Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .
Abstract
Xenopus laevis-Ei-Extrakte, die traditionell für biochemische Massentests verwendet werden, haben sich zu einem leistungsstarken bildgebenden Werkzeug für die Untersuchung zytoplasmatischer Phänomene wie Zytokinese, mitotische Spindelbildung und Aufbau des Kerns entwickelt. Aufbauend auf frühen Methoden, bei denen feste Extrakte abgebildet wurden, die zu spärlichen Zeitpunkten abgetastet wurden, nähern sich neueren Ansätzen Live-Extrakten mit Zeitraffermikroskopie und zeigen dynamischere Merkmale mit verbesserter zeitlicher Auflösung. Diese Methoden erfordern in der Regel anspruchsvolle Oberflächenbehandlungen des bildgebenden Gefäßes. Hier stellen wir eine alternative Methode zur Live-Bildgebung von Ei-Extrakten vor, die keine chemische Oberflächenbehandlung erfordern. Es ist einfach zu implementieren und verwendet massenproduzierte Laborverbrauchsmaterialien für die Bildgebung. Wir beschreiben ein System, das sowohl für die Weitfeld- als auch für die konfokale Mikroskopie eingesetzt werden kann. Es ist für die Abbildung von Extrakten in einem 2-dimensionalen (2D) Feld konzipiert, kann aber leicht auf die Bildgebung in 3D erweitert werden. Es eignet sich gut zur Untersuchung der räumlichen Musterbildung im Zytoplasma. Mit repräsentativen Daten zeigen wir die typische dynamische Organisation von Mikrotubuli, Zellkernen und Mitochondrien in Interphasenextrakten, die mit dieser Methode hergestellt werden. Diese Bilddaten können quantitative Informationen über zytoplasmatische Dynamik und räumliche Organisation liefern.
Introduction
Das Zytoplasma bildet das Hauptvolumen einer Zelle und hat eine ausgeprägte Organisation. Die Inhaltsstoffe des eukaryotischen Zytoplasmas können sich zu einer Vielzahl von räumlichen Strukturen wie Mikrotubuli-Astern und dem Golgi-Apparat zusammensetzen, die wiederum je nach Identität und physiologischem Zustand der Zelle dynamisch angeordnet und umgedreht werden. Das Verständnis der räumlichen Organisation des Zytoplasmas und seiner Verbindung zu zellulären Funktionen ist daher wichtig, um zu verstehen, wie die Zelle funktioniert. Xenopus laevis Ei-Extrakte wurden traditionell für biochemische Massentests 1,2,3,4,5,6,7,8 verwendet, aber neuere Arbeiten etablieren sie als leistungsfähiges Live-Bildgebungssystem für mechanistische Untersuchungen zytoplasmatischer Strukturen und ihrer zellulären Funktionen 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Diese unverdünnten Extrakte bewahren viele Strukturen und Funktionen des Zytoplasmas, während sie eine direkte Manipulation des zytoplasmatischen Inhalts ermöglichen, die in herkömmlichen zellbasierten Modellen nicht möglich sind19,20. Dies macht sie ideal für die Charakterisierung zytoplasmatischer Phänomene und die Analyse ihrer mechanistischen Grundlagen.
Bestehende Methoden zur Bildgebung von Extrakten erfordern chemische Oberflächenmodifikationen oder die Herstellung von mikrofluidischen Geräten. Ein Deckglas-basiertes Verfahren erfordert die Polyethylenglykol (PEG)-Passivierung von Glasdeckgläsern21. Ein mikroemulsionsbasiertes Verfahren erfordert die Gasphasenabscheidung von Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan auf Glasoberflächen22,23. Mikrofluidische Systeme ermöglichen eine präzise Kontrolle des Volumens, der Geometrie und der Zusammensetzung von Extrakttröpfchen, erfordern jedoch spezielle Mikrofabrikationsanlagen11,12,24.
