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Biology

Xenopus laevis गतिशील साइटोप्लाज्मिक संगठन की कल्पना के लिए अंडे निकालने की तैयारी और लाइव इमेजिंग विधियां

Published: June 6, 2021 doi: 10.3791/61923
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

Summary

हम जेनोपस लेविस अंडे से अनडिल्यूटेड साइटोप्लाज्मिक अर्क की तैयारी और लाइव इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

परंपरागत रूप से थोक जैव रासायनिक परख के लिए उपयोग किया जाता है, जेनोपस लेविस अंडे के अर्क साइटोप्लाज्मिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली इमेजिंग-आधारित उपकरण के रूप में उभरे हैं, जैसे कि साइटोकिनेसिस, माइटोटिक स्पिंडल गठन और नाभिक की असेंबली। विरल समय बिंदुओं पर नमूना लिए गए निश्चित अर्क को चित्रित करने वाले शुरुआती तरीकों के आधार पर, हाल के दृष्टिकोण टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव अर्क की छवि बनाते हैं, जो उन्नत अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ अधिक गतिशील विशेषताओं का खुलासा करते हैं। इन विधियों को आमतौर पर इमेजिंग पोत के परिष्कृत सतह उपचार की आवश्यकता होती है। यहां हम अंडे के अर्क की लाइव इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक विधि पेश करते हैं जिसके लिए कोई रासायनिक सतह उपचार की आवश्यकता नहीं होती है। इमेजिंग के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादित प्रयोगशाला उपभोग्य सामग्रियों को लागू करना और उपयोग करना आसान है। हम एक ऐसी प्रणाली का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग वाइड-फील्ड और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए किया जा सकता है। यह 2-आयामी (2 डी) क्षेत्र में इमेजिंग अर्क के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन आसानी से 3 डी में इमेजिंग तक बढ़ाया जा सकता है। यह साइटोप्लाज्म के भीतर स्थानिक पैटर्न गठन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। प्रतिनिधि डेटा के साथ, हम इस विधि का उपयोग करके तैयार किए गए इंटरफेज अर्क में सूक्ष्मनलिकाएं, नाभिक और माइटोकॉन्ड्रिया के विशिष्ट गतिशील संगठन का प्रदर्शन करते हैं। ये छवि डेटा साइटोप्लाज्मिक गतिशीलता और स्थानिक संगठन पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

साइटोप्लाज्म एक कोशिका की मुख्य मात्रा का गठन करता है और इसका एक अलग संगठन होता है। यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्म के तत्व स्थानिक संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में स्वयं इकट्ठा हो सकते हैं, जैसे कि सूक्ष्मनलिकाएं एस्टर और गोल्गी तंत्र, जो बदले में कोशिका की पहचान और शारीरिक स्थिति के आधार पर गतिशील रूप से व्यवस्थित और बदल जाते हैं। साइटोप्लाज्म के स्थानिक संगठन और सेलुलर कार्यों के लिए इसके लिंक को समझना इस प्रकार यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि सेल कैसे काम करता है। जेनोपस लेविस अंडे के अर्क का उपयोग पारंपरिक रूप से थोक जैव रासायनिक परख 1,2,3,4,5,6,7,8 के लिए किया गया है, लेकिन हाल के काम ने उन्हें साइटोप्लाज्मिक संरचनाओं और उनके सेलुलर कार्यों के यांत्रिक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली लाइव इमेजिंग सिस्टम के रूप में स्थापित किया है। 12,13,14,15,16,17,18. ये अनडिल्यूटेड अर्क साइटोप्लाज्म की कई संरचनाओं और कार्यों को संरक्षित करते हैं, जबकि साइटोप्लाज्मिक सामग्री के प्रत्यक्ष जोड़तोड़ की अनुमति देते हैं जो पारंपरिक सेल-आधारित मॉडल19,20 में प्राप्त करने योग्य नहीं हैं। यह उन्हें साइटोप्लाज्मिक घटनाओं को चिह्नित करने और उनके यांत्रिक आधार को विच्छेदित करने के लिए आदर्श बनाता है।

इमेजिंग अर्क के लिए मौजूदा तरीकों को रासायनिक सतह संशोधनों, या माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण की आवश्यकता होती है। एक कवरस्लिप-आधारित विधि के लिए ग्लास कवरलिप्स 21 के पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी) निष्क्रिय करने की आवश्यकता होती है। एक माइक्रोइमल्शन-आधारित विधि के लिए कांच की सतहों पर ट्राइक्लोरो (1एच, 1एच, 2एच, 2एच-परफ्लोरोक्टिल) सिलेन के वाष्प जमावकी आवश्यकता होती है। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित सिस्टम अर्क बूंदों की मात्रा, ज्यामिति और संरचना के सटीक नियंत्रण की अनुमति देते हैं, लेकिन विशेष माइक्रोफैब्रिकेशन सुविधाओं 11,12,24 की आवश्यकता होती है।

