Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

Published: June 6, 2021 doi: 10.3791/61923
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

Summary

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

Abstract

תמציות הביצים של Xenopus laevis , המשמשות באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת, התגלו ככלי רב עוצמה המבוסס על הדמיה לחקר תופעות ציטופלסמיות, כגון ציטוקינזיס, היווצרות צירים מיטוטיים והרכבת הגרעין. בהתבסס על שיטות מוקדמות שדיימו תמציות קבועות שנדגמו בנקודות זמן דלילות, גישות אחרונות לתמציות חיות של תמונות באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן, וחושפות תכונות דינמיות יותר עם רזולוציה טמפורלית משופרת. שיטות אלה דורשות בדרך כלל טיפולי שטח מתוחכמים של כלי ההדמיה. כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיה חיה של תמציות ביצים שאינן דורשות טיפול כימי בפני השטח. הוא פשוט ליישום ומשתמש בחומרים מתכלים מעבדתיים בייצור המוני להדמיה. אנו מתארים מערכת שיכולה לשמש הן למיקרוסקופיה רחבת שדה והן למיקרוסקופיה קונפוקלית. הוא מיועד להדמיית תמציות בשדה דו-ממדי (דו-ממדי), אך ניתן להרחיבו בקלות להדמיה בתלת-ממד. הוא מתאים היטב לחקר היווצרות תבניות מרחביות בתוך הציטופלסמה. בעזרת נתונים מייצגים, אנו מדגימים את הארגון הדינמי הטיפוסי של מיקרוטובולים, גרעינים ומיטוכונדריה בתמציות אינטרפאזה שהוכנו בשיטה זו. נתוני תמונה אלה יכולים לספק מידע כמותי על דינמיקה ציטופלסמית וארגון מרחבי.

Introduction

הציטופלסמה מהווה את הנפח העיקרי של התא ויש לה ארגון מובחן. המרכיבים של הציטופלסמה האאוקריוטית יכולים להרכיב את עצמם למגוון רחב של מבנים מרחביים, כגון אסטרים מיקרוטובולים ומנגנון גולג'י, אשר בתורם מסודרים באופן דינמי ומתהפכים בהתאם לזהות התא ולמצבו הפיזיולוגי. הבנת הארגון המרחבי של הציטופלסמה והקשר שלה לתפקודים תאיים חשובה אפוא להבנת אופן הפעולה של התא. תמציות ביצים של Xenopus laevis שימשו באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת 1,2,3,4,5,6,7,8, אך עבודה אחרונה מבססת אותן כמערכת הדמיה חיה רבת עוצמה למחקרים מכניסטיים של מבנים ציטופלסמיים ותפקודם התאי 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. תמציות לא מדוללות אלה משמרות מבנים ותפקודים רבים של הציטופלסמה, תוך שהן מאפשרות מניפולציות ישירות של תוכן ציטופלסמי שאינו ניתן להשגה במודלים קונבנציונליים מבוססי תאים19,20. זה הופך אותם לאידיאליים לאפיון תופעות ציטופלסמיות ולניתוח היסודות המכניסטיים שלהם.

שיטות קיימות להדמיה של תמציות דורשות שינויים כימיים בפני השטח, או ייצור של התקנים מיקרופלואידיים. שיטה אחת המבוססת על כיסוי דורשת פסיבציה של פוליאתילן גליקול (PEG) של כיסויי זכוכית21. שיטה מבוססת מיקרו-אמולסיה דורשת תצהיר אדים של טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן על משטחי זכוכית22,23. מערכות מבוססות מיקרופלואידיקה מאפשרות שליטה מדויקת בנפח, בגיאומטריה ובהרכב של טיפות החילוץ, אך דורשות מתקני מיקרו-פבריקציה מיוחדים11,12,24.

כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיית תמציות ביצים קלה ליישום ומשתמשת בחומרים זמינים ובעלות נמוכה. זה כולל הכנת תא הדמיה עם שקופית וכיסוי מצופה בסרט אתילן פרופילן פלואוריד (FEP). התא יכול לשמש להדמיית תמציