Summary
We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .
Abstract
Xenopus laevis ei-extracten, die traditioneel worden gebruikt voor biochemische bulktests, zijn naar voren gekomen als een krachtig op beeldvorming gebaseerd hulpmiddel voor het bestuderen van cytoplasmatische verschijnselen, zoals cytokinese, mitotische spindelvorming en assemblage van de kern. Voortbouwend op vroege methoden die vaste extracten in beeld brachten die op schaarse tijdstippen waren bemonsterd, beeldden recente benaderingen live-extracten af met behulp van time-lapse-microscopie, waarbij meer dynamische kenmerken met verbeterde temporele resolutie werden onthuld. Deze methoden vereisen meestal geavanceerde oppervlaktebehandelingen van het beeldvormende vat. Hier introduceren we een alternatieve methode voor live beeldvorming van ei-extracten die geen chemische oppervlaktebehandeling vereisen. Het is eenvoudig te implementeren en maakt gebruik van in massa geproduceerde laboratorium verbruiksartikelen voor beeldvorming. We beschrijven een systeem dat kan worden gebruikt voor zowel wide-field als confocale microscopie. Het is ontworpen voor het afbeelden van extracten in een 2-dimensionaal (2D) veld, maar kan eenvoudig worden uitgebreid naar beeldvorming in 3D. Het is zeer geschikt voor het bestuderen van ruimtelijke patroonvorming binnen het cytoplasma. Met representatieve gegevens demonstreren we de typische dynamische organisatie van microtubuli, kernen en mitochondriën in interfase-extracten die met deze methode zijn bereid. Deze beeldgegevens kunnen kwantitatieve informatie verschaffen over cytoplasmatische dynamica en ruimtelijke organisatie.
Introduction
Het cytoplasma vormt het hoofdvolume van een cel en heeft een aparte organisatie. De ingrediënten van het eukaryote cytoplasma kunnen zichzelf assembleren tot een breed scala aan ruimtelijke structuren, zoals microtubule-asters en het Golgi-apparaat, die op hun beurt dynamisch worden gerangschikt en omgedraaid, afhankelijk van de identiteit en fysiologische toestand van de cel. Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie van het cytoplasma en de link met cellulaire functies is dus belangrijk om te begrijpen hoe de cel werkt. Xenopus laevis ei-extracten worden traditioneel gebruikt voor biochemische bulktests 1,2,3,4,5,6,7,8, maar recent werk vestigt ze als een krachtig live beeldvormingssysteem voor mechanistische studies van cytoplasmatische structuren en hun cellulaire functies 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Deze onverdunde extracten behouden vele structuren en functies van het cytoplasma, terwijl ze directe manipulaties van cytoplasmatische inhoud mogelijk maken die niet haalbaar zijn in conventionele celgebaseerde modellen 19,20. Dit maakt ze ideaal voor het karakteriseren van cytoplasmatische verschijnselen en het ontleden van hun mechanistische onderbouwing.
Bestaande methoden voor het afbeelden van extracten vereisen chemische oppervlaktemodificaties of fabricage van microfluïdische apparaten. Een op coverslip gebaseerde methode vereist polyethyleenglycol (PEG) passivering van glazen coverslips21. Een op micro-emulsie gebaseerde methode vereist dampafzetting van trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan op glasoppervlakken22,23. Microfluïdische systemen maken nauwkeurige controle van het volume, de geometrie en de samenstelling van extractdruppels mogelijk, maar vereisen gespecialiseerde microfabricagefaciliteiten 11,12,24.
Hier introduceren we een alternatieve methode voor het afbeelden van ei-extracten die gemakkelijk te implementeren is en gebruik maakt van direct beschikbare, goedkope materialen. Dit omvat de voorbereiding van een beeldkamer met een dia en een coverslip bedekt met gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) tape. De kamer kan worden gebruikt voor beeldvormingsextracten met een verscheidenheid aan microscopiesystemen, waaronder stereoscopen en rechtopstaande en omgekeerde microscopen. Deze methode vereist geen chemische behandeling van oppervlakken, terwijl een vergelijkbare optische helderheid wordt bereikt die wordt verkregen met bestaande op glas gebaseerde methoden die hierboven zijn besproken. Het is ontworpen om een laag extracten met een uniforme dikte over een 2D-veld af te beelden en kan eenvoudig worden uitgebreid om een 3D-volume aan extracten af te beelden. Het is zeer geschikt voor time-lapse beeldvorming van collectief cytoplasmatisch gedrag over een groot gezichtsveld.
We hebben interfase-arrested ei-extracten gebruikt om onze beeldvormingsmethode te demonstreren. Het extractpreparaat volgt het protocol van Deming en Kornbluth19. Kortom, eieren die van nature zijn gearresteerd in de metafase van meiose II worden verpletterd door een spin met lage snelheid. Deze spin bevrijdt het cytoplasma van meiotische arrestatie en laat het extract in de interfase gaan. Normaal gesproken wordt cytochalasine B toegevoegd voorafgaand aan de verpletterende spin om de vorming van F-actine te remmen. Het kan echter worden weggelaten als F-actine gewenst is. Cycloheximide wordt ook toegevoegd voorafgaand aan de breekspin om te voorkomen dat het interfase-extract de volgende mitose binnendringt. De extracten worden vervolgens in de eerder genoemde beeldvormende kamers geplaatst en op een microscoop gelegd. Ten slotte worden beelden in de loop van de tijd met gedefinieerde intervallen opgenomen door een camera die op de microscoop is aangesloten, waardoor time-lapse-beeldreeksen worden geproduceerd die het dynamische gedrag van het extract in een 2D-veld vastleggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Stanford University.
1. Voorbereiding van dia's en coverslips
- Breng een laag gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP) plakband aan op een glasplaat met een rolapplicator. Knip overtollige tape over de randen af met een schoon scheermesje. Bereid FEP tape-coated coverslips op dezelfde manier voor (figuur 1A).
- Breng een dubbelzijdige plakkerige beeldafstandhouder aan op de fep-tape-gecoate kant van de dia. Laat de beschermende voering aan de bovenkant ongepeld (figuur 1A).
OPMERKING: De dia's en coverslips moeten vóór het experiment worden voorbereid. Ze kunnen onmiddellijk worden gebruikt of in dozen worden opgeslagen om stofophoping op oppervlakken te voorkomen. De put in de beeldvormende afstandhouder is 120 μm diep en heeft een diameter van 9 mm.
2. Bereiding en live beeldvorming van interfase-arresteerde ei-extracten
OPMERKING: Het volgende protocol is aangepast van Deming en Kornbluth19, Murray20 en Smythe en Newport25 met wijzigingen. Alle stappen moeten bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
- Injecteer drie tot tien dagen voor het verzamelen van eieren volwassen vrouwelijke Xenopus laevis kikkers subcutaan in de dorsale lymfezak met 100 IE serumgonadotrofine (PMSG) van drachtige merrie.
- Zestien tot achttien uur voorafgaand aan de geplande eiverzameling, injecteer de kikkers vanaf stap 2.1 met 500 IE humaan choriongonadotrofine (hCG). Laat kikkers bij 18 °C in de legbuffer van eieren (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4·7H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, bereid als een 20x stamoplossing bij pH 7,4 en verdun met schoon kikkertankwater tot 1x voor gebruik) totdat het ei wordt verzameld.
- Verzamel op de dag van het experiment eieren in een grote glazen petrischaal en beoordeel de eikwaliteit. Gooi eieren weg die eruit zien als witte gezwollen ballen of in een touwtje verschijnen (figuur 1B). Onderzoek de eieren onder een stereoscoop, houd de eieren met een normaal uiterlijk (figuur 1C) en gooi die met onregelmatig of gevlekt pigment weg (figuur 1D).
OPMERKING: Dit protocol werkt met eieren verzameld van een enkele kikker, die meestal 25 ml eieren legt tegen 16 uur na hCG-injectie. Meestal worden in totaal 3 tot 6 kikkers geïnduceerd door hCG en wordt de kikker met de hoogste eikwaliteit gekozen voor het extractbereidingsexperiment. - Breng eieren over in een glazen bekerglas van 400 ml en verwijder zoveel mogelijk eierlegbuffer door te decanteren.
- Incubeer de eieren in 100 ml vers bereide dejellying-oplossing (2% met L/v L-cysteïne in water, pas aan pH 8,0 met NaOH) en draai ze voorzichtig periodiek. Giet na ongeveer 3 minuten de oplossing af en voeg 100 ml verse dejellying-oplossing toe. Ga door met de incubatie totdat de eieren goed verpakt zijn (geen ruimte tussen de eieren), maar vermijd eieren langer dan in totaal 5 minuten in de dejellying-oplossing te laten zitten.