यहां हम इमेजिंग अंडे के अर्क के लिए एक वैकल्पिक विधि पेश करते हैं जो लागू करना आसान है और आसानी से उपलब्ध, कम लागत वाली सामग्री का उपयोग करता है। इसमें एक स्लाइड के साथ एक इमेजिंग कक्ष की तैयारी और फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) टेप के साथ लेपित एक कवरस्लिप शामिल है। कक्ष का उपयोग विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोपी सिस्टम के साथ इमेजिंग अर्क के लिए किया जा सकता है, जिसमें स्टीरियोस्कोप और सीधे और उल्टे माइक्रोस्कोप शामिल हैं। ऊपर चर्चा की गई मौजूदा ग्लास-आधारित विधियों के साथ प्राप्त समान ऑप्टिकल स्पष्टता प्राप्त करते समय इस विधि को सतहों के किसी भी रासायनिक उपचार की आवश्यकता नहीं होती है। यह 2 डी क्षेत्र में एक समान मोटाई के साथ अर्क की एक परत को चित्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और अर्क की 3 डी मात्रा को चित्रित करने के लिए आसानी से बढ़ाया जा सकता है। यह दृश्य के एक बड़े क्षेत्र में सामूहिक साइटोप्लाज्मिक व्यवहार की टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

हमने अपनी इमेजिंग विधि का प्रदर्शन करने के लिए इंटरफेज-गिरफ्तार अंडे के अर्क का उपयोग किया है। अर्क तैयारी डेमिंग और कोर्नब्लुथ19 के प्रोटोकॉल का पालन करती है। संक्षेप में, अर्धसूत्रीविभाजन II के मेटाफ़ेज़ में स्वाभाविक रूप से गिरफ्तार अंडे कम गति स्पिन द्वारा कुचल दिए जाते हैं। यह स्पिन साइटोप्लाज्म को मियोटिक गिरफ्तारी से मुक्त करता है और अर्क को इंटरफेज़ में आगे बढ़ने की अनुमति देता है। आम तौर पर, एफ-एक्टिन गठन को रोकने के लिए क्रशिंग स्पिन से पहले साइटोचलासिन बी जोड़ा जाता है। हालांकि, यदि एफ-एक्टिन वांछित है तो इसे छोड़ा जा सकता है। इंटरफेज़ अर्क को अगले माइटोसिस में प्रवेश करने से रोकने के लिए क्रशिंग स्पिन से पहले साइक्लोहेक्सिमाइड भी जोड़ा जाता है। अर्क को बाद में उपरोक्त इमेजिंग कक्षों में रखा जाता है और माइक्रोस्कोप पर रखा जाता है। अंत में, माइक्रोस्कोप से जुड़े एक कैमरे द्वारा परिभाषित अंतराल पर छवियों को समय के साथ रिकॉर्ड किया जाता है, जिससे टाइम-लैप्स छवि श्रृंखला का उत्पादन होता है जो 2 डी क्षेत्र में अर्क के गतिशील व्यवहार को कैप्चर करता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. स्लाइड और कवरलिप्स की तैयारी

  1. फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) चिपकने वाला टेप की एक परत को रोलर एप्लिकेटर के साथ ग्लास स्लाइड पर लागू करें। एक साफ रेजर ब्लेड के साथ किनारों पर अत्यधिक टेप काट लें। उसी तरह से एफईपी टेप-लेपित कवरलिप तैयार करें (चित्रा 1 ए)।
  2. स्लाइड के एफईपी टेप-लेपित पक्ष पर एक डबल-साइडेड चिपचिपा इमेजिंग स्पेसर लागू करें। सुरक्षात्मक लाइनर को शीर्ष पर बिना छीले छोड़ दें (चित्रा 1 ए)।
    नोट: प्रयोग से पहले स्लाइड और कवरलिप तैयार किए जाने चाहिए। सतहों पर धूल संचय को रोकने के लिए उन्हें तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है, या बक्से में संग्रहीत किया जा सकता है। इमेजिंग स्पेसर में कुआं 120 μm गहरा है और इसका व्यास 9 मिमी है।

2. इंटरफेज़-गिरफ्तार अंडे के अर्क की तैयारी और लाइव इमेजिंग

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल को डेमिंग और कोर्नब्लुथ19, मरे20, और स्माइथ और न्यूपोर्ट25 से संशोधनों के साथ अनुकूलित किया गया है। सभी चरणों को कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा नोट न किया जाए।