Hier stellen wir eine alternative Methode zur Abbildung von Eiextrakten vor, die einfach zu implementieren ist und leicht verfügbare, kostengünstige Materialien verwendet. Dazu gehört die Vorbereitung einer Bildkammer mit einem Objektträger und einem Deckglas, das mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP)-Band beschichtet ist. Die Kammer kann für die Bildgebung von Extrakten mit einer Vielzahl von Mikroskopiesystemen verwendet werden, einschließlich Stereoskopen und aufrechten und inversen Mikroskopen. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Behandlung von Oberflächen und erreicht gleichzeitig eine ähnliche optische Klarheit, die mit den oben beschriebenen glasbasierten Methoden erzielt wird. Es wurde entwickelt, um eine Schicht von Extrakten mit einer gleichmäßigen Dicke über ein 2D-Feld abzubilden, und kann leicht erweitert werden, um ein 3D-Volumen von Extrakten abzubilden. Es eignet sich gut für die Zeitrafferbildgebung des kollektiven zytoplasmatischen Verhaltens über ein großes Sichtfeld.
Wir haben Interphase-Arrest-Ei-Extrakte verwendet, um unsere bildgebende Methode zu demonstrieren. Die Extraktzubereitung folgt dem Protokoll von Deming und Kornbluth19. Kurz gesagt, Eier, die natürlich in der Metaphase der Meiose II blockiert werden, werden durch einen Spin mit niedriger Geschwindigkeit zerkleinert. Dieser Spin befreit das Zytoplasma aus dem meiotischen Stillstand und ermöglicht es dem Extrakt, in die Interphase überzugehen. Normalerweise wird Cytochalasin B vor dem zerkleinernden Spin hinzugefügt, um die Bildung von F-Aktinen zu hemmen. Es kann jedoch weggelassen werden, wenn F-Aktin gewünscht wird. Cycloheximid wird auch vor dem Zerkleinerungsspin hinzugefügt, um zu verhindern, dass der Interphasenextrakt in die nächste Mitose gelangt. Die Extrakte werden anschließend in die vorgenannten Bildgebungskammern gegeben und auf ein Mikroskop gelegt. Schließlich werden Bilder über die Zeit in definierten Intervallen von einer an das Mikroskop angeschlossenen Kamera aufgenommen, wodurch Zeitraffer-Bildserien entstehen, die das dynamische Verhalten des Extrakts in einem 2D-Feld erfassen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.
1. Vorbereitung von Dias und Deckgläsern
- Tragen Sie eine Schicht fluoriertes Ethylenpropylen (FEP)-Klebeband mit einem Rollenapplikator auf einen Objektträger auf. Schneiden Sie überschüssiges Klebeband über die Kanten mit einer sauberen Rasierklinge ab. Bereiten Sie FEP-bandbeschichtete Deckgläser auf die gleiche Weise vor (Abbildung 1A).
- Tragen Sie einen doppelseitigen, klebrigen Abstandshalter auf die mit FEP-Klebeband beschichtete Seite des Objektträgers auf. Lassen Sie die Schutzfolie auf der Oberseite ungeschält (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Objektträger und Deckgläser sollten vor dem Versuch vorbereitet werden. Sie können sofort verwendet oder in Kartons gelagert werden, um Staubansammlungen auf Oberflächen zu verhindern. Die Vertiefung im Abbildungsabstandhalter ist 120 μm tief und hat einen Durchmesser von 9 mm.
2. Herstellung und Live-Bildgebung von Interphase-Arrest-Ei-Extrakten
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Deming und Kornbluth19, Murray20 und Smythe und Newport25 mit Modifikationen übernommen. Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
- Drei bis zehn Tage vor der Eizellentnahme reife weibliche Xenopus laevis Frösche subkutan in den dorsalen Lymphsack mit 100 IE trächtigem Stutenserumgonadotropin (PMSG) injizieren.
- Sechzehn bis achtzehn Stunden vor der geplanten Eizellentnahme injizieren Sie den Fröschen aus Schritt 2.1 500 IE humanes Choriongonadotropin (hCG). Frösche bei 18 °C im Eiablagepuffer (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mMMgSO4·7H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA) belassen, als 20x Stammlösung bei pH 7,4 vorbereiten und vor Gebrauch mit sauberem Froschtankwasser auf 1x verdünnen) bis zur Eientnahme verdünnen.
- Sammeln Sie am Tag des Experiments Eier in einer großen Glas-Petrischale und beurteilen Sie die Eiqualität. Verwerfen Sie alle Eier, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen oder in einer Schnur erscheinen (Abbildung 1B). Untersuchen Sie die Eier unter einem Stereoskop, behalten Sie die Eier mit normalem Aussehen (Abbildung 1C) und verwerfen Sie die Eier mit unregelmäßigem oder gesprenkeltem Pigment (Abbildung 1D).