- Verwijder zoveel mogelijk van de dejellying-oplossing door te decanteren en was de eieren in 0,25x MMR-buffer (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, bereid als een 10x stockoplossing, aangepast aan pH 7,8 met NaOH en verdund in Milli-Q water voor gebruik) door de buffer toe te voegen, de eieren draaien en dan de buffer afgieten. Herhaal dit een paar keer totdat in totaal 1 L van de buffer is gebruikt voor de wasbeurten.
- Was de eieren een paar keer met in totaal 400 ml eierlysisbuffer (250 mM sucrose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, vers gemaakt en aangepast aan pH 7,7 met KOH). Verwijder eieren met een abnormaal uiterlijk met behulp van een Pasteur-pipet tussen de wasbeurten.
OPMERKING: Eieren met een abnormaal uiterlijk verwijzen naar eieren die eruit zien als witte gezwollen ballen (figuur 1B), gevlekte pigmentatie hebben (figuur 1D), verslechteren met een groeiend wit gebied (figuur 1E) of donker en samengetrokken gepigmenteerd gebied op het halfrond van dieren vertonen (figuur 1F). - Breng met behulp van een transferpipet met de punt wijd opengesneden de eieren over naar een 17 ml centrifugebuis met ronde bodem die 1 ml eierlysisbuffer bevat. Draai de buis in een klinische centrifuge op 400 x g gedurende 15 seconden om de eieren te verpakken.
- Verwijder zoveel mogelijk van de eierlysisbuffer van de bovenkant van de verpakte eieren met behulp van een Pasteur-pipet.
OPMERKING: Het is belangrijk om zoveel mogelijk buffer uit de verpakte eieren te verwijderen, om de verdunning van het ei-extract te minimaliseren. Soms is het nodig om wat losse eieren samen met de restbuffer te verwijderen om dit te bereiken. - Bepaal het geschatte volume van de verpakte eieren en voeg vervolgens 5 μg / ml aprotinine, 5 μg / ml leupeptine, 5 μg / ml cytochalasine B en 50 μg / ml cycloheximide direct bovenop de verpakte eieren toe.
OPMERKING: Aprotinine en leupeptine zijn proteaseremmers. Cytochalasine B remt actinepolymerisatie, waardoor het extract niet samentrekt en gelelt26. Cycloheximide remt de eiwitsynthese, waardoor het extract in de interfase van de celcyclus blijft. - Plet de eieren door de buis gedurende 15 minuten te centrifugeren op 12.000 x g, 4 °C, in een zwaaiende emmerrotor.
OPMERKING: Aan het einde van de centrifugatie moeten de eieren zijn gescheurd en het lysaat zijn gescheiden in drie hoofdlagen: een gele lipidelaag bovenop, het cytoplasmatisch extract (ook wel ruw extract genoemd) in het midden en een donkere dichte laag met de pigmentkorrels aan de onderkant (figuur 1G). - Bevestig een naald van 18 gauges aan een spuit. Met de schuine kant van de naaldpunt naar boven gericht, doorprikt u de buis vanaf de zijkant aan de onderkant van de cytoplasmatische laag en herstelt u het extract door langzaam te tekenen.
OPMERKING: Trek het cytoplasmatische extract langzaam aan om te voorkomen dat het verontreinigende gehalte uit de gele lipidelaag wordt opgenomen. - Breng het teruggewonnen cytoplasmatische extract over naar een nieuwe microcentrifugebuis en houd het op ijs. Gebruik het extract binnen 1 uur.
- Wanneer u klaar bent om te worden afgebeeld, vult u het extract aan met de gewenste reagentia en fluorescentiebeeldvormingsondes.
OPMERKING: Fluorescentiebeeldvormingsondes labelen specifieke cytoplasmatische structuren zodat ze kunnen worden gevisualiseerd door een fluorescentiemicroscoop. - Verwijder de bovenste beschermende voering van de beeldvormende afstandhouder op de dia die in stap 1.2 is voorbereid en deponeer ongeveer 7 μL extract in het midden van de put. Breng onmiddellijk de FEP tape-gecoate coverslip aan met de FEP-kant naar het extract gericht om de put af te dichten. Ga snel verder met beeldvorming (figuur 1H,I).
- Plaats de dia op een omgekeerde of rechtopstaande microscoop met een gemotoriseerd podium en een digitale camera. Beeld de extracten af op de gewenste ruimtelijke posities en tijdsintervallen in zowel bright-field als fluorescentiekanalen.
