Summary
Vi beskriver en metode for fremstilling og levende avbildning av ufortynnede cytoplasmatiske ekstrakter fra Xenopus laevis-egg .
Abstract
Tradisjonelt brukt til bulk biokjemiske analyser, har Xenopus laevis eggekstrakter dukket opp som et kraftig bildebasert verktøy for å studere cytoplasmatiske fenomener, som cytokinese, mitotisk spindeldannelse og montering av kjernen. Ved å bygge på tidlige metoder som avbildet faste ekstrakter samplet på sparsomme tidspunkter, nærmer nyere bilder levende ekstrakter ved hjelp av time-lapse mikroskopi, og avslører mer dynamiske funksjoner med forbedret tidsmessig oppløsning. Disse metodene krever vanligvis sofistikerte overflatebehandlinger av bildekaret. Her introduserer vi en alternativ metode for levende avbildning av eggekstrakter som ikke krever kjemisk overflatebehandling. Det er enkelt å implementere og benytter masseproduserte laboratorieforbruksvarer for avbildning. Vi beskriver et system som kan brukes til både vidvinkelmikroskopi og konfokalmikroskopi. Den er designet for avbildningsekstrakter i et 2-dimensjonalt (2D) felt, men kan enkelt utvides til avbildning i 3D. Det er godt egnet for å studere romlig mønsterdannelse i cytoplasma. Med representative data demonstrerer vi den typiske dynamiske organisasjonen av mikrotubuli, kjerner og mitokondrier i interfaseekstrakter fremstilt ved hjelp av denne metoden. Disse bildedataene kan gi kvantitativ informasjon om cytoplasmatisk dynamikk og romlig organisering.
Introduction
Cytoplasma utgjør hovedvolumet til en celle og har en distinkt organisasjon. Ingrediensene i den eukaryote cytoplasma kan selvmontere seg i et bredt spekter av romlige strukturer, for eksempel mikrotubuli asters og Golgi-apparatet, som igjen er dynamisk ordnet og omgjort avhengig av cellens identitet og fysiologiske tilstand. Å forstå den romlige organiseringen av cytoplasma og dens kobling til cellulære funksjoner er derfor viktig for å forstå hvordan cellen fungerer. Xenopus laevis eggekstrakter har tradisjonelt blitt brukt til bulk biokjemiske analyser 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyere arbeid etablerer dem som et kraftig levende bildebehandlingssystem for mekanistiske studier av cytoplasmatiske strukturer og deres cellulære funksjoner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Disse ufortynnede ekstraktene bevarer mange strukturer og funksjoner i cytoplasma, samtidig som de tillater direkte manipulasjoner av cytoplasmatisk innhold som ikke kan oppnås i konvensjonelle cellebaserte modeller19,20. Dette gjør dem ideelle for å karakterisere cytoplasmatiske fenomener og dissekere deres mekanistiske grunnlag.
Eksisterende metoder for avbildning av ekstrakter krever kjemiske overflatemodifikasjoner, eller fabrikasjon av mikrofluidiske enheter. En coverslip-basert metode krever polyetylenglykol (PEG) passivering av glassdeksel21. En mikroemulsjonsbasert metode krever dampavsetning av triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan på glassflater22,23. Mikrofluidbaserte systemer tillater presis kontroll av volum, geometri og sammensetning av ekstraktdråper, men krever spesialiserte mikrofabrikasjonsanlegg11,12,24.
Her introduserer vi en alternativ metode for avbildning av eggekstrakter som er enkel å implementere og benytter lett tilgjengelige, rimelige materialer. Dette inkluderer fremstilling av et bildekammer med et lysbilde og et deksel belagt med fluorert etylenpropylen (FEP) tape. Kammeret kan brukes til avbildningsekstrakter med en rekke mikroskopisystemer, inkludert stereoskoper og stående og inverterte mikroskoper. Denne metoden krever ingen kjemisk behandling av overflater, samtidig som man oppnår tilsvarende optisk klarhet oppnådd med eksisterende glassbaserte metoder diskutert ovenfor. Den er designet for å avbilde et lag med ekstrakter med en jevn tykkelse over et 2D-felt, og kan enkelt utvides til å avbilde et 3D-volum av ekstrakter. Det er godt egnet for time-lapse-avbildning av kollektiv cytoplasmatisk oppførsel over et stort synsfelt.