HINWEIS: Dieses Protokoll funktioniert mit Eiern, die von einem einzelnen Frosch gesammelt wurden, der typischerweise 25 ml Eier bis 16 Stunden nach der hCG-Injektion legt. In der Regel werden insgesamt 3 bis 6 Frösche durch hCG induziert, und für das Extraktpräparationsexperiment wird der Frosch mit der höchsten Eiqualität ausgewählt. - Die Eier in ein 400-ml-Glasbecherglas geben und durch Dekantieren so viel Eiablagepuffer wie möglich entfernen.
- Die Eier in 100 ml frisch zubereiteter Dejelly-Lösung (2% w/v L-Cystein in Wasser, pH 8,0 mit NaOH) bebrüten und regelmäßig vorsichtig schwenken. Nach etwa 3 Minuten gießen Sie die Lösung ab und fügen Sie 100 ml frische Dejelly-Lösung hinzu. Setzen Sie die Inkubation fort, bis die Eier dicht gepackt sind (kein Abstand zwischen den Eiern), aber vermeiden Sie es, Eier länger als insgesamt 5 Minuten in der Dejelly-Lösung zu lassen.
- Durch Dekantieren wird so viel wie möglich von der Dejelierlösung entfernt und die Eier in 0,25x MMR-Puffer (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, als 10x Stammlösung hergestellt, mit NaOH auf pH 7,8 eingestellt und vor Gebrauch in Milli-Q-Wasser verdünnt) gewaschen. Die Eier schwenken und dann den Puffer abgießen. Wiederholen Sie dies einige Male, bis insgesamt 1 L des Puffers für die Wäschen verwendet wird.
- Waschen Sie die Eier einige Male mit insgesamt 400 ml Eilysepuffer (250 mM Saccharose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, frisch gemacht und mit KOH auf pH 7,7 eingestellt). Entfernen Sie Eier mit ungewöhnlichem Aussehen mit einer Pasteur-Pipette zwischen den Wäschen.
HINWEIS: Eier mit abnormalem Aussehen beziehen sich auf solche, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen (Abbildung 1B), eine gesprenkelte Pigmentierung aufweisen (Abbildung 1D), sich mit einer wachsenden weißen Region verschlechtern (Abbildung 1E) oder einen dunklen und kontrahierten pigmentierten Bereich in der tierischen Hemisphäre aufweisen (Abbildung 1F). - Mit einer Transferpipette mit weit geöffneter Spitze werden die Eier in ein 17-ml-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden überführt, das 1 ml Eilysepuffer enthält. Drehen Sie das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 400 x g für 15 Sekunden, um die Eier zu verpacken.
- Entfernen Sie so viel Eierlysepuffer wie möglich mit einer Pasteur-Pipette von der Oberseite der verpackten Eier.
HINWEIS: Es ist wichtig, so viel Puffer wie möglich aus den verpackten Eiern zu entfernen, um die Verdünnung des Eiextrakts zu minimieren. Manchmal ist es notwendig, einige lose Eier zusammen mit dem Restpuffer zu entfernen, um dies zu erreichen. - Bestimmen Sie das ungefähre Volumen der verpackten Eier und fügen Sie dann 5 μg / ml Aprotinin, 5 μg / ml Leupeptin, 5 μg / ml Cytochalasin B und 50 μg / ml Cycloheximid direkt auf die verpackten Eier hinzu.
HINWEIS: Aprotinin und Leupeptin sind Proteaseinhibitoren. Cytochalasin B hemmt die Aktinpolymerisation und verhindert, dass sich der Extrakt zusammenzieht und geliert26. Cycloheximid hemmt die Proteinsynthese und hält so den Extrakt in der Zwischenphase des Zellzyklus. - Zerkleinern Sie die Eier, indem Sie das Röhrchen bei 12.000 x g, 4 °C, 15 Minuten lang in einem schwingenden Eimerrotor zentrifugieren.