OPMERKING: Meestal wordt een 5x-objectief gebruikt voor beeldvorming. De gemotoriseerde fase maakt geautomatiseerde beeldacquisitie mogelijk op meerdere gedefinieerde ruimtelijke posities. Bright-field microscopie visualiseert cytoplasmatische structuren met verschillende graden van transparantie. Fluorescentiemicroscopie visualiseert de cytoplasmatische structuren die specifiek zijn gelabeld door de fluorescentiebeeldvormingsondes die in stap 2.14 zijn toegevoegd. De camera registreert time-lapse beelden van deze structuren en legt daarmee de dynamiek van cytoplasmatische organisatie vast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus laevis ei-extracten kunnen worden gebruikt om de zelforganisatie van het cytoplasma tijdens de interfase te bestuderen. Figuur 2A toont de resultaten van een succesvol experiment. We vulden interfase-arresteerde extracten aan met gedemembraneerde Xenopus laevis spermakernen19 in een concentratie van 27 kernen/μL en 0,38 μM gezuiverd GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (fusie-eiwit bestaande uit glutathion-S-transferase, groen fluorescerend eiwit en een nucleaire lokalisatiesequentie) om reconstitutie en visualisatie van interfasekernen mogelijk te maken. We hebben ook 1 μM fluorescerend gelabeld tubuline toegevoegd om microtubuli te visualiseren, en 500 nM MitoTracker Red CMXRos om mitochondriën te visualiseren. Enkele ogenblikken nadat het extract in de beeldkamer was geplaatst, leek het cytoplasma ongeorganiseerd. In de loop van de volgende 30 minuten bij kamertemperatuur begon het cytoplasma zichzelf te organiseren in celachtige compartimenten. Microtubule asters groeiden uit centrosomen geïntroduceerd met de spermakernen en vormden microtubule-uitgeputte grenszones wanneer ze werden geconfronteerd met microtubuli van naburige asters. GST-GFP-NLS-eiwit getransloceerd in de ronde interfasekernen zelf geassembleerd uit de toegevoegde gedemembraneerde spermakernen. Gebieden uitgeput van lichtverstrooiende cytoplasmatische componenten waren zichtbaar in zowel heldere veld- als mitochondriënkanalen (figuur 2A, 20 min en 35 min). Mitochondriën raakten ook uitgeput van de grenzen die door microtubuli werden vastgesteld en werden verrijkt in geïsoleerde compartimenten die uitlijnden met microtubulicompartimenten. Tegen 60 minuten bij kamertemperatuur moet een ruimtelijk patroon bestaande uit celachtige compartimenten goed zijn vastgesteld, met microtubuli die een holle kransachtige structuur vormen en mitochondriën die duidelijk in elk compartiment zijn verdeeld (figuur 2A, 53 min).
Figuur 2B vergelijkt de extractprestaties in beeldkamers met en zonder FEP-tapes op glas. We vulden interfase-arresteerde extracten aan met gedemembraneerde Xenopus laevis spermakernen19 in een concentratie van 27 kernen/μL en 0,35 μM GST-mCherry-NLS 27,28,29,30 (fusie-eiwit bestaande uit glutathion-S-transferase, mCherry fluorescerend eiwit en een nucleaire lokalisatiesequentie) om reconstitutie en visualisatie van interfasekernen mogelijk te maken. We hebben ook 1 μM fluorescerend gelabeld tubuline toegevoegd om microtubuli te visualiseren. Verschillen in dynamiek werden duidelijk met ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur. In de kamer gemaakt met FEP-getaped glas, het extract zelf georganiseerd in normale celachtige patronen (figuur 2B, afbeeldingen in rijen 1 en 3). In de kamer waar glazen oppervlakken niet werden bedekt door de FEP-tape (onbewogen), vertoonde het extract abnormale heldere veld- en microtubulepatronen die in de loop van de tijd steeds meer verstoord raakten (figuur 2B, afbeeldingen in rijen 2 en 4). Er werden geen significante verschillen waargenomen in de nucleaire import van het GST-mCherry-NLS-eiwit (figuur 2B, afbeeldingen in rijen 5 en 6).