  1. अंडे के संग्रह से तीन से दस दिन पहले, परिपक्व मादा जेनोपस लेविस मेंढकों को गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी) के 100 आईयू के साथ पृष्ठीय लिम्फ थैली में चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  2. नियोजित अंडे संग्रह से सोलह से अठारह घंटे पहले, चरण 2.1 से मेंढकों को मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) के 500 आईयू के साथ इंजेक्ट करें। अंडे देने वाले बफर (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4.7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2.2H 2O,0.5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 पर 20x स्टॉक समाधान के रूप में तैयार करें और उपयोग से पहले 1x तक साफ मेंढक टैंक के पानी से पतला करें) में मेंढकों को छोड़ दें।
  3. प्रयोग के दिन, एक बड़े ग्लास पेट्री डिश में अंडे इकट्ठा करें और अंडे की गुणवत्ता का आकलन करें। किसी भी अंडे को छोड़ दें जो सफेद फूली हुई गेंदों की तरह दिखते हैं या स्ट्रिंग में दिखाई देते हैं (चित्रा 1 बी)। स्टीरियोस्कोप के तहत अंडों की जांच करें, अंडे को सामान्य उपस्थिति (चित्रा 1 सी) के साथ रखें, और अनियमित या मोटे वर्णक वाले लोगों को छोड़ दें (चित्रा 1 डी)।
    नोट: यह प्रोटोकॉल एक मेंढक से एकत्र किए गए अंडों के साथ काम करता है, जो आमतौर पर एचसीजी इंजेक्शन के 16 घंटे बाद 25 एमएल अंडे देता है। आमतौर पर, कुल 3 से 6 मेंढक एचसीजी द्वारा प्रेरित होते हैं, और उच्चतम अंडे की गुणवत्ता वाले मेंढक को अर्क तैयारी प्रयोग के लिए चुना जाता है।
  4. अंडे को 400 एमएल ग्लास बीकर में स्थानांतरित करें, और डिकेंटिंग द्वारा जितना संभव हो उतना अंडे देने वाले बफर को हटा दें।
  5. अंडे को 100 एमएल ताजा तैयार डिजेलिंग घोल (पानी में 2% डब्ल्यू / वी एल-सिस्टीन, एनएओएच के साथ पीएच 8.0 में समायोजित करें) में इनक्यूबेट करें और धीरे से उन्हें समय-समय पर घुमाएं। लगभग 3 मिनट के बाद, घोल को डालें, और 100 एमएल ताजा डिजेलिंग समाधान जोड़ें। इनक्यूबेशन को तब तक जारी रखें जब तक कि अंडे कसकर पैक न हो जाएं (अंडे के बीच कोई जगह नहीं), लेकिन कुल 5 मिनट से अधिक समय तक डिजेलिंग घोल में अंडे छोड़ने से बचें।
  6. डिकैंटिंग द्वारा जितना संभव हो उतना डिजेलिंग घोल को हटा दें, और अंडे को 0.25x MMR बफर (25 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 0.025 mM EDTA, 1.25 mM HEPES, 10x स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया गया है, जिसे NaOH के साथ pH 7.8 में समायोजित किया गया है, और उपयोग से पहले मिल्ली-Q पानी में पतला किया गया है) में अंडे धोएं। अंडे घुमाएं, और फिर बफर को बाहर निकाल दें। कुछ बार दोहराएं जब तक कि वॉश के लिए बफर के कुल 1 एल का उपयोग न किया जाए।
  7. अंडे को कुल 400 एमएल अंडे लाइसिस बफर (250 एमएम सुक्रोज, 10 एमएम एचईपीईएस, 50 एमएम केसीएल, 2.5 एमएम एमजीसीएल 2, 1 एमएम डीटीटी, ताजा बनायागया और कोएच के साथ पीएच 7.7 में समायोजित किया गया) के साथ कुछ बार धोएं। वॉश के बीच पाश्चर पिपेट का उपयोग करके असामान्य उपस्थिति वाले अंडे निकालें।
    नोट: असामान्य उपस्थिति वाले अंडे उन लोगों को संदर्भित करते हैं जो सफेद पफी बॉल्स (चित्रा 1 बी) की तरह दिखते हैं, मोटे पिग्मेंटेशन (चित्रा 1 डी) होते हैं, बढ़ते सफेद क्षेत्र (चित्रा 1 ई) के साथ बिगड़ते हैं, या पशु गोलार्ध में काले और अनुबंधित वर्णक क्षेत्र दिखाते हैं (चित्रा 1 एफ)।
  8. एक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, जिसकी नोक चौड़ी हो, अंडे को 17 एमएल राउंड-बॉटम सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल अंडा लाइसिस बफर हो। अंडे पैक करने के लिए ट्यूब को 15 सेकंड के लिए 400 x g पर नैदानिक सेंट्रीफ्यूज में घुमाएं।
