संदूषण से बचने के लिए दस्ताने को बार-बार बदलें।
  3. मल के पुन: निलंबन से पहले पिघलने से रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत फेकल नमूनों के लिए सूखी बर्फ की एक बाल्टी तैयार करें और सामग्री के लिए बर्फ की एक बाल्टी, उदाहरण के लिए: एसिड-फिनोल: क्लोरोफॉर्म, शेल्फ जीवन को बढ़ाने के लिए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया सहित सामग्री न्यूक्लियस के संदूषण के बिना बाँझ हैं।

4. मल पुन: निलंबन

  1. बाँझ 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (DPBS) के 600 μL में 25-100 मिलीग्राम फेकल नमूनों को पुन: निलंबित करें।
    चेतावनी: मल के नमूनों को आंशिक पिघलने के बिना -80 डिग्री सेल्सियस से पिघलने पर तुरंत संसाधित किया जाना चाहिए ताकि आरएनएस और सेलुलर आरएनए की रिहाई को कम किया जा सके क्योंकि नमूना पिघलने पर बर्फ के क्रिस्टल आंतरिक और बाहरी सेलुलर डिब्बों दोनों को तोड़ देते हैं।
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर फेकल नमूने युक्त स्क्रू कैप के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1x DPBS का 600 μL जोड़ें।
    2. आरटी में 30 मिनट के लिए कवर किए गए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1x DPBS के 600 μL में डूबे फेकल नमूनों के मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. मिश्रण को 1 एमएल पिपेट टिप और भंवर के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के साथ अच्छी तरह से मैश करके फिर से निलंबित करें। आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता को अनुकूलित करने और बढ़ाने के लिए, मिश्रण को एस 4000 (या 4000 आरपीएम) और 45 एस पर एक चक्र के लिए सेटिंग के साथ एक होमोजेनाइज़र के साथ फिर से निलंबित करें।

5. कार्बनिक निष्कर्षण

चेतावनी: एसिड-फिनोल के उपयोग के साथ चरण 6 तक निम्नलिखित चरणों के लिए खतरनाक रासायनिक फ्यूम हुड का उपयोग करें: क्लोरोफॉर्म और एसीएस ग्रेड 100% इथेनॉल उनकी विषाक्तता और ज्वलनशीलता के कारण। आवश्यकतानुसार पीपीई बदलें और खतरनाक सामग्री से निपटने के दौरान उचित मानक सावधानियों का पालन करें।

  1. एसिड-फिनोल के 600 μL के साथ आरएनए निकालें: क्लोरोफॉर्म (एसिड-फिनोल की मात्रा: क्लोरोफॉर्म की आवश्यकता चरण 4.1 में जोड़े गए 1x DPBS की प्रारंभिक मात्रा के बराबर है)।
    1. चरण 4.1 से निलंबन में एसिड-फिनोल के 600 μL जोड़ें: क्लोरोफॉर्म जोड़ें।
      नोट: एसिड-फिनोल वापस लें: बोतल में निचले चरण से क्लोरोफॉर्म क्योंकि ऊपरी चरण एक जलीय बफर के साथ मिलाया जाता है। यदि इन दो चरणों के बीच इंटरफेज़ परेशान है, तो प्रतीक्षा करें और एसिड-फिनोल को वापस लें: क्लोरोफॉर्म केवल तभी जब संक्रमण से बचने के लिए इंटरफेज खुद को फिर से स्थापित करता है।
  2. 60 सेकंड के लिए मिश्रण को अच्छी तरह से मिलाएं। वैकल्पिक रूप से, उपज में आरएनए की मात्रा को अनुकूलित करने और बढ़ाने के लिए, एस 4000 और 45 एस पर एक चक्र के लिए सेटिंग के साथ एक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके मिलाएं।
  3. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज के साथ जलीय और कार्बनिक चरणों को अलग करने के लिए आरटी में 10,000 x g पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, इंटरफेज कॉम्पैक्ट होना चाहिए। यदि नहीं, तो सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
    नोट: यदि सेंट्रीफ्यूजेशन के कई दोहराव के बाद अतिरिक्त एसिड-फिनोल: क्लोरोफॉर्म की मात्रा के लिए प्रारंभिक मात्रा के असमान अनुपात के कारण इंटरफेज वांछित रूप से कॉम्पैक्ट नहीं हो सकता है, तो संदूषण से बचने के लिए अधिक सावधानी के साथ जलीय चरण को पुनर्प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें।
  4. जलीय चरण को पुनर्प्राप्त करें और इसे एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में हिंज कैप (एमआईआरएनए आइसोलेशन किट द्वारा प्रदान नहीं किया गया) के साथ स्थानांतरित करें।
    1. निचले चरण को परेशान किए बिना जलीय (या ऊपरी) चरण को सावधानीसे हटा दें और इसे हिंज कैप के साथ एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। स्थानांतरित मात्रा पर ध्यान दें (उदाहरण के लिए, ~ 500 μL)।
      नोट: जब इंटरफेज़ कॉम्पैक्ट होता है और ऊपरी चरण स्पष्ट रूप से अलग हो जाता है, तो संभवतः जलीय चरण के शीर्ष पर तैरने वाले कुछ छोटे अवशिष्ट कण होते हैं। इन अवशेषों से बचने के लिए पिपेट सावधानी से और केवल गुणवत्ता आरएनए उपज सुनिश्चित करने के लिए स्पष्ट रूप से और स्पष्ट रूप से अलग जलीय चरण को ठीक करें, भले ही आप केवल जलीय चरण की एक छोटी मात्रा प्राप्त कर सकें।