Vi har brukt interfase-arresterte eggekstrakter for å demonstrere vår bildebehandlingsmetode. Ekstraktpreparatet følger protokollen til Deming og Kornbluth19. Kort fortalt knuses egg som naturlig arresteres i metafase av meiose II av et spinn med lav hastighet. Dette spinnet frigjør cytoplasma fra meiotisk arrest og lar ekstraktet fortsette inn i interfase. Normalt tilsettes cytokalasin B før knusespinnet for å hemme F-aktindannelsen. Det kan imidlertid utelates hvis F-aktin er ønskelig. Cykloheksimid tilsettes også før knusespinnet for å forhindre at interfaseekstraktet kommer inn i neste mitose. Ekstraktene blir deretter plassert i de nevnte avbildningskamrene og plassert på et mikroskop. Til slutt blir bilder tatt opp over tid med definerte intervaller av et kamera koblet til mikroskopet, og produserer time-lapse-bildeserier som fanger den dynamiske oppførselen til ekstraktet i et 2D-felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stanford University.
1. Forberedelse av lysbilder og coverslips
- Påfør et lag fluorert etylenpropylen (FEP) tape på et glassglass med en rulleapplikator. Klipp av overdreven tape over kantene med et rent barberblad. Klargjør FEP tape-belagte coverslips på samme måte (figur 1A).
- Påfør et dobbeltsidig klebrig bildeavstandsstykke på FEP-tapebelagte siden av lysbildet. La beskyttelsesfôret stå på toppen uskrellet (figur 1A).
MERK: Lysbildene og omslagsslippene skal klargjøres før eksperimentet. De kan brukes umiddelbart, eller lagres i esker for å forhindre støvakkumulering på overflater. Brønnen i bildeavstandsstykket er 120 μm dyp og har en diameter på 9 mm.
2. Forberedelse og levende avbildning av interfase-arresterte eggekstrakter
MERK: Følgende protokoll er tilpasset fra Deming og Kornbluth19, Murray20 og Smythe og Newport25 med modifikasjoner. Alle trinn skal utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt.
- Tre til ti dager før egginnsamling, injiser modne kvinnelige Xenopus laevis frosker subkutant inn i dorsal lymfesekken med 100 IE drektig hoppeserumgonadotropin (PMSG).
- Seksten til atten timer før planlagt egginnsamling, injiser froskene fra trinn 2.1 med 500 IE humant choriongonadotropin (hCG). La frosker stå ved 18 °C i eggleggingsbuffer (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, tilberedes som en 20x stamløsning ved pH7,4 og fortynnes med rent frosketankvann til 1x før bruk) til egginnsamling.
- På dagen for forsøket, samle egg i et stort glass petriskål og vurder eggkvaliteten. Kast egg som ser ut som hvite puffede baller eller vises i en streng (figur 1B). Undersøk eggene under et stereoskop, hold eggene med normalt utseende (figur 1C), og kast de med uregelmessig eller flekkete pigment (figur 1D).
MERK: Denne protokollen fungerer med egg samlet fra en enkelt frosk, som vanligvis legger 25 ml egg innen 16 timer etter hCG-injeksjon. Vanligvis induseres totalt 3 til 6 frosker av hCG, og frosken med høyest eggkvalitet er valgt for ekstraktforsøket. - Overfør egg til et 400 ml glassbeger, og fjern så mye eggleggingsbuffer som mulig ved å dekantere.
- Inkuber eggene i 100 ml nylaget dejellyingløsning (2% w / v L-cystein i vann, juster til pH 8,0 med NaOH) og virvle dem forsiktig med jevne mellomrom. Etter ca. 3 minutter, hell av løsningen, og tilsett 100 ml frisk dejellying-løsning. Fortsett inkubasjonen til eggene er tett pakket (ingen mellomrom mellom eggene), men unngå å la egg ligge i dejellying-løsningen i mer enn totalt 5 minutter.
