Summary
Vi beskriver en metod för beredning och levande avbildning av outspädda cytoplasmatiska extrakt från Xenopus laevis ägg.
Abstract
Traditionellt används för bulkbiokemiska analyser, Xenopus laevis äggextrakt har framträtt som ett kraftfullt bildbaserat verktyg för att studera cytoplasmatiska fenomen, såsom cytokinese, mitotisk spindelbildning och montering av kärnan. Baserat på tidiga metoder som avbildade fasta extrakt som samplades vid glesa tidpunkter, avbildar de senaste tillvägagångssätten live-extrakt med hjälp av time-lapse-mikroskopi, vilket avslöjar mer dynamiska funktioner med förbättrad tidsupplösning. Dessa metoder kräver vanligtvis sofistikerade ytbehandlingar av bildkärlet. Här introducerar vi en alternativ metod för levande avbildning av äggextrakt som inte kräver någon kemisk ytbehandling. Det är enkelt att implementera och använder massproducerade laboratorieförbrukningsvaror för avbildning. Vi beskriver ett system som kan användas för både bredfälts- och konfokalmikroskopi. Den är utformad för avbildningsextrakt i ett 2-dimensionellt (2D) fält, men kan enkelt utökas till avbildning i 3D. Det är väl lämpat för att studera rumslig mönsterbildning i cytoplasman. Med representativa data demonstrerar vi den typiska dynamiska organisationen av mikrotubuli, kärnor och mitokondrier i interfasextrakt framställda med användning av denna metod. Dessa bilddata kan ge kvantitativ information om cytoplasmatisk dynamik och rumslig organisation.
Introduction
Cytoplasman utgör huvudvolymen i en cell och har en distinkt organisation. Ingredienserna i den eukaryota cytoplasman kan självmonteras i ett brett spektrum av rumsliga strukturer, såsom mikrotubule asters och Golgi-apparaten, som i sin tur är dynamiskt anordnade och vända beroende på cellens identitet och fysiologiska tillstånd. Att förstå cytoplasmans rumsliga organisation och dess koppling till cellulära funktioner är därför viktigt för att förstå hur cellen fungerar. Xenopus laevis äggextrakt har traditionellt använts för bulk biokemiska analyser 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyligen genomförda arbeten etablerar dem som ett kraftfullt levande avbildningssystem för mekanistiska studier av cytoplasmatiska strukturer och deras cellulära funktioner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Dessa outspädda extrakt bevarar många strukturer och funktioner hos cytoplasman, samtidigt som de tillåter direkta manipuleringar av cytoplasmatiskt innehåll som inte kan uppnås i konventionella cellbaserade modeller19,20. Detta gör dem idealiska för att karakterisera cytoplasmatiska fenomen och dissekera deras mekanistiska underlag.
Befintliga metoder för avbildningsextrakt kräver kemiska ytmodifieringar eller tillverkning av mikrofluidiska anordningar. En täckslipbaserad metod kräver polyetylenglykol (PEG) passivering av glasöverdrag21. En mikroemulsionsbaserad metod kräver ångavsättning av triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan på glasytor22,23. Mikrofluidikbaserade system möjliggör exakt kontroll av volymen, geometrin och sammansättningen av extraktdroppar, men kräver specialiserade mikrofabrikationsanläggningar11,12,24.
Här introducerar vi en alternativ metod för avbildning av äggextrakt som är lätt att implementera och använder lättillgängliga, billiga material. Detta inkluderar beredning av en bildkammare med en bild och en täckskiva belagd med fluorerad etylenpropylentejp (FEP). Kammaren kan användas för avbildningsextrakt med en mängd olika mikroskopisystem, inklusive stereoskop och upprättstående och inverterade mikroskop. Denna metod kräver ingen kemisk behandling av ytor samtidigt som liknande optisk klarhet uppnås med befintliga glasbaserade metoder som diskuterats ovan. Den är utformad för att avbilda ett lager av extrakt med en enhetlig tjocklek över ett 2D-fält och kan enkelt utökas för att avbilda en 3D-volym extrakt. Den är väl lämpad för time-lapse-avbildning av kollektivt cytoplasmatiskt beteende över ett stort synfält.