HINWEIS: Am Ende der Zentrifugation sollten die Eier gerissen und das Lysat in drei Hauptschichten getrennt sein: eine gelbe Lipidschicht oben, der zytoplasmatische Extrakt (auch Rohextrakt genannt) in der Mitte und eine dunkle dichte Schicht mit den Pigmentkörnern unten (Abbildung 1G). - Befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel an einer Spritze. Mit der Abschrägung der Nadelspitze nach oben punktieren Sie das Röhrchen von der Seite am Boden der zytoplasmatischen Schicht und gewinnen Sie den Extrakt durch langsames Ziehen.
HINWEIS: Ziehen Sie den zytoplasmatischen Extrakt langsam, um die Aufnahme von kontaminierendem Inhalt aus der gelben Lipidschicht zu vermeiden. - Den gewonnenen zytoplasmatischen Extrakt in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und auf Eis halten. Verwenden Sie den Extrakt innerhalb von 1 Stunde.
- Wenn Sie bereit sind, den Extrakt mit den gewünschten Reagenzien und Fluoreszenz-Bildgebungssonden zu ergänzen.
HINWEIS: Fluoreszenzbildgebungssonden markieren spezifische zytoplasmatische Strukturen, so dass sie mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können. - Entfernen Sie die obere Schutzfolie aus dem Bildabstandshalter auf dem in Schritt 1.2 vorbereiteten Objektträger, und legen Sie etwa 7 μl Extrakt in der Mitte der Vertiefung ab. Tragen Sie das mit FEP-Klebeband beschichtete Deckglas sofort mit der FEP-Seite zum Extrakt auf, um das Bohrloch zu versiegeln. Fahren Sie schnell mit der Bildgebung fort (Abbildung 1H, I).
- Stellen Sie den Objektträger auf ein inverses oder aufrechtes Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und einer Digitalkamera. Bilden Sie die Extrakte an gewünschten räumlichen Positionen und Zeitintervallen sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzkanal ab.
HINWEIS: In der Regel wird ein 5x-Objektiv für die Bildgebung verwendet. Der motorisierte Tisch ermöglicht eine automatisierte Bildaufnahme an mehreren definierten räumlichen Positionen. Die Hellfeldmikroskopie visualisiert zytoplasmatische Strukturen mit unterschiedlichen Transparenzgraden. Die Fluoreszenzmikroskopie visualisiert die zytoplasmatischen Strukturen, die von den in Schritt 2.14 hinzugefügten Fluoreszenzbildgebungssonden spezifisch markiert wurden. Die Kamera nimmt Zeitrafferbilder dieser Strukturen auf und erfasst so die Dynamik der zytoplasmatischen Organisation.
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Representative Results
Xenopus laevis Ei-Extrakte können verwendet werden, um die Selbstorganisation des Zytoplasmas während der Interphase zu untersuchen. Abbildung 2A zeigt die Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments. Wir ergänzten Interphase-Arrest-Extrakte mit demembranierten Xenopus laevis Spermienkernen19 in einer Konzentration von 27 Kernen/μL und 0,38 μM gereinigtem GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (Fusionsprotein bestehend aus Glutathion-S-Transferase, grün fluoreszierendem Protein und einer Kernlokalisierungssequenz), um die Rekonstitution und Visualisierung von Interphasenkernen zu ermöglichen. Wir fügten auch 1 μM fluoreszierend markiertes Tubulin hinzu, um Mikrotubuli zu visualisieren, und 500 nM MitoTracker Red CMXRos zur Visualisierung von Mitochondrien. Kurz nachdem der Extrakt in die Bildgebungskammer gegeben wurde, erschien das Zytoplasma unorganisiert. Im Laufe der nächsten 30 Minuten bei Raumtemperatur begann sich das Zytoplasma in zellähnliche Kompartimente zu organisieren. Mikrotubuli-Astern wuchsen aus Zentrosomen, die mit den Spermienkernen eingeführt wurden, und bildeten Mikrotubuli-erschöpfte Grenzzonen, wenn sie auf Mikrotubuli von benachbarten Astern trafen. GST-GFP-NLS-Protein transloziert in die runden Interphasenkerne, die sich aus den hinzugefügten demembranierten Spermienkernen selbst organisieren. Bereiche ohne lichtstreuende zytoplasmatische Komponenten waren sowohl in Hellfeld- als auch in Mitochondrienkanälen sichtbar (Abbildung 2A, 20 min und 35 min). Mitochondrien wurden auch von den von Mikrotubuli gebildeten Grenzen erschöpft und in isolierten Kompartimenten angereichert, die mit Mikrotubulikompartimenten ausgerichtet waren. Nach 60 min bei Raumtemperatur sollte ein räumliches Muster aus zellartigen Kompartimenten gut etabliert sein, wobei Mikrotubuli eine hohle kranzartige Struktur bilden und Mitochondrien klar in jedes Kompartiment unterteilt sind (Abbildung 2A, 53 min).