Figuur 1: Schema's en foto's met betrekking tot de experimentele procedure. (A) Schematisch diagram voor het voorbereiden van FEP tape-gecoate glazen coverslips en dia's. (B) Xenopus laevis eieren afgezet in eier leg buffer, met voorbeelden van eieren van slechte kwaliteit aangegeven met pijlen. Gele pijlen, voorbeelden van eieren die eruit zien als witte gezwollen ballen. Rode pijlen, voorbeelden van eieren die in een touwtje verschijnen. (C) Voorbeelden van Xenopus laevis eieren met een normaal uiterlijk. (D) Voorbeelden van eieren van slechte kwaliteit met onregelmatig of gevlekt pigment. (E) Een verslechterend ei met een groeiend wit gebied. (F) Een ei dat een donker en samengetrokken gepigmenteerd gebied vertoont, mogelijk als gevolg van parthenogenetische activering. (G) De lagen gevormd door gescheurde Xenopus laevis eieren na de 12.000 x g centrifugatie in stap 2.11. (H) Schema's voor het voorbereiden van de extractbeeldvormingskamer in stap 2.15. (I) Een foto van een voorbereide beeldkamer met daarin een ei-extract. (C) en (D) delen dezelfde schaalbalk onderaan (D). (E) en (F) delen dezelfde schaalbalk onderaan (F). De schaalstaven in (B) (C) (D) (E) (F) en (I) zijn bij benadering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Interfase-arresteerde ei-extracten organiseren zichzelf in celachtige compartimenten. (A)Time-lapse montage van zelfgeorganiseerde patroonvorming in een dunne laag (120 μm) interfase-arresteerd Xenopus laevis ei-extract. Het extract werd aangevuld met 27 kernen/μL gedemembraneerde Xenopus laevis spermakernen om reconstitutie van de interfasekernen mogelijk te maken. Microtubuli werden gevisualiseerd door HiLyte 647-gelabelde tubuline (weergegeven in magenta), mitochondriën door MitoTracker Red CMXRos (weergegeven in rood) en kernen door GST-GFP-NLS (weergegeven in groen). (B) Zelfgeorganiseerde patroonvorming in interfase-arresteerde Xenopus laevis ei-extracten geplaatst in kamers met en zonder met FEP-tape bedekte glazen oppervlakken. De extracten werden aangevuld met 27 kernen/μL gedemembraneerde Xenopus laevis spermakernen om reconstitutie van de interfasekernen mogelijk te maken. Microtubuli werden gevisualiseerd door HiLyte 488-gelabelde tubuline (weergegeven in magenta) en kernen door GST-mCherry-NLS (weergegeven in groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Optionele secundaire afdichting voor de beeldkamer. Schema's voor het bereiden van een optionele secundaire afdichting met minerale olie om te voorkomen dat het extract langdurig contact met lucht krijgt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis ei-extracten zijn naar voren gekomen als een krachtig modelsysteem voor op beeldvorming gebaseerde studies van verschillende subcellulaire structuren 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 en cytoplasmatische organisatie op een geheel celschaal9. Hier hebben we een live beeldvormingsmethode beschreven die geschikt is voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie in 2D. De effectiviteit van de methode wordt aangetoond door representatieve resultaten.
Verschillende stappen zijn van cruciaal belang voor het succes van de methode. De kwaliteit van eieren is belangrijk voor extracten, dus stappen 2.3 en 2.7 zijn van cruciaal belang. In onze ervaring heeft het dierlijke halfrond van hoogwaardige eieren een uniforme pigmentatie, een duidelijke witte stip in het midden (indicatief voor kiemblaasjesafbraak, GVBD) en een duidelijke grens met de plantaardige hemisfeer (figuur 1C). De extracten gemaakt van hoogwaardige eieren hebben betere prestaties onder onze beeldvormingsomstandigheden. Als meer dan 5% van de eieren gevlekt pigment heeft (figuur 1D), donkerder en samengetrokken gepigmenteerd gebied heeft (figuur 1F), eruitziet als witte gezwollen ballen (figuur 1B), in een touwtje verschijnt (figuur 1B) of tekenen van verslechtering vertoont na de wasbeurten in stap 2.6 en 2.7 (figuur 1E), moet de hele partij eieren worden weggegooid. De extracten behouden een opmerkelijke biologische activiteit omdat ze in wezen onverdund cytoplasma zijn. Daarom is de stap die gericht is op het minimaliseren van verdunning van het extract (stap 2.9) belangrijk voor het succes van het experiment. Voor beeldvorming worden extracten in zeer kleine volumes behandeld en zullen ze snel verdampen bij langdurig contact met lucht. Dit zal hun activiteit negatief beïnvloeden. Daarom moet het in stap 2.15, nadat het extract is gedeponeerd, zo snel mogelijk worden verzegeld met de fep-tape-gecoate kant van de coverslip. Afdichting kan visueel worden bevestigd door de textuurverandering op de contactplaats tussen de lijm op de afstandhouder en de afdekplaat. De afstandhouder moet in staat zijn om een volledige afdichting te creëren als deze op de juiste manier wordt aangebracht. Als echter een extra afdichting gewenst is, kan minerale olie worden afgegeven tussen de overhang van de afdekplaat en de glazen glijbaan. De olie kan een extra afdichting rond de afstandhouder vormen door capillaire werking (figuur 3). Passivering van glasoppervlakken kan niet-specifieke adsorptie van moleculen verminderen, en het is belangrijk voor interfase microtubule asters in extracten21,37. Het aanbrengen van FEP-tape over een hier beschreven glasoppervlak lijkt vergelijkbare voordelen te bieden, zoals gesuggereerd door de assemblage van normale interfase microtubule asters (figuur 2, 6 min). Daarom is stap 1.1 ook van cruciaal belang.