  9. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पैक किए गए अंडे के शीर्ष से जितना संभव हो उतना अंडा लाइसिस बफर निकालें।
    नोट: अंडे के अर्क के कमजोर पड़ने को कम करने के लिए पैक किए गए अंडे से जितना संभव हो उतना बफर निकालना महत्वपूर्ण है। कभी-कभी इसे पूरा करने के लिए अवशिष्ट बफर के साथ कुछ ढीले अंडे निकालना आवश्यक होता है।
  10. पैक किए गए अंडों की अनुमानित मात्रा निर्धारित करें, और फिर पैक किए गए अंडों के शीर्ष पर सीधे 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL ल्यूपेप्टिन, 5 μg / mL साइटोचालासिन बी, और 50 μg / mL साइक्लोहेक्सिमाइड जोड़ें।
    नोट: एप्रोटिनिन और ल्यूपेप्टिन प्रोटीज अवरोधक हैं। साइटोचलासिन बी एक्टिन पोलीमराइजेशन को रोकता है, अर्क को अनुबंध और गेलिंग26 से रोकता है। साइक्लोहेक्सिमाइड प्रोटीन संश्लेषण को रोकता है, जिससे अर्क को कोशिका चक्र के इंटरफेज में रखा जाता है।
  11. एक झूलते हुए बाल्टी रोटर में 15 मिनट के लिए ट्यूब को 12,000 x g, 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज करके अंडे को कुचल दें।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के अंत में, अंडे टूट गए होंगे और लाइसेट को तीन मुख्य परतों में विभाजित किया जाना चाहिए था: शीर्ष पर एक पीली लिपिड परत, बीच में साइटोप्लाज्मिक अर्क (जिसे कच्चा अर्क भी कहा जाता है), और एक गहरी घनी परत जिसमें नीचे वर्णक कणिकाएं होती हैं (चित्रा 1 जी)।
  12. एक सिरिंज से 18-गेज सुई संलग्न करें। सुई की नोक को ऊपर की ओर करके, साइटोप्लाज्मिक परत के निचले हिस्से में साइड से ट्यूब को पंचर करें, और धीरे-धीरे खींचकर अर्क को ठीक करें।
    नोट: पीले लिपिड परत से दूषित सामग्री को शामिल करने से बचने के लिए साइटोप्लाज्मिक अर्क को धीरे-धीरे खींचें।
  13. पुनर्प्राप्त साइटोप्लाज्मिक अर्क को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें। 1 घंटे के भीतर अर्क का उपयोग करें।
  14. छवि के लिए तैयार होने पर, वांछित अभिकर्मकों और प्रतिदीप्ति इमेजिंग जांच के साथ अर्क को पूरक करें।
    नोट: फ्लोरेसेंस इमेजिंग जांच विशिष्ट साइटोप्लाज्मिक संरचनाओं को लेबल करती है ताकि उन्हें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा देखा जा सके।
  15. चरण 1.2 में तैयार स्लाइड पर इमेजिंग स्पेसर से शीर्ष सुरक्षात्मक लाइनर को हटा दें, और कुएं के केंद्र में लगभग 7 μL अर्क जमा करें। तुरंत एफईपी टेप-लेपित कवरस्लिप को एफईपी साइड के साथ कुएं को सील करने के लिए अर्क के सामने लागू करें। जल्दी से इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें (चित्रा 1 एच, आई)।
  16. स्लाइड को मोटर चालित मंच और डिजिटल कैमरे के साथ उल्टे या सीधे माइक्रोस्कोप पर सेट करें। उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति चैनलदोनों में वांछित स्थानिक स्थितियों और समय अंतराल पर अर्क की छवि बनाएं।
    नोट: आमतौर पर, इमेजिंग के लिए एक 5x उद्देश्य का उपयोग किया जाता है। मोटरचालित चरण कई परिभाषित स्थानिक स्थितियों पर स्वचालित छवि अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी पारदर्शिता की विभिन्न डिग्री के साथ साइटोप्लाज्मिक संरचनाओं की कल्पना करती है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी चरण 2.14 में जोड़े गए फ्लोरेसेंस इमेजिंग जांच द्वारा विशेष रूप से लेबल की गई साइटोप्लाज्मिक संरचनाओं की कल्पना करती है। कैमरा इन संरचनाओं की टाइम-लैप्स छवियों को रिकॉर्ड करता है, जिससे साइटोप्लाज्मिक संगठन की गतिशीलता को कैप्चर किया जाता है।