Abbildung 2B vergleicht die Extraktleistung in Bildgebungskammern mit und ohne FEP-Bänder auf Glas. Wir ergänzten Interphase-Arrest-Extrakte mit demembranierten Xenopus laevis Spermienkernen19 in einer Konzentration von 27 Kernen/μL und 0,35 μM GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (Fusionsprotein bestehend aus Glutathion-S-Transferase, mCherry fluoreszierendem Protein und einer Kernlokalisationssequenz), um die Rekonstitution und Visualisierung von Interphasenkernen zu ermöglichen. Wir fügten auch 1 μM fluoreszierend markiertes Tubulin hinzu, um Mikrotubuli sichtbar zu machen. Dynamische Unterschiede wurden bei Raumtemperatur um ca. 20 min deutlich. In der Kammer aus FEP-geklebtem Glas organisiert sich der Extrakt selbst in normale zellartige Muster (Abbildung 2B, Bilder in Reihe 1 und 3). In der Kammer, in der Glasoberflächen nicht vom FEP-Band bedeckt waren (unpassiviert), zeigte der Extrakt jedoch abnormale Hellfeld- und Mikrotubulimuster, die im Laufe der Zeit zunehmend gestört wurden (Abbildung 2B, Bilder in den Zeilen 2 und 4). Es wurden keine signifikanten Unterschiede beim Kernimport des GST-mCherry-NLS-Proteins beobachtet (Abbildung 2B, Bilder in den Zeilen 5 und 6).
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Fotos zum experimentellen Verfahren. (A) Schematische Darstellung zur Herstellung von FEP-bandbeschichteten Glasdeckgläsern und Objektträgern. (B) Xenopus laevis-Eier, die im Eiablagepuffer abgelegt wurden, mit Beispielen für Eier schlechter Qualität, die durch Pfeile gekennzeichnet sind. Gelbe Pfeile, Beispiele für Eier, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen. Rote Pfeile, Beispiele für Eier, die in einer Zeichenfolge erscheinen. (C) Beispiele für Xenopus laevis Eier mit normalem Aussehen. (D) Beispiele für Eier schlechter Qualität mit unregelmäßigem oder gesprenkeltem Pigment. (E) Ein sich verschlechterndes Ei mit einer wachsenden weißen Region. (F) Ein Ei, das einen dunklen und kontrahierten pigmentierten Bereich aufweist, möglicherweise aufgrund einer parthenogenetischen Aktivierung. (G) Die Schichten, die durch gerissene Xenopus laevis-Eier nach der 12.000 x g Zentrifugation in Schritt 2.11 gebildet wurden. (H) Schematische Darstellung der Vorbereitung der Bildgebungskammer für Extrakte in Schritt 2.15. (I) Ein Foto einer vorbereiteten Bildgebungskammer mit einem Eiextrakt im Inneren. (C) und (D) verwenden denselben Maßstabsbalken am unteren Rand von (D). (E) und (F) verwenden denselben Maßstabsbalken am unteren Rand von (F). Die Maßstabsbalken in (B) (C) (D) (E) (F) und (I) sind ungefähre Angaben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Interphase-gestoppte Ei-Extrakte organisieren sich selbst in zellartige Kompartimente. (A)Zeitraffermontage der selbstorganisierten Musterbildung in einer dünnen Schicht (120 μm) aus Interphase-gestopptem Xenopus laevis-Ei-Extrakt. Der Extrakt wurde mit 27 Kernen/μL demembranierter Xenopus laevis Spermienkerne ergänzt, um eine Rekonstitution der Interphasenkerne zu ermöglichen. Mikrotubuli wurden durch HiLyte 647-markiertes Tubulin (in Magenta), Mitochondrien durch MitoTracker Red CMXRos (rot dargestellt) und Kerne durch GST-GFP-NLS (grün dargestellt) visualisiert. (B) Selbstorganisierte Musterbildung in Interphase-gestoppten Xenopus laevis-Ei-Extrakten, die in Kammern mit und ohne FEP-Band-bedeckte Glasoberflächen platziert werden. Die Extrakte wurden mit 27 Kernen/μL membranierter