Vi har använt interfas-arresterade äggextrakt för att demonstrera vår avbildningsmetod. Extraktberedningen följer protokollet för Deming och Kornbluth19. Kortfattat krossas ägg som naturligt arresteras i metafas av meios II av en låg hastighetsspinn. Denna spinn frigör cytoplasman från meiotisk arrestering och tillåter extraktet att fortsätta in i interfas. Normalt tillsätts cytochalasin B före krossspinnet för att hämma F-aktinbildning. Det kan dock utelämnas om F-aktin önskas. Cykloheximid tillsätts också före krossspinnet för att förhindra att interfasextraktet kommer in i nästa mitos. Extrakten placeras därefter i de ovan nämnda bildkamrarna och placeras på ett mikroskop. Slutligen spelas bilder in över tid med definierade intervall av en kamera ansluten till mikroskopet, vilket ger tidsfördröjningsbildserier som fångar extraktets dynamiska beteende i ett 2D-fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Stanford University.
1. Förberedelse av glidbanor och täckglas
- Applicera ett lager fluorerad etylenpropylen (FEP) tejp på en glasskiva med en rullapplikator. Klipp av överdriven tejp över kanterna med ett rent rakblad. Förbered FEP bandbelagda täckglas på samma sätt (figur 1A).
- Applicera en dubbelsidig klibbig bilddistans på den FEP-tejpbelagda sidan av bilden. Lämna skyddsfodret på ovansidan oskalat (figur 1A).
OBS: Bilderna och täckglasen bör förberedas före experimentet. De kan användas omedelbart eller förvaras i lådor för att förhindra dammansamling på ytor. Brunnen i bilddistansen är 120 μm djup och har en diameter på 9 mm.
2. Beredning och levande avbildning av interfasarresterade äggextrakt
OBS: Följande protokoll är anpassat från Deming och Kornbluth19, Murray20 och Smythe och Newport25 med modifieringar. Alla steg ska utföras vid rumstemperatur om inget annat anges.
- Tre till tio dagar före ägguppsamling, injicera mogna kvinnliga Xenopus laevis grodor subkutant i dorsal lymfsäcken med 100 IE av gravid sto serumgonadotropin (PMSG).
- Sexton till arton timmar före planerad ägguppsamling, injicera grodorna från steg 2.1 med 500 IE humant koriongonadotropin (hCG). Lämna grodor vid 18 °C i äggläggningsbuffert (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2,5 mM CaCl 2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, förbered som en20xstamlösning vid pH7,4 och späd med rent grodtankvatten till 1x före användning) tills ägguppsamling.
- På experimentdagen, samla ägg i en stor glas petriskål och bedöma äggkvaliteten. Kassera alla ägg som ser ut som vita puffiga bollar eller visas i en sträng (figur 1B). Undersök äggen under ett stereoskop, håll äggen med normalt utseende (figur 1C) och kassera dem med oregelbundet eller fläckigt pigment (figur 1D).
OBS: Detta protokoll fungerar med ägg som samlats in från en enda groda, som vanligtvis lägger 25 ml ägg med 16 timmar efter hCG-injektion. Vanligtvis induceras totalt 3 till 6 grodor av hCG, och grodan med högsta äggkvalitet väljs för extraktberedningsexperimentet. - Överför ägg till en 400 ml glasbägare och ta bort så mycket äggläggningsbuffert som möjligt genom dekantering.
- Inkubera äggen i 100 ml nyberedd dejellyinglösning (2% w/v L-cystein i vatten, justera till pH 8,0 med NaOH) och virvla dem försiktigt med jämna mellanrum. Häll av lösningen efter ca 3 minuter och tillsätt 100 ml färsk dejellying-lösning. Fortsätt inkubationen tills äggen är tätt packade (inget utrymme mellan äggen), men undvik att lämna ägg i dejellying-lösningen i mer än totalt 5 minuter.