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Representative Results

जेनोपस लेविस अंडे के अर्क का उपयोग इंटरफेज़ के दौरान साइटोप्लाज्म के स्व-संगठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 2 ए एक सफल प्रयोग से परिणाम दिखाता है। हमने इंटरफेज नाभिक के पुनर्गठन और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए 27 नाभिक/μL और 0.38 μM शुद्ध जीएसटी-जीएफपी-एनएलएस 27,28,29,30 (ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफेरेज़, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम से युक्त संलयन प्रोटीन) की एकाग्रता पर डिमेम्ब्रेनेटेड जेनोपस लेविस शुक्राणु नाभिक 19 के साथ इंटरफेज़-गिरफ्तार अर्क को पूरक किया। हमने सूक्ष्मनलिकाएं देखने के लिए 1 μM फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूबुलिन और माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना करने के लिए 500 nM MitoTracker Red CMXRos भी जोड़ा। अर्क को इमेजिंग कक्ष में रखे जाने के कुछ क्षण बाद, साइटोप्लाज्म अव्यवस्थित दिखाई दिया। कमरे के तापमान पर अगले 30 मिनट के दौरान, साइटोप्लाज्म ने सेल जैसे डिब्बों में आत्म-व्यवस्थित होना शुरू कर दिया। माइक्रोट्यूबुल्स एस्टर शुक्राणु नाभिक के साथ पेश किए गए सेंट्रोसोम से विकसित हुए, और पड़ोसी एस्टर्स से सूक्ष्मनलिकाएं मिलने पर सूक्ष्मनलिकाएं-क्षीण सीमा क्षेत्रों का निर्माण किया। जीएसटी-जीएफपी-एनएलएस प्रोटीन को गोल इंटरफेज नाभिक में स्थानांतरित किया जाता है जो अतिरिक्त डिमेम्ब्रेनेटेड शुक्राणु नाभिक से स्वयं इकट्ठा होता है। प्रकाश प्रकीर्णन साइटोप्लाज्मिक घटकों से कम क्षेत्र उज्ज्वल-क्षेत्र और माइटोकॉन्ड्रिया चैनलों (चित्रा 2 ए, 20 मिनट और 35 मिनट) दोनों में दिखाई दे रहे थे। माइटोकॉन्ड्रिया भी सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा स्थापित सीमाओं से समाप्त हो गए, और अलग-अलग डिब्बों में समृद्ध हो गए जो सूक्ष्मनलिका डिब्बों के साथ संरेखित हो गए। कमरे के तापमान पर 60 मिनट तक, सेल जैसे डिब्बों से युक्त एक स्थानिक पैटर्न अच्छी तरह से स्थापित किया जाना चाहिए, जिसमें सूक्ष्मनलिकाएं एक खोखली पुष्पांजलि जैसी संरचना बनाती हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया स्पष्ट रूप से प्रत्येक डिब्बे में विभाजित होते हैं (चित्रा 2 ए, 53 मिनट)।