Xenopus laevis Spermienkerne ergänzt, um eine Rekonstitution der Interphasenkerne zu ermöglichen. Mikrotubuli wurden durch HiLyte 488-markiertes Tubulin (in Magenta) und Kerne durch GST-mCherry-NLS (grün dargestellt) visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Optionale Sekundärdichtung für die Bildgebungskammer. Schematische Darstellung der Herstellung einer optionalen Sekundärdichtung mit Mineralöl, um einen längeren Kontakt des Extrakts mit Luft zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Xenopus laevis Ei-Extrakte haben sich als leistungsfähiges Modellsystem für bildgebende Untersuchungen verschiedener subzellulärer Strukturen 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 und zytoplasmatische Organisation insgesamt herausgestellt Zellskala9. Hier haben wir ein Live-Bildgebungsverfahren beschrieben, das geeignet ist, die dynamische zytoplasmatische Organisation in 2D zu visualisieren. Die Wirksamkeit der Methode wird durch repräsentative Ergebnisse belegt.
Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Methode. Die Eiqualität ist wichtig für Extrakte, daher sind die Schritte 2.3 und 2.7 kritisch. Nach unserer Erfahrung weist die tierische Hemisphäre hochwertiger Eier eine gleichmäßige Pigmentierung, einen deutlichen weißen Punkt in der Mitte (Hinweis auf den Abbau von Keimvesikeln, GVBD) und eine klare Grenze zur pflanzlichen Hemisphäre auf (Abbildung 1C). Die Extrakte aus hochwertigen Eiern haben unter unseren bildgebenden Bedingungen eine bessere Leistung. Wenn mehr als 5 % der Eier gesprenkeltes Pigment aufweisen (Abbildung 1D), einen dunklen und kontrahierten pigmentierten Bereich aufweisen (Abbildung 1F), wie weiße geschwollene Kugeln aussehen (Abbildung 1B), in einer Schnur erscheinen (Abbildung 1B) oder nach dem Waschen in den Schritten 2.6 und 2.7 Anzeichen einer Verschlechterung aufweisen (Abbildung 1E), sollte die gesamte Partie Eier verworfen werden. Die Extrakte behalten eine bemerkenswerte biologische Aktivität, da sie im Wesentlichen unverdünntes Zytoplasma sind. Daher ist der Schritt, der darauf abzielt, die Verdünnung des Extrakts zu minimieren (Schritt 2.9), wichtig für den Erfolg des Experiments. Für die Bildgebung werden Extrakte in sehr kleinen Volumina gehandhabt und verdampfen bei längerem Kontakt mit Luft schnell. Dies wirkt sich negativ auf ihre Aktivität aus. Daher muss der Extrakt in Schritt 2.15 nach der Abscheidung so schnell wie möglich mit der mit FEP-Klebeband beschichteten Seite des Deckglases versiegelt werden. Die Versiegelung kann visuell durch die Texturänderung an der Kontaktstelle zwischen dem Klebstoff auf dem Abstandhalter und dem Deckglas bestätigt werden. Der Abstandhalter sollte in der Lage sein, bei richtiger Anwendung eine vollständige Abdichtung zu erzeugen. Wird jedoch eine zusätzliche Versiegelung gewünscht, kann zwischen dem Überhang des Deckglases und dem Glasobjektträger auf Mineralöl verzichtet werden. Das Öl kann durch Kapillarwirkung eine zusätzliche Abdichtung um den Abstandhalter bilden (Abbildung 3). Die Passivierung von Glasoberflächen kann die unspezifische Adsorption von Molekülen reduzieren und ist wichtig für Interphase-Mikrotubuli-Astern in Extrakten21,37. Die hier beschriebene Anwendung von FEP-Tape über einer Glasoberfläche scheint ähnliche Vorteile zu bieten, wie die Montage normaler Interphasen-Mikrotubuli-Astern nahelegt (Abbildung 2, 6 min). Daher ist auch Schritt 1.1 kritisch.