- Ta bort så mycket av degelélösningen som möjligt genom dekantering och tvätta äggen i 0,25x MMR-buffert (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, beredd som en 10x stamlösning, justerad till pH 7,8 med NaOH och utspädd i Milli-Q-vatten före användning) genom att tillsätta bufferten, virvla äggen och häll sedan av bufferten. Upprepa några gånger tills totalt 1 liter av bufferten används för tvättarna.
- Tvätta äggen några gånger med totalt 400 ml ägglysbuffert (250 mM sackaros, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, färskt och justerat till pH 7,7 med KOH). Ta bort ägg med onormalt utseende med en Pasteur-pipett mellan tvättarna.
OBS: Ägg med onormalt utseende avser de som ser ut som vita puffiga bollar (figur 1B), har fläckig pigmentering (figur 1D), försämras med en växande vit region (figur 1E) eller visar mörkare och kontrakterat pigmenterat område på djurhalvklotet (figur 1F). - Använd en överföringspipett med spetsen vidöppen och överför äggen till ett 17 ml rundbottnat centrifugrör som innehåller 1 ml ägglysbuffert. Snurra röret i en klinisk centrifug vid 400 x g i 15 sekunder för att packa äggen.
- Ta bort så mycket av ägglysbufferten som möjligt från toppen av förpackade ägg med en Pasteur-pipett.
OBS: Det är viktigt att ta bort så mycket buffert från de packade äggen som möjligt för att minimera utspädningen av äggextraktet. Ibland är det nödvändigt att ta bort några lösa ägg tillsammans med restbufferten för att uppnå detta. - Bestäm den ungefärliga volymen av de förpackade äggen och tillsätt sedan 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml cytochalasin B och 50 μg/ml cykloheximid direkt ovanpå de förpackade äggen.
OBS: Aprotinin och leupeptin är proteashämmare. Cytochalasin B hämmar aktinpolymerisation, vilket förhindrar att extraktet kontraherar och gelar26. Cykloheximid hämmar proteinsyntesen och håller därmed extraktet i cellcykelns interfas. - Krossa äggen genom att centrifugera röret vid 12 000 x g, 4 °C, i 15 minuter i en svängande skoprotor.
OBS: I slutet av centrifugeringen bör äggen ha spruckit och lysatet separerats i tre huvudskikt: ett gult lipidskikt ovanpå, det cytoplasmatiska extraktet (även kallat råextrakt) i mitten och ett mörkt tätt skikt som innehåller pigmentgranulerna längst ner (Figur 1G). - Fäst en 18-gauge nål på en spruta. Med nålspetsen uppåt, punktera röret från sidan längst ner i det cytoplasmatiska skiktet och återvinn extraktet genom att dra långsamt.
OBS: Dra cytoplasmatiska extraktet långsamt för att undvika att förorenande innehåll från det gula lipidskiktet inkluderas. - Överför det återvunna cytoplasmatiska extraktet till ett nytt mikrocentrifugrör och håll det på is. Använd extraktet inom 1 timme.
- När du är redo att avbilda, komplettera extraktet med önskade reagenser och fluorescensavbildningssonder.
OBS: Fluorescensavbildningsprober märker specifika cytoplasmatiska strukturer så att de kan visualiseras med ett fluorescensmikroskop. - Ta bort det övre skyddsfodret från bilddistansen på den bild som beretts i steg 1.2 och avsätt cirka 7 μl extrakt i mitten av brunnen. Applicera omedelbart FEP-tejpbelagd täckskiva med FEP-sidan vänd mot extraktet för att täta brunnen. Gå snabbt vidare till avbildning (figur 1H,I).
- Ställ bilden på ett inverterat eller upprätt mikroskop med ett motoriserat steg och en digitalkamera. Avbilda extrakten vid önskade rumsliga positioner och tidsintervall i både ljusfälts- och fluorescenskanaler.