चित्रा 2 बी ग्लास पर एफईपी टेप के साथ और बिना इमेजिंग कक्षों में अर्क प्रदर्शन की तुलना करता है। हमने इंटरफेज नाभिक के पुनर्गठन और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए 27 नाभिक/μL और 0.35 μM GST-mCherry-NLS 27,28,29,30 (ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफेरेज़, एमचेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन और परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम से युक्त संलयन प्रोटीन) की एकाग्रता पर डिमेम्ब्रेनेटेड जेनोपस लेविस शुक्राणु नाभिक 19 के साथ इंटरफेज-गिरफ्तार अर्क को पूरक किया। हमने सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करने के लिए 1 μM फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूबुलिन भी जोड़ा। कमरे के तापमान पर गतिशीलता में अंतर लगभग 20 मिनट तक स्पष्ट हो गया। एफईपी-टेप किए गए ग्लास के साथ बने कक्ष में, अर्क सामान्य सेल जैसे पैटर्न (चित्रा 2 बी, पंक्तियों 1 और 3 में छवियां) में स्व-व्यवस्थित होता है। हालांकि, कक्ष में जहां कांच की सतहों को एफईपी टेप (निष्क्रिय) द्वारा कवर नहीं किया गया था, अर्क ने असामान्य उज्ज्वल-क्षेत्र और सूक्ष्मनलिका पैटर्न दिखाए जो समय के साथ तेजी से बाधित हो गए (चित्रा 2 बी, पंक्तियों 2 और 4 में छवियां)। जीएसटी-एमचेरी-एनएलएस प्रोटीन के परमाणु आयात में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया (चित्रा 2 बी, पंक्ति 5 और 6 में चित्र)।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक प्रक्रिया से संबंधित योजनाबद्ध और तस्वीरें। (ए) एफईपी टेप-लेपित ग्लास कवरलिप और स्लाइड तैयार करने के लिए योजनाबद्ध आरेख। (बी) जेनोपस लेविस अंडे अंडे देने वाले बफर में जमा होते हैं, जिसमें तीर द्वारा इंगित खराब गुणवत्ता वाले अंडे के उदाहरण होते हैं। पीले तीर, अंडे के उदाहरण जो सफेद फूली हुई गेंदों की तरह दिखते हैं। लाल तीर, अंडे के उदाहरण जो एक स्ट्रिंग में दिखाई देते हैं। (सी) सामान्य उपस्थिति के साथ जेनोपस लेविस अंडे के उदाहरण। (डी) अनियमित या मोटे वर्णक के साथ खराब गुणवत्ता वाले अंडे के उदाहरण। (E) बढ़ते सफेद क्षेत्र के साथ एक बिगड़ता हुआ अंडा। (च) एक अंडा जो काले और संकुचित पिगमेंटेड क्षेत्र को दर्शाता है, संभवतः पार्थेनोजेनेटिक सक्रियण के कारण। (छ) चरण 2.11 में 12,000 x g सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद टूटे हुए जेनोपस लेविस अंडे द्वारा बनाई गई परतें। (एच) चरण 2.15 में एक्सट्रैक्ट इमेजिंग कक्ष तैयार करने के लिए योजनाबद्ध। (I) एक तैयार इमेजिंग कक्ष की एक तस्वीर जिसमें अंदर अंडे का अर्क होता है। (C) और (D) (D) के निचले भाग में एक ही स्केल पट्टी साझा करते हैं। (E) और (F) (F) के निचले भाग में एक ही स्केल पट्टी साझा करते हैं। (B) (C) (D) (E) (F) और (I) में स्केल पट्टियाँ अनुमानित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: इंटरफेज़-गिरफ्तार अंडे के अर्क सेल जैसे डिब्बों में स्वयं-व्यवस्थित होते हैं। (A) इंटरफेज़-अरेस्टेड जेनोपस लेविस अंडे के अर्क की एक पतली परत (120 μm) में स्व-संगठित पैटर्न गठन का टाइम-लैप्स मोंटाज। इंटरफेज नाभिक के पुनर्गठन की अनुमति देने के लिए अर्क को 27 नाभिक / 1 एल के साथ पूरक किया गया था। माइक्रोट्यूबुल्स को हायलाइट 647-लेबल ट्यूबुलिन (मैजेंटा में दिखाया गया), माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा माइटोट्रैकर रेड सीएमएक्सआरओएस (लाल रंग में दिखाया गया), और जीएसटी-जीएफपी-एनएलएस (हरे रंग में दिखाया गया) द्वारा नाभिक द्वारा देखा गया था। (बी) एफईपी-टेप से ढकी कांच की सतहों के साथ और बिना कक्षों में रखे गए इंटरफेज-अरेस्टेड जेनोपस लेविस अंडे के अर्क में स्व-संगठित पैटर्न गठन। इंटरफेज नाभिक के पुनर्गठन की अनुमति देने के लिए अर्क को 27 नाभिक / 1एल के साथ पूरक किया गया था। माइक्रोट्यूबुल्स को हायलाइट 488-लेबल ट्यूबुलिन (मैजेंटा में दिखाया गया) और जीएसटी-एमचेरी-एनएलएस (हरे रंग में दिखाया गया) द्वारा नाभिक द्वारा कल्पना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इमेजिंग कक्ष के लिए वैकल्पिक माध्यमिक सील। अर्क को हवा के साथ लंबे समय तक संपर्क से रोकने के लिए खनिज तेल के साथ एक वैकल्पिक माध्यमिक सील तैयार करने के लिए योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जेनोपस लेविस अंडे के अर्क विभिन्न उपकोशिकीय संरचनाओं 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 और साइटोप्लाज्मिक संगठन के इमेजिंग-आधारित अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में उभरे हैं सेल स्केल9. यहां हमने 2 डी में गतिशील साइटोप्लाज्मिक संगठन की कल्पना करने के लिए उपयुक्त एक लाइव इमेजिंग विधि का वर्णन किया है। विधि की प्रभावशीलता प्रतिनिधि परिणामों द्वारा प्रदर्शित की जाती है।