- Fjern så mye av dejellying-løsningen som mulig ved dekantering, og vask eggene i 0,25x MMR-buffer (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, fremstilt som en 10x stamløsning, justert til pH 7,8 med NaOH, og fortynnet i Milli-Q vann før bruk) ved å legge til bufferen, virvler eggene, og hell deretter av bufferen. Gjenta noen ganger til totalt 1 L av bufferen brukes til vaskene.
- Vask eggene et par ganger med totalt 400 ml egglysebuffer (250 mM sukrose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, laget fersk og justert til pH 7,7 med KOH). Fjern egg med unormalt utseende ved hjelp av en Pasteur-pipette mellom vaskene.
MERK: Egg med unormalt utseende refererer til de som ser ut som hvite puffede baller (figur 1B), har flekkete pigmentering (figur 1D), forverres med et voksende hvitt område (figur 1E), eller viser mørkt og kontrahert pigmentert område i dyrehalvkule (figur 1F). - Bruk en overføringspipette med spissen kuttet vidåpen, overfør eggene til et 17 ml rundbunnet sentrifugerør som inneholder 1 ml egglysebuffer. Spinn røret i en klinisk sentrifuge ved 400 x g i 15 sekunder for å pakke eggene.
- Fjern så mye av egglysebufferen som mulig fra toppen av pakkede egg ved hjelp av en Pasteur-pipette.
MERK: Det er viktig å fjerne så mye buffer fra de pakkede eggene som mulig, for å minimere fortynningen av eggekstraktet. Noen ganger er det nødvendig å fjerne noen løse egg sammen med restbufferen for å oppnå dette. - Bestem det omtrentlige volumet av de pakkede eggene, og tilsett deretter 5 μg / ml aprotinin, 5 μg / ml leupeptin, 5 μg / ml cytochalasin B og 50 μg / ml cykloheksimid direkte på toppen av de pakkede eggene.
MERK: Aprotinin og leupeptin er proteasehemmere. Cytochalasin B hemmer aktinpolymerisering, og forhindrer ekstraktet i å trekke seg sammen og gelere26. Cykloheksimid hemmer proteinsyntese, og holder dermed ekstraktet i interfasen av cellesyklusen. - Knus eggene ved å sentrifugere røret ved 12 000 x g, 4 °C, i 15 minutter, i en svingende bøtterotor.
MERK: På slutten av sentrifugeringen skal eggene ha sprukket og lysatet delt inn i tre hovedlag: et gult lipidlag på toppen, cytoplasmatisk ekstrakt (også kalt råekstrakt) i midten og et mørkt tett lag som inneholder pigmentgranulatene nederst (figur 1G). - Fest en 18-gauge nål til en sprøyte. Med nålespissens skråkant vendt opp, punkter røret fra siden nederst på det cytoplasmatiske laget, og gjenopprett ekstraktet ved å tegne sakte.
MERK: Tegn cytoplasmatisk ekstrakt sakte for å unngå inkludering av forurensende innhold fra det gule lipidlaget. - Overfør det gjenvunnede cytoplasmatiske ekstraktet til et nytt mikrosentrifugerrør og hold det på is. Bruk ekstraktet innen 1 time.
- Når du er klar til å avbilde, supplere ekstraktet med ønskede reagenser og fluorescensavbildningsprober.
MERK: Fluorescensavbildningsprober merker spesifikke cytoplasmatiske strukturer slik at de kan visualiseres av et fluorescensmikroskop. - Fjern den øverste beskyttelsesforingen fra bildeavstandsstykket på lysbildet som er klargjort i trinn 1.2, og deponer ca. 7 μL ekstrakt i midten av brønnen. Påfør umiddelbart FEP tape-belagt dekselslipp med FEP-siden vendt mot ekstraktet for å forsegle brønnen. Gå raskt videre til bildebehandling (figur 1H,I).
- Sett lysbildet på et omvendt eller oppreist mikroskop med en motorisert scene og et digitalt kamera. Se for deg ekstraktene ved ønskede romlige posisjoner og tidsintervaller i både lysfelt- og fluorescenskanaler.