OBS: Vanligtvis används ett 5x-mål för avbildning. Det motoriserade steget möjliggör automatiserad bildinsamling vid flera definierade rumsliga positioner. Ljusfältmikroskopi visualiserar cytoplasmatiska strukturer med olika grader av transparens. Fluorescensmikroskopi visualiserar de cytoplasmatiska strukturerna specifikt märkta av fluorescensavbildningssonderna som läggs till i steg 2.14. Kameran registrerar time-lapse-bilder av dessa strukturer och fångar därmed dynamiken i cytoplasmatisk organisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus laevis äggextrakt kan användas för att studera cytoplasmans självorganisation under interfas. Figur 2A visar resultat från ett lyckat experiment. Vi kompletterade interfas-arresterade extrakt med demembranerade Xenopus laevis spermiekärnor 19 i en koncentration av 27 kärnor / μL och 0,38 μM renade GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (fusionsprotein bestående av glutation-S-transferas, grönt fluorescerande protein och en kärnlokaliseringssekvens) för att möjliggöra rekonstitution och visualisering av interfaskärnor. Vi lade också till 1 μM fluorescerande märkt tubulin för att visualisera mikrotubuli och 500 nM MitoTracker Red CMXRos för att visualisera mitokondrier. Ögonblick efter att extraktet placerades i bildkammaren verkade cytoplasman oorganiserad. Under de närmaste 30 minuterna vid rumstemperatur började cytoplasman självorganisera sig i cellliknande fack. Microtubule asters växte från centrosomer som introducerades med spermierna och bildade mikrotubuli-utarmade gränszoner när de möttes med mikrotubuli från angränsande asters. GST-GFP-NLS-protein translokerat till de runda interfaskärnorna självmonterade från de tillsatta demembranerade spermikärnorna. Områden utarmade på ljusspridande cytoplasmatiska komponenter var synliga i både ljusfälts- och mitokondrikanaler (figur 2A, 20 min och 35 min). Mitokondrier blev också utarmade från de gränser som upprättades av mikrotubuli och berikades i isolerade fack som anpassade sig till mikrotubulifack. Vid 60 min vid rumstemperatur bör ett rumsligt mönster bestående av cellliknande fack vara väletablerat, med mikrotubuli som bildar en ihålig kransliknande struktur och mitokondrier tydligt uppdelade i varje fack (figur 2A, 53 min).
Figur 2B jämför extraktprestanda i bildkammare med och utan FEP-tejp på glas. Vi kompletterade interfas-arresterade extrakt med demembranerade Xenopus laevis spermiekärnor19 i en koncentration av 27 kärnor / μL och 0,35 μM GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (fusionsprotein bestående av glutation-S-transferas, mCherry fluorescerande protein och en nukleär lokaliseringssekvens) för att möjliggöra rekonstitution och visualisering av interfaskärnor. Vi lade också till 1 μM fluorescerande märkt tubulin för att visualisera mikrotubuli. Skillnader i dynamik blev uppenbara med cirka 20 minuter vid rumstemperatur. I kammaren gjord med FEP-tejpat glas är extraktet självorganiserat i normala cellliknande mönster (figur 2B, bilder i rad 1 och 3). Men i kammaren där glasytor inte täcktes av FEP-tejpen (opassiverad) visade extraktet onormala ljusfälts- och mikrotubulimönster som blev alltmer störda med tiden (figur 2B, bilder i rad 2 och 4). Inga signifikanta skillnader observerades i kärnimporten av GST-mCherry-NLS-proteinet (figur 2B, bilder i raderna 5 och 6).