विधि की सफलता के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं। अर्क के लिए अंडे की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, इसलिए चरण 2.3 और 2.7 महत्वपूर्ण हैं। हमारे अनुभव में, उच्च गुणवत्ता वाले अंडों के पशु गोलार्ध में समान रंजकता होती है, केंद्र में एक अलग सफेद बिंदु (जर्मिनल पुटिका टूटने का संकेत, जीवीबीडी), और वनस्पति गोलार्ध के साथ एक स्पष्ट सीमा होती है (चित्रा 1 सी)। उच्च गुणवत्ता वाले अंडे से बने अर्क में हमारी इमेजिंग स्थितियों के तहत बेहतर प्रदर्शन होता है। यदि 5% से अधिक अंडों में मोटे पिगमेंट (चित्रा 1 डी) हैं, काला और अनुबंधित पिगमेंटेड क्षेत्र (चित्रा 1 एफ) है, सफेद पफी बॉल (चित्रा 1 बी) की तरह दिखता है, एक स्ट्रिंग (चित्रा 1 बी) में दिखाई देता है, या चरण 2.6 और 2.7 (चित्रा 1 ई) में धोने के बाद गिरावट के लक्षण दिखाता है, तो अंडे के पूरे बैच को त्याग दिया जाना चाहिए। अर्क उल्लेखनीय जैविक गतिविधि को बनाए रखते हैं क्योंकि वे अनिवार्य रूप से अपरिवर्तित साइटोप्लाज्म होते हैं। इसलिए, वह कदम जिसका उद्देश्य अर्क (चरण 2.9) के कमजोर पड़ने को कम करना है, प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। इमेजिंग के लिए, अर्क को बहुत कम मात्रा में संभाला जाता है, और हवा के साथ लंबे समय तक संपर्क में रहने पर जल्दी से वाष्पित हो जाएगा। यह उनकी गतिविधि को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा। इसलिए, चरण 2.15 में, अर्क जमा होने के बाद, इसे जल्द से जल्द कवरस्लिप के एफईपी टेप-लेपित पक्ष के साथ सील किया जाना चाहिए। स्पेसर और कवरस्लिप पर चिपकने वाले के बीच संपर्क स्थल पर बनावट परिवर्तन से सीलिंग की नेत्रहीन पुष्टि की जा सकती है। स्पेसर को ठीक से लागू होने पर एक पूर्ण सील बनाने में सक्षम होना चाहिए। हालांकि, यदि एक अतिरिक्त सील वांछित है, तो खनिज तेल को कवरस्लिप और ग्लास स्लाइड के ओवरहैंग के बीच वितरित किया जा सकता है। तेल केशिका क्रिया द्वारा स्पेसर के चारों ओर एक अतिरिक्त सील बना सकता है (चित्रा 3)। कांच की सतहों का निष्क्रिय होना अणुओं के गैर-विशिष्ट सोखना को कम कर सकता है, और यह अर्क21,37 में इंटरफेज माइक्रोट्यूबुल्स एस्टर के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित कांच की सतह पर एफईपी टेप का अनुप्रयोग समान लाभ प्रदान करता प्रतीत होता है, जैसा कि सामान्य इंटरफेज माइक्रोट्यूबुल्स एस्टर्स (चित्रा 2, 6 मिनट) की असेंबली द्वारा सुझाया गया है। इसलिए, चरण 1.1 भी महत्वपूर्ण है।

हमने डेमिंग और कोर्नब्लुथ19 के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए इंटरफेज-गिरफ्तार अंडे के अर्क का उपयोग करके एक इमेजिंग विधि के आवेदन का प्रदर्शन किया। डिफ़ॉल्ट रूप से, प्रोटोकॉल कमरे के तापमान26 पर विस्तारित इनक्यूबेशन के बाद अर्क में गेलेशन-संकुचन को रोकने के लिए एक्टिन पोलीमराइजेशन इनहिबिटर साइटोचलासिन बी के साथ अर्क को पूरक करता है। एक्टिन पोलीमराइजेशन की अनुमति देने और एक्टिन गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए, कोई प्रोटोकॉल9 के चरण 2.10 में साइटोचलासिन बी को छोड़ सकता है। डेमिंग और कोर्नब्लुथ प्रोटोकॉल में हमने एक संशोधन किया है कि हम एटीपी19 को पुनर्जीवित करने के लिए ऊर्जा मिश्रण के साथ अर्क को पूरक नहीं करते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि हमारे हाथों में, इस एटीपी-रिजेनरेटिंग मिक्स19 और शुक्राणु नाभिक के साथ पूरक अर्क में, सूक्ष्मनलिकाएं कभी-कभी एक क्रॉसलिंक जाली बनाती हैं जो साइटोप्लाज्मिक पैटर्न गठन में हस्तक्षेप करती हैं। इसलिए, प्रोटोकॉल में वह चरण शामिल नहीं है जो अर्क19 में ऊर्जा मिश्रण जोड़ता है।