MERK: Vanligvis brukes et 5x mål for bildebehandling. Det motoriserte trinnet muliggjør automatisert bildeinnhenting ved flere definerte romlige posisjoner. Lysfeltmikroskopi visualiserer cytoplasmatiske strukturer med forskjellige grader av gjennomsiktighet. Fluorescensmikroskopi visualiserer cytoplasmatiske strukturer spesielt merket av fluorescensavbildningsprobene lagt til i trinn 2.14. Kameraet registrerer time-lapse-bilder av disse strukturene, og fanger dermed dynamikken i cytoplasmatisk organisasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus laevis eggekstrakter kan brukes til å studere cytoplasmens selvorganisasjon under interfase. Figur 2A viser resultater fra et vellykket eksperiment. Vi supplerte interfase-arresterte ekstrakter med demembranerte Xenopus laevis sædkjerner 19 ved en konsentrasjon på 27 kjerner / μL og 0,38 μM renset GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (fusjonsprotein bestående av glutation-S-transferase, grønt fluorescerende protein og en nukleær lokaliseringssekvens) for å tillate rekonstituering og visualisering av interfasekjerner. Vi har også lagt til 1 μM fluorescerende merket tubulin for å visualisere mikrotubuli, og 500 nM MitoTracker Red CMXRos for å visualisere mitokondrier. Øyeblikk etter at ekstraktet ble plassert i bildekammeret, virket cytoplasma uorganisert. I løpet av de neste 30 minuttene ved romtemperatur begynte cytoplasma å organisere seg selv i cellelignende rom. Mikrotubuli asters vokste fra sentrosomer introdusert med sædkjernene, og dannet mikrotubuli-utarmede grensesoner når de ble møtt med mikrotubuli fra nærliggende asters. GST-GFP-NLS-protein translokert inn i de runde interfasekjernene selvmontert fra de tilsatte demembranerte sædkjernene. Områder som var tømt for lysspredende cytoplasmatiske komponenter var synlige i både lysfelt- og mitokondriekanaler (figur 2A, 20 min og 35 min). Mitokondrier ble også utarmet fra grensene etablert av mikrotubuli, og ble beriket i isolerte rom som var på linje med mikrotubulirom. Ved 60 min ved romtemperatur bør et romlig mønster bestående av cellelignende rom være veletablert, med mikrotubuli som danner en hul kranslignende struktur, og mitokondrier tydelig delt inn i hvert rom (figur 2A, 53 min).
Figur 2B sammenligner ekstraktytelsen i avbildningskamre med og uten FEP-tape på glass. Vi supplerte interfase-arresterte ekstrakter med demembranerte Xenopus laevis sædkjerner19 i en konsentrasjon på 27 kjerner / μL og 0,35 μM GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (fusjonsprotein bestående av glutation-S-transferase, mCherry fluorescerende protein og en nukleær lokaliseringssekvens) for å tillate rekonstituering og visualisering av interfasekjerner. Vi har også lagt til 1 μM fluorescerende merket tubulin for å visualisere mikrotubuli. Forskjeller i dynamikk ble tydelige med omtrent 20 minutter ved romtemperatur. I kammeret laget med FEP-tapet glass organiserte ekstraktet seg selv i normale cellelignende mønstre (figur 2B, bilder i rad 1 og 3). Men i kammeret der glassflatene ikke var dekket av FEP-båndet (ikke passivert), viste ekstraktet unormale lysfelt- og mikrotubulimønstre som ble stadig mer forstyrret over tid (figur 2B, bilder i rad 2 og 4). Ingen signifikante forskjeller ble observert i kjernefysisk import av GST-mCherry-NLS-proteinet (figur 2B, bilder i rad 5 og 6).