6. अंतिम आरएनए अलगाव

  1. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जलीय चरण में आरटी एसीएस ग्रेड 100% इथेनॉल के 1.25 वॉल्यूम जोड़ें (उदाहरण के लिए, चरण 5.4 से 500 μL जलीय चरण पुनर्प्राप्त होने पर 100% इथेनॉल का 625 μL जोड़ें)। भंवर 3 एस।
  2. एमआरएनए आइसोलेशन किट में प्रदान किए गए फिल्टर कारतूस के माध्यम से जलीय चरण / इथेनॉल मिश्रण लोड करें।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, फ़िल्टर कारतूस को किट द्वारा आपूर्ति की गई संग्रह ट्यूबों में से एक में रखें।
      1. फिल्टर कार्ट्रिज में जलीय चरण / इथेनॉल मिश्रण के 600 μL पिपेट और लोड करें।
        नोट: भंवर मिश्रण को पाइपिंग से पहले जलीय चरण के साथ इथेनॉल को अच्छी तरह से मिलाने के लिए संक्षेप में। इथेनॉल मिश्रण के 700 μL से अधिक एक समय में लोड नहीं किया जा सकता है।
    2. मिश्रण के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए 90 सेकंड के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। उच्च गति पर घूमने से फिल्टर को नुकसान हो सकता है।
    3. छानना छोड़ दें और चरण 6.2.1 से 6.2.2 को दोहराएं जब तक कि सभी मिश्रण लगातार अनुप्रयोगों में एक ही फ़िल्टर झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर न हो जाएं। नीचे दिए गए चरणों को धोने के लिए उसी संग्रह ट्यूब को रखें और पुन: उपयोग करें।
    4. फ़िल्टर को 700 μL miRNA Wash Solution 1 से धो लें।
      सावधानी: मिआरएनए वॉश सॉल्यूशन 1 में गुआनिडाइन थायोसाइनेट होता है जो त्वचा में जलन और गंभीर आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। उदाहरण के लिए आवश्यक पीपीई पहनें: दस्ताने, फेस शील्ड, सुरक्षात्मक प्रयोगशाला कोट। आवश्यकतानुसार दस्ताने बार-बार बदलें।
      1. फ़िल्टर कार्ट्रिज में एसीएस ग्रेड 100% इथेनॉल के साथ तैयार किए गए कामकाजी समाधान, माइआरएनए वॉश सॉल्यूशन 1 के 700 μL लागू करें।
      2. फ़िल्टर कारतूस के माध्यम से मिआरएनए वॉश सॉल्यूशन 1 को फ़िल्टर करने के लिए 60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज।
      3. संग्रह ट्यूब से छानने को छोड़ दें और उसी फ़िल्टर कारतूस को उसी संग्रह ट्यूब में रखें।
    5. फ़िल्टर को वॉश सॉल्यूशन 2/3 के साथ एक-एक बार 700 μL, 500 μL और 250 μL के वॉल्यूम के साथ लगातार धोएं।
      1. फिल्टर कार्ट्रिज में एसीएस ग्रेड 100% इथेनॉल के साथ तैयार किए गए कामकाजी समाधान वॉश सॉल्यूशन 2/3 के 700 μL लागू करें।
        1. 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
        2. संग्रह ट्यूब से छानने को छोड़ दें और उसी फ़िल्टर कारतूस को उसी संग्रह ट्यूब में रखें।
      2. फ़िल्टर कारतूस में 2/3 वॉश सॉल्यूशन के 500 μL लागू करें।
        1. 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
        2. संग्रह ट्यूब से छानने को छोड़ दें और उसी फ़िल्टर कारतूस को उसी संग्रह ट्यूब में रखें।
      3. फ़िल्टर कारतूस में 250 μL वॉश सॉल्यूशन 2/3 लागू करें।
        1. 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
        2. संग्रह ट्यूब से छानने को छोड़ दें।
      4. फ़िल्टर कारतूस को एक नई संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और फ़िल्टर से अवशिष्ट तरल पदार्थ को हटाने के लिए असेंबली को 5 मिनट के लिए घुमाएं।