We demonstreerden de toepassing van een beeldvormingsmethode met behulp van interfase-arrested ei-extracten volgens het protocol van Deming en Kornbluth19. Standaard vult het protocol de extracten aan met de actinepolymerisatieremmer cytochalasine B om gelation-contractie in de extracten na langdurige incubatie bij kamertemperatuurte voorkomen 26. Om actinepolymerisatie mogelijk te maken en actinedynamiek te observeren, kan men het cytochalasine B in stap 2.10 van het protocol9 weglaten. Een wijziging die we hebben aangebracht in het Deming en Kornbluth protocol is dat we extracten niet aanvullen met een energiemix om ATP19 te regenereren. Dit komt omdat in onze handen, in extracten aangevuld met deze ATP-regenererende mix19 en spermakernen, microtubuli af en toe een verknoopt rooster vormen dat de cytoplasmatische patroonvorming verstoort. Daarom bevat het protocol niet de stap die de energiemix toevoegt aan de extracten19.
Het interfase-extractprotocol vertrouwt op het pletten van eieren in EGTA-vrije buffer om ze te bevrijden van meiotische arrestatie (CSF-arrestatie)37. De extracten gaan vervolgens verder in de interfase en worden door cycloheximide in de interfase bewaard. Er zijn andere gevestigde methoden voor het bereiden van interfase-extracten. Sommige methoden bereiden eerst extracten voor die meiotische arrestatie handhaven door eieren in lysisbuffer te pletten met EGTA38, en geven vervolgens de arrestatie vrij door calcium toe te voegen, waardoor het extract in interfase 21,37,39 wordt gedreven. De extracten kunnen vervolgens in de interfase worden gehouden door toevoeging van eiwitsyntheseremmers zoals cycloheximide37,39. Andere methoden activeren eieren parthenogenetisch met calciumionofoor (A23187) of elektrische schok om ze te bevrijden van meiotische arrestatie, voordat de eieren worden geplet in afwezigheid van EGTA20,28 (beoordeeld in Field et al.37). Deze extracten kunnen de interfase binnendringen, maar zullen daar meestal niet blijven omdat ze meerdere celcycli kunnen ondergaan. Evenzo zijn gevestigde methoden geoptimaliseerd voor het bereiden van extracten met intact actinecytoskelet ontwikkeld 10,37,39. De beeldvormingsmethode kan geschikt zijn voor dit soort extracten, maar we hebben het er niet mee getest.
Met het oog op het in beeld brengen van de interne organisatie van het cytoplasma, zijn de hier gepresenteerde beeldvormingssystemen relatief eenvoudig in te stellen, waarbij alleen een FEP-tape op glazen oppervlakken hoeft te worden aangebracht. Het maakt assemblage van cytoskeletale structuren mogelijk in extracten9 gerapporteerd in meer geavanceerde beeldvormingssystemen waar glazen oppervlakken worden gepassiveerd met poly-L-lysine-g-polyethyleenglycol (PLL-g-PEG) behandeling of gecoat met ondersteunde lipide bilayers10,21. Met de methode kan de extractlaag zich vormen met een gedefinieerde dikte (bepaald door de diepte van de afstandhouder, die 120 μm is voor het systeem dat wordt weergegeven in figuur 1A, 1H, 1I en figuur 2). We kunnen de dikte aanpassen door extra afstandhouders te stapelen. We hebben tot 6 van dergelijke afstandhouders (720 μm dik) gestapeld en de compartimenten zijn normaal gevormd. Deze flexibiliteit maakt toekomstige toepassingen mogelijk, zoals beeldvorming van de extracten in 3D met behulp van confocale of light-sheet microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken J. Kamenz, Y. Chen en W. Y. C. Huang voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 en R35 GM131792) toegekend aan James E. Ferrell, Jr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W.
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