Figur 1: Skjemaer og bilder relatert til eksperimentell prosedyre. (A) Skjematisk diagram for fremstilling av FEP tapebelagte glassduker og lysbilder. (B) Xenopus laevis egg deponert i eggleggingsbuffer, med eksempler på egg av dårlig kvalitet angitt med piler. Gule piler, eksempler på egg som ser ut som hvite puffede baller. Røde piler, eksempler på egg som vises i en streng. (C) Eksempler på Xenopus laevis egg med normalt utseende. (D) Eksempler på egg av dårlig kvalitet med uregelmessig eller flekkete pigment. (E) Et forverret egg med en voksende hvit region. (F) Et egg som viser mørkt og kontrahert pigmentert område, muligens på grunn av parthenogenetisk aktivering. (G) Lagene dannet av sprukne Xenopus laevis-egg etter 12 000 x g sentrifugering i trinn 2.11. (H) Skjemaer for fremstilling av ekstraktavbildningskammer i trinn 2.15. (I) Et bilde av et forberedt avbildningskammer med et eggekstrakt inni. (C) og (D) deler samme skalalinje nederst på (D). (E) og (F) deler samme skalalinje nederst på (F). Skalastolpene i (B) (C) (D) (E) (F) og (I) er omtrentlige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Interfase-arresterte eggekstrakter selvorganiserer seg i cellelignende rom . (A) Time-lapse montasje av selvorganisert mønsterdannelse i et tynt lag (120 μm) av interfase-arrestert Xenopus laevis egg ekstrakt. Ekstraktet ble supplert med 27 kjerner / μL av demembranerte Xenopus laevis sædkjerner for å tillate rekonstituering av interfasekjernene. Mikrotubuli ble visualisert av HiLyte 647-merket tubulin (vist i magenta), mitokondrier av MitoTracker Red CMXRos (vist i rødt) og kjerner av GST-GFP-NLS (vist i grønt). (B) Selvorganisert mønsterdannelse i interfase-arresterte Xenopus laevis eggekstrakter plassert i kamre med og uten FEP-tape dekket glassflater. Ekstraktene ble supplert med 27 kjerner / μL av demembranerte Xenopus laevis sædkjerner for å tillate rekonstituering av interfasekjernene. Mikrotubuli ble visualisert av HiLyte 488-merket tubulin (vist i magenta) og kjerner av GST-mCherry-NLS (vist i grønt). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Valgfri sekundær forsegling for bildekammeret. Skjemaer for fremstilling av en valgfri sekundær tetning med mineralolje for å forhindre at ekstraktet kommer i langvarig kontakt med luft. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis eggekstrakter har dukket opp som et kraftig modellsystem for bildebaserte studier av ulike subcellulære strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 og cytoplasmatisk organisasjon på en helhet celleskala 9. Her har vi beskrevet en levende bildebehandlingsmetode egnet for å visualisere dynamisk cytoplasmatisk organisasjon i 2D. Effektiviteten av metoden er demonstrert av representative resultater.
Flere trinn er avgjørende for metodens suksess. Eggkvalitet er viktig for ekstrakter, så trinn 2.3 og 2.7 er kritiske. Etter vår erfaring har dyrehalvkule av egg av høy kvalitet jevn pigmentering, en tydelig hvit prikk i midten (indikativ for germinal vesikkelbrudd, GVBD) og en klar grense med den vegetabilske halvkule (figur 1C). Ekstraktene laget av egg av høy kvalitet har bedre ytelse under våre bildeforhold. Hvis mer enn 5 % av eggene har flekkete pigment (figur 1D), har mørkt og sammentrukket pigmentert område (figur 1F), ser ut som hvite puffede baller (figur 1B), vises i en streng (figur 1B) eller viser tegn på forringelse etter vasken i trinn 2.6 og 2.7 (figur 1E), skal hele batchen med egg kastes. Ekstraktene beholder bemerkelsesverdig biologisk aktivitet fordi de i hovedsak er ufortynnet cytoplasma. Derfor er trinnet som tar sikte på å minimere fortynning av ekstraktet (trinn 2.9) viktig for eksperimentets suksess. For avbildning håndteres ekstrakter i svært små mengder, og vil fordampe raskt hvis de er i langvarig kontakt med luft. Dette vil påvirke deres aktivitet negativt. Derfor, i trinn 2.15, etter at ekstraktet er avsatt, må det forsegles med FEP tape-belagt side av dekselet så snart som mulig. Forsegling kan bekreftes visuelt av teksturendringen på kontaktstedet mellom limet på avstandsstykket og dekselet. Avstandsstykket skal kunne lage en komplett forsegling hvis den påføres riktig. Men hvis en ekstra tetning er ønskelig, kan mineralolje dispenseres mellom overhenget på dekselet og glassglasset. Oljen kan danne en ekstra tetning rundt avstandsstykket ved kapillærvirkning (figur 3). Passivering av glassflater kan redusere uspesifikk adsorpsjon av molekyler, og det er viktig for interfase mikrotubuli asters i ekstrakter21,37. Påføringen av FEP-tape over en glassoverflate beskrevet her ser ut til å gi lignende fordeler, som foreslått av montering av normale interfase mikrotubuli asters (figur 2, 6 min). Derfor er trinn 1.1 også kritisk.