7. 50 μL न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ एल्यूट आरएनए

  1. फ़िल्टर कारतूस को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिल्टर के केंद्र में न्यूक्लियस मुक्त पानी का पिपेट 50 μL और संग्रह ट्यूब को कैप करें।
    1. 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    2. नए संग्रह ट्यूब में आरएनए को पुनर्प्राप्त करने के लिए 8,000 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें।
    3. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके पुनर्प्राप्त फेकल आरएनए की एकाग्रता और शुद्धता निर्धारित करें। पुनर्प्राप्त फेकल आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

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Representative Results

प्रतिनिधि आरएनए को क्रमशः 50 मिलीग्राम माउस फेकल नमूनों (2 माउस फेकल छर्रों) और 100 मिलीग्राम मानव मल नमूनों से अलग किया गया था और 50 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी में अलग किया गया था। एकाग्रता के स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण से पता चलता है कि क्रमशः 49 μg और 16 μg RNA की कुल मात्रा को अलग किया गया था (तालिका 1)। आरएनए शुद्धता उच्च थी जैसा कि ~ 2.0 के A260/A280 अनुपात और ~ 1.8 के A260/A230 अनुपात द्वारा दर्शाया गया था (तालिका 1)। जैसा कि3 बताया गया है, मल में अधिकांश आरएनए माइक्रोआरएनए हैं और वे माइक्रोआरएनए एक्सोसोम में मौजूद हो सकते हैं। इसके अनुरूप, आरएनए के एक चिप-आधारित वैद्युतकणसंचलन परख से पता चलता है कि माउस और मानव मल से प्रतिनिधि आरएनए आइसोलेट्स 18 एस और 28 एस आरआरएनए रचनाओं में कम या कमी है, और आरएनए आइसोलेट्स का आकार छोटे आरएनए क्षेत्र (चित्रा 1 ए) में आता है। चिप-आधारित वैद्युतकणसंचलन के साथ एक और छोटे आरएनए वैद्युतकणसंचलन से पता चलता है कि आरएनए का एक बड़ा हिस्सा माइक्रोआरएनए आकार का है (चित्रा 1 बी)। यह अवलोकन के अनुरूप है कि एक छोटे आरएनए बायोएनालाइज़र का उपयोग करके पूरा किया गया परिमाणीकरण पिछले परख6 के साथ प्राप्त मात्रा के बराबर है।

नमूना ID क्षालन की मात्रा (μL) आरएनए सांद्रता (ng/μL) A260/A280 A260/A230 उपज (एनजी)
चूहा 50 978.333 2.036 1.897 48916.65
मानवीय 50 330.759 1.981 1.849 16537.95