Figur 1: Scheman och foton relaterade till experimentproceduren. (A) Schematiskt diagram för beredning av FEP-tejpbelagda glasöverdrag och diabilder. B) Xenopus laevis-ägg som deponerats i äggläggningsbuffert, med exempel på ägg av dålig kvalitet som anges med pilar. Gula pilar, exempel på ägg som ser ut som vita puffiga bollar. Röda pilar, exempel på ägg som visas i en sträng. C) Exempel på Xenopus laevis-ägg med normalt utseende. (D) Exempel på ägg av dålig kvalitet med oregelbundet eller fläckigt pigment. (E) Ett försämrat ägg med en växande vit region. (F) Ett ägg som visar mörkare och kontrakterat pigmenterat område, eventuellt på grund av parthenogenetisk aktivering. (G) De skikt som bildas av spruckna Xenopus laevis-ägg efter 12 000 x g centrifugering i steg 2.11. H) Scheman för beredning av bildkammare för extrakt i steg 2.15. (I) Ett foto av en beredd bildkammare med ett äggextrakt inuti. (C) och (D) delar samma skalstreck längst ner i (D). (E) och (F) delar samma skalstreck längst ner i (F). Skalstrecken i (B) (C) (D) (E) (F) och (I) är ungefärliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Interfas-arresterade äggextrakt självorganiserar sig i cellliknande fack. (A)Time-lapse montage av självorganiserad mönsterbildning i ett tunt lager (120 μm) av interfas-arresterade Xenopus laevis äggextrakt. Extraktet kompletterades med 27 kärnor/μL demembranerade Xenopus laevis spermiekärnor för att möjliggöra rekonstituering av interfaskärnorna. Mikrotubuli visualiserades av HiLyte 647-märkt tubulin (visas i magenta), mitokondrier av MitoTracker Red CMXRos (visas i rött) och kärnor av GST-GFP-NLS (visas i grönt). (B) Självorganiserad mönsterbildning i interfasarresterade Xenopus laevis äggextrakt placerade i kammare med och utan FEP-tejptäckta glasytor. Extrakten kompletterades med 27 kärnor/μl demembranerade Xenopus laevis spermiekärnor för att möjliggöra rekonstituering av interfaskärnorna. Mikrotubuli visualiserades av HiLyte 488-märkt tubulin (visas i magenta) och kärnor av GST-mCherry-NLS (visas i grönt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Valfri sekundär tätning för bildkammaren. Scheman för beredning av en valfri sekundär tätning med mineralolja för att förhindra extraktet från långvarig kontakt med luft. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis äggextrakt har framstått som ett kraftfullt modellsystem för avbildningsbaserade studier av olika subcellulära strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 och cytoplasmatisk organisation i sin helhet cellskala9. Här har vi beskrivit en levande avbildningsmetod som är lämplig för att visualisera dynamisk cytoplasmatisk organisation i 2D. Metodens effektivitet demonstreras av representativa resultat.
Flera steg är avgörande för metodens framgång. Äggkvalitet är viktigt för extrakt, så steg 2.3 och 2.7 är kritiska. Enligt vår erfarenhet har djurhalvklotet av högkvalitativa ägg enhetlig pigmentering, en distinkt vit prick i mitten (vilket indikerar germinal vesikelnedbrytning, GVBD) och en tydlig gräns med den vegetabiliska halvklotet (Figur 1C). Extrakten gjorda av högkvalitativa ägg har bättre prestanda under våra bildförhållanden. Om mer än 5% av äggen har fläckigt pigment (figur 1D), har mörkare och kontrakterat pigmenterat område (figur 1F), ser ut som vita puffiga bollar (figur 1B), visas i en sträng (figur 1B) eller visar tecken på försämring efter tvättarna i steg 2.6 och 2.7 (figur 1E), ska hela äggpartiet kasseras. Extrakten behåller anmärkningsvärd biologisk aktivitet eftersom de i huvudsak är outspädd cytoplasma. Därför är steget som syftar till att minimera utspädningen av extraktet (steg 2.9) viktigt för experimentets framgång. För avbildning hanteras extrakt i mycket små volymer och avdunstar snabbt vid långvarig kontakt med luft. Detta kommer att påverka deras verksamhet negativt. I steg 2.15 måste det därför, efter att extraktet har deponerats, förseglas med FEP-tejpbelagd sida av täckglaset så snart som möjligt. Tätning kan bekräftas visuellt av texturförändringen på kontaktplatsen mellan limet på distansen och täckglaset. Distansen ska kunna skapa en komplett tätning om den appliceras korrekt. Om en extra tätning önskas kan mineralolja emellertid dispenseras mellan täckglasets överhäng och glasskivan. Oljan kan bilda en extra tätning runt distansen genom kapillärverkan (figur 3). Passivering av glasytor kan minska ospecifik adsorption av molekyler, och det är viktigt för interfas mikrotubuli asters i extrakt21,37. Appliceringen av FEP-tejp över en glasyta som beskrivs här verkar erbjuda liknande fördelar, vilket föreslås av monteringen av normala interfasmikrotubuli-astrar (figur 2, 6 min). Därför är steg 1.1 också kritiskt.