Wir demonstrierten die Anwendung eines bildgebenden Verfahrens mit Interphase-gestoppten Eizellenextrakten nach dem Protokoll von Deming und Kornbluth19. Standardmäßig ergänzt das Protokoll die Extrakte mit dem Aktinpolymerisationshemmer Cytochalasin B, um eine Gelationskontraktion in den Extrakten nach längerer Inkubation bei Raumtemperaturzu verhindern 26. Um die Aktinpolymerisation zu ermöglichen und die Aktindynamik zu beobachten, kann man das Cytochalasin B in Schritt 2.10 des Protokolls9 weglassen. Eine Modifikation, die wir am Deming- und Kornbluth-Protokoll vorgenommen haben, besteht darin, dass wir Extrakte nicht mit einem Energiemix ergänzen, um ATP19 zu regenerieren. Denn in unseren Händen bilden Mikrotubuli in Extrakten, die mit dieser ATP-regenerierenden Mischung19 und Spermienkernen ergänzt werden, gelegentlich ein vernetztes Gitter, das die zytoplasmatische Musterbildung stört. Daher enthält das Protokoll nicht den Schritt, der den Extrakten19 den Energiemix hinzufügt.
Das Interphase-Extraktprotokoll beruht auf der Zerkleinerung von Eiern in EGTA-freiem Puffer, um sie aus dem meiotischen Arrest (CSF-Arrest) zu befreien37. Die Extrakte gehen anschließend in die Interphase über und werden durch Cycloheximid in der Interphase gehalten. Es gibt andere etablierte Methoden zur Herstellung von Interphase-Extrakten. Einige Methoden bereiten zuerst Extrakte vor, die den meiotischen Stillstand aufrechterhalten, indem sie Eier im Lysepuffer mit EGTA38 zerkleinern, und dann den Arrest durch Zugabe von Kalzium freigeben, wodurch der Extrakt in die Interphase 21,37,39 getrieben wird. Die Extrakte können anschließend durch Zugabe von Proteinsyntheseinhibitoren wie Cycloheximid37,39 in Interphase gehalten werden. Andere Methoden aktivieren Eier parthenogenetisch mit Kalziumionophor (A23187) oder Elektroschock, um sie aus dem meiotischen Stillstand zu befreien, bevor die Eier in Abwesenheit von EGTA20,28 zerkleinert werden (überprüft in Field et al.37). Diese Extrakte können in die Interphase eintreten, bleiben aber normalerweise nicht dort, da sie mehrere Zellzyklen durchlaufen können. Ebenso wurden etablierte Methoden entwickelt, die für die Herstellung von Extrakten mit intaktem Aktinzytoskelett optimiert sind 10,37,39. Das bildgebende Verfahren kann für diese Art von Extrakten geeignet sein, aber wir haben es nicht mit ihnen getestet.
Um die innere Organisation des Zytoplasmas abzubilden, sind die hier vorgestellten Bildgebungssysteme relativ einfach einzurichten, so dass nur ein FEP-Band auf Glasoberflächen aufgebracht werden muss. Es ermöglicht den Aufbau von Zytoskelettstrukturen in Extrakten9, die in anspruchsvolleren Bildgebungssystemen berichtet werden, bei denen Glasoberflächen mit Poly-L-Lysin-g-Polyethylenglykol (PLL-g-PEG) -Behandlung passiviert oder mit unterstützten Lipiddoppelschichten beschichtet werden10,21. Das Verfahren ermöglicht die Bildung der Extraktschicht mit einer definierten Dicke (bestimmt durch die Tiefe des Abstandhalters, die für das in Abbildung 1A, 1H, 1I und Abbildung 2 gezeigte System 120 μm beträgt). Wir können die Dicke einstellen, indem wir zusätzliche Abstandshalter stapeln. Wir haben bis zu 6 solcher Abstandhalter (720 μm dick) gestapelt und die Kompartimente normal gebildet. Diese Flexibilität ermöglicht zukünftige Anwendungen wie die Abbildung der Extrakte in 3D mittels Konfokal- oder Lichtblattmikroskopie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken J. Kamenz, Y. Chen und W. Y. C. Huang für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 und R35 GM131792) unterstützt, die James E. Ferrell, Jr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
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