इंटरफेज़ एक्सट्रैक्ट प्रोटोकॉल ईजीटीए-मुक्त बफर में अंडे को कुचलने पर निर्भर करता है ताकि उन्हें मियोटिक गिरफ्तारी (सीएसएफ-गिरफ्तारी) से मुक्त किया जा सके। अर्क बाद में इंटरफेज़ में प्रगति करते हैं, और साइक्लोहेक्सिमाइड द्वारा इंटरफ़ेज़ में रखे जाते हैं। इंटरफेज़ अर्क तैयार करने के लिए अन्य स्थापित तरीके हैं। कुछ विधियां पहले अर्क तैयार करती हैं जो ईजीटीए38 के साथ लाइसिस बफर में अंडे को कुचलकर मीओटिक गिरफ्तारी को बनाए रखती हैं, और फिर कैल्शियम जोड़कर गिरफ्तारी जारी करती हैं, जिससे अर्क को इंटरफेज 21,37,39 में चला जाता है। अर्क को बाद में प्रोटीन संश्लेषण अवरोधकों जैसे साइक्लोहेक्सिमाइड37,39 के अलावा इंटरफेज में रखा जा सकता है। ईजीटीए 20,28 की अनुपस्थिति में अंडे को कुचलने से पहले, अन्य तरीकों से कैल्शियम आयोनोफोर (ए 23187) या बिजली के झटके के साथ अंडे को सक्रिय किया जाता है, ताकि उन्हें मियोटिक गिरफ्तारी से मुक्त किया जा सके (फील्ड एट अल.37 में समीक्षा की गई)। ये अर्क इंटरफ़ेज़ में प्रवेश कर सकते हैं लेकिन आमतौर पर वहां नहीं रहेंगे क्योंकि वे कई सेल चक्रों से गुजरने में सक्षम हैं। इसी तरह, बरकरार एक्टिन साइटोस्केलेटन के साथ अर्क तैयार करने के लिए अनुकूलित अच्छी तरह से स्थापित तरीकों को 10,37,39 विकसित किया गया है। इमेजिंग विधि इस प्रकार के अर्क के लिए उपयुक्त हो सकती है, लेकिन हमने उनके साथ इसका परीक्षण नहीं किया है।

साइटोप्लाज्म के आंतरिक संगठन की इमेजिंग के उद्देश्य से, यहां प्रस्तुत इमेजिंग सिस्टम को स्थापित करना अपेक्षाकृत आसान है, जिसमें केवल ग्लास सतहों पर एफईपी टेप लगाने की आवश्यकता होती है। यह अधिक परिष्कृत इमेजिंग सिस्टम में रिपोर्ट किए गए अर्क9 में साइटोस्केलेटल संरचनाओं को इकट्ठा करने की अनुमति देता है जहां ग्लास सतहों को पॉली-एल-लाइसिन-जी-पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीएलएल-जी-पीईजी) उपचार के साथ पारित किया जाता है या समर्थित लिपिड बाइलेयर10,21 के साथ लेपित किया जाता है। विधि अर्क परत को परिभाषित मोटाई (स्पेसर की गहराई से निर्धारित, जो चित्रा 1 ए, 1 एच, 1 आई और चित्रा 2 में दिखाए गए सिस्टम के लिए 120 μm है) के साथ बनाने की अनुमति देती है। हम अतिरिक्त स्पेसर को ढेर करके मोटाई को समायोजित कर सकते हैं। हमने 6 ऐसे स्पेसर (720 μm मोटी) तक ढेर कर दिए हैं और डिब्बे सामान्य रूप से बनते हैं। यह लचीलापन भविष्य के अनुप्रयोगों को सक्षम बनाता है जैसे कि कॉन्फोकल या लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 3 डी में अर्क की इमेजिंग।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए जे. कामेन्ज़, वाई. चेन और डब्ल्यू. वाई. सी. हुआंग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को जेम्स ई फेरेल, जूनियर को सम्मानित नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर01 जीएम 110564, पी 50 जीएम 107615, और आर 35 जीएम 131792) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17 ml centrifuge tube Beckman Coulter 337986
22x22 mm square #1 cover glass Corning 284522
Aprotinin MilliporeSigma 10236624001 Protease inhibitor
Cycloheximide MilliporeSigma 01810 Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B MilliporeSigma C6762 Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs Nasco LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL488M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL670M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape CS Hyde company 23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG) MilliporeSigma CG10
Imaging spacer Electron Microscopy Sciences 70327-8S
Leupeptin MilliporeSigma 11017101001 Protease inhibitor
Microscope slides Fisher Scientific 12-518-100B
Mineral oil MilliporeSigma 330760
MitoTracker Red CMXRos Thermo Fisher Scientific M7512 For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) BioVendor RP1782725000
Roller applicator Amazon B07HMBJSP8 For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640 For removing excessive FEP tape
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-7M

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References

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Cheng, X., Ferrell, Jr., J. E. Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization. J. Vis. Exp. (172), e61923, doi:10.3791/61923 (2021).

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