Vi demonstrerade tillämpningen av en avbildningsmetod med hjälp av interfas-arresterade äggextrakt enligt protokollet från Deming och Kornbluth19. Som standard kompletterar protokollet extrakten med aktinpolymerisationshämmaren cytochalasin B för att förhindra geleringskontraktion i extrakten efter förlängd inkubation vid rumstemperatur26. För att tillåta aktinpolymerisation och observera aktindynamik kan man utelämna cytochalasin B i steg 2.10 i protokollet9. En modifiering vi har gjort i Deming och Kornbluth-protokollet är att vi inte kompletterar extrakt med en energimix för att regenerera ATP19. Detta beror på att i våra händer, i extrakt kompletterade med denna ATP-regenererande blandning19 och spermier, bildar mikrotubuli ibland ett tvärbundet gitter som stör cytoplasmatisk mönsterbildning. Därför innehåller protokollet inte det steg som lägger till energimixen till extrakten19.
Interfasextraktprotokollet förlitar sig på att krossa ägg i EGTA-fri buffert för att frigöra dem från meiotisk arrestering (CSF-arrestering)37. Extrakten utvecklas därefter till interfas och hålls i interfas av cykloheximid. Det finns andra etablerade metoder för beredning av interfasextrakt. Vissa metoder förbereder först extrakt som upprätthåller meiotisk arrestering genom att krossa ägg i lysbuffert med EGTA38, och sedan släppa arresteringen genom att tillsätta kalcium, vilket driver extraktet till interfas 21,37,39. Extrakten kan därefter hållas i interfas genom tillsats av proteinsynteshämmare såsom cykloheximid37,39. Andra metoder aktiverar parthenogenetiskt ägg med kalciumjonofor (A23187) eller elektriska stötar för att frigöra dem från meiotisk arrestering, innan äggen krossas i frånvaro av EGTA20,28 (granskad i Field et al.37). Dessa extrakt kan gå in i interfas men kommer vanligtvis inte att stanna där eftersom de kan genomgå flera cellcykler. På samma sätt har väletablerade metoder optimerade för beredning av extrakt med intakt aktincytoskelett utvecklats 10,37,39. Avbildningsmetoden kan vara lämplig för dessa typer av extrakt, men vi har inte testat den med dem.
För att avbilda cytoplasmans interna organisation är det bildsystem som presenteras här relativt enkelt att installera, vilket endast kräver att man applicerar ett FEP-tejp på glasytor. Det möjliggör montering av cytoskelettstrukturer i extrakt9 rapporterade i mer sofistikerade bildsystem där glasytor passiveras med poly-L-lysin-g-polyetylenglykol (PLL-g-PEG) behandling eller belagda med stödda lipid-dubbelskikt10,21. Metoden gör det möjligt för extraktskiktet att bildas med en definierad tjocklek (bestämd av distansens djup, vilket är 120 μm för systemet som visas i figur 1A, 1H, 1I och figur 2). Vi kan justera tjockleken genom att stapla ytterligare distanser. Vi har staplat upp till 6 sådana distanser (720 μm tjocka) och facken bildades normalt. Denna flexibilitet möjliggör framtida tillämpningar som avbildning av extrakten i 3D med konfokal mikroskopi eller ljusarkmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar J. Kamenz, Y. Chen och W. Y. C. Huang för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 och R35 GM131792) som tilldelades James E. Ferrell, Jr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W.
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