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल के साथ पृथक आरएनए का प्रतिनिधि नैनोड्रॉप विश्लेषण। प्रतिनिधि आरएनए को 2 माउस फेकल छर्रों या 100 मिलीग्राम मानव मल नमूनों से अलग किया गया था, जो 50 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी में पाए गए थे। आरएनए एकाग्रता, ए 260 /ए 280 का अनुपात, और ए 260 / ए 230 का अनुपात नैनोड्रॉप के साथ मापा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: फेकल आरएनए आइसोलेट्स के आकार वितरण के प्रतिनिधि चिप-आधारित वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण। (ए) यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके 2 माउस फेकल छर्रों (बाएं पैनल) और 100 मिलीग्राम मानव मल नमूनों (दाएं पैनल) से अलग प्रतिनिधि आरएनए को चिप-आधारित वैद्युतकणसंचलन परख का उपयोग करके विशेषता दी गई थी। इस परख से पता चलता है कि अधिकांश आरएनए आइसोलेट्स छोटे आरएनए थे। (बी) आइसोलेट्स के आकार वितरण का विश्लेषण करने के लिए चिप-आधारित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली के साथ छोटे आरएनए वैद्युतकणसंचलन के अधीन आइसोलेट्स को तब किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अलगाव 7 के दौरान RNase संदूषण को रोकने के लिए RNase-मुक्त तकनीक का उपयोग करना महत्वपूर्णहै। सेंट्रीफ्यूजेशन और एक कॉम्पैक्ट इंटरफेज के गठन के बाद, जलीय चरण को पुनर्प्राप्त करते समय जलीय चरण के शीर्ष पर तैरने वाले इंटरफेज, निचले चरण और कण संदूषक से बचना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, अनुकूलित गुणवत्ता के लिए फिल्टर झिल्ली में दूषित पदार्थों को खत्म करने के लिए 500 μL और 250 μL वॉश सॉल्यूशन 2/3 के साथ दो धोने के चरण जोड़े जाते हैं। इसके अलावा, 200 मिलीग्राम से अधिक की प्रारंभिक नमूना सामग्री की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह एक इंटरफ़ेज़ के स्पष्ट गठन में कठिनाई पैदा कर सकता है। इसी तरह, 25 मिलीग्राम से कम की नमूना सामग्री की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए नमूने निकालने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती है।

माइक्रोबायोम अध्ययन में अविश्वसनीय वृद्धि ने माइक्रोबियल प्रजातियों, जीन के माप को माइक्रोबियल प्रोफाइल 8 के मेटाट्रांसक्रिप्शनल अध्ययन के लिए प्रेरितकिया है। मल में माइक्रोआरएनए का अध्ययन बीमारियों 9,10,11 के मार्कर के रूप में किया गया है। फेकल माइक्रोआरएनए की पहली रिपोर्ट के बाद से मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन3 की मध्यस्थता, बढ़ते अध्ययन आंत पारिस्थितिकी तंत्र में मेजबान और आहार के योगदान की जांच करना शुरू करते हैं 12,13,14। ध्यान दें, आंत लुमेन और मल में रोगाणुओं की समृद्धि के कारण, मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के मेजबान हाथ पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययन रोगाणुओं से न्यूनतम आरएनए संदूषण की मांग करते हैं। इस प्रकार, एक आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल जिसमें सेल लाइसिंग15 के चरण शामिल हैं, मेजबान और आहार से जारी आरएनए के अध्ययन के लिए आदर्श नहीं है। जैसे, हमने मल में जीवित बैक्टीरिया और जीवित मेजबान कोशिकाओं से आरएनए के संदूषण को कम करने के लिए लाइसिस चरणों को खत्म करने के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया।

यह प्रोटोकॉल उन अध्ययनों के लिए काम करता है जहां फेकल या आंत लुमेन सामग्री में बाह्य आरएनए रुचि का एक उद्देश्य है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पृथक आरएनए कुल आरएनए है, जिसमें प्रमुख घटक के रूप में माइक्रोआरएनए शामिल है। यह प्रोटोकॉल यह भेद नहीं करता है कि आरएनए एक्सोसोम, माइक्रोवेसिकल्स या पुटिका-मुक्त रूप में है या नहीं।

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Disclosures

लेखक इस प्रोटोकॉल पेपर में वर्णित अनुसंधान पद्धति से संबंधित कोई प्रासंगिक या भौतिक वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हमें बायोएनालाइज़र के लिए हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में बायोपॉलिमर सुविधा से तकनीकी सहायता मिली। इस काम को नेशनल मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी रिसर्च ग्रांट आरजी -1707-28516 (एचएलडब्ल्यू और एसएल) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 164 माइक्रोआरएनए फेकल नमूने मल नमूने आरएनए अलगाव कुल आरएनए एमआईआरएनए
फेकल (माइक्रो) आरएनए अलगाव
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Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. … More

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

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