Vi demonstrerte anvendelsen av en avbildningsmetode ved hjelp av interfase-arresterte eggekstrakter etter protokollen til Deming og Kornbluth19. Som standard supplerer protokollen ekstraktene med aktinpolymerisasjonshemmeren cytochalasin B for å forhindre geleringskontraksjon i ekstraktene etter utvidet inkubasjon ved romtemperatur26. For å tillate aktinpolymerisering og observere aktindynamikk, kan man utelate cytochalasin B i trinn 2.10 i protokollen9. En modifikasjon vi har gjort i Deming og Kornbluth-protokollen er at vi ikke supplerer ekstrakter med en energimiks for å regenerere ATP19. Dette skyldes at i våre hender, i ekstrakter supplert med denne ATP-regenererende blandingen19 og sædkjerner, danner mikrotubuli av og til et tverrbundet gitter som forstyrrer cytoplasmatisk mønsterdannelse. Protokollen inneholder derfor ikke trinnet som tilfører energimiksen til ekstraktene19.
Interfaseekstraktprotokollen er avhengig av å knuse egg i EGTA-fri buffer for å frigjøre dem fra meiotisk arrest (CSF-arrest)37. Ekstraktene går deretter videre til interfase, og holdes i interfase av cykloheksimid. Det finnes andre etablerte metoder for fremstilling av interfaseekstrakter. Noen metoder forbereder først ekstrakter som opprettholder meiotisk arrest ved å knuse egg i lysisbuffer med EGTA38, og deretter frigjøre arrestasjonen ved å tilsette kalsium, og drive ekstraktet inn i interfase 21,37,39. Ekstraktene kan deretter holdes i interfase ved tilsetning av proteinsyntesehemmere som cykloheksimid37,39. Andre metoder parthenogenetisk aktiverer egg med kalsiumionofor (A23187) eller elektrisk støt for å frigjøre dem fra meiotisk arrest, før eggene knuses i fravær av EGTA20,28 (gjennomgått i Field et al.37). Disse ekstraktene kan gå inn i interfase, men vil vanligvis ikke forbli der, da de er i stand til å gjennomgå flere cellesykluser. På samme måte er det utviklet veletablerte metoder optimalisert for fremstilling av ekstrakter med intakt aktincytoskjelett 10,37,39. Bildemetoden kan være egnet for denne typen ekstrakter, men vi har ikke testet den med dem.
For å avbilde den interne organisasjonen av cytoplasma, er bildebehandlingssystemet som presenteres her relativt enkelt å sette opp, og krever bare å bruke et FEP-bånd på glassflater. Det tillater montering av cytoskeletale strukturer i ekstrakter9 rapportert i mer sofistikerte bildesystemer hvor glassflater passiveres med poly-L-lysin-g-polyetylenglykol (PLL-g-PEG) behandling eller belagt med støttede lipid dobbeltlag10,21. Metoden lar ekstraktlaget dannes med en definert tykkelse (bestemt av dybden på avstandsstykket, som er 120 μm for systemet vist i figur 1A, 1H, 1I og figur 2). Vi kan justere tykkelsen ved å stable ekstra avstandsstykker. Vi har stablet opptil 6 slike avstandsstykker (720 μm tykke) og rommene dannet normalt. Denne fleksibiliteten muliggjør fremtidige applikasjoner som avbildning av ekstraktene i 3D ved hjelp av konfokal eller lysarkmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker J. Kamenz, Y. Chen og W. Y. C. Huang for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 og R35 GM131792) tildelt James E. Ferrell, Jr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W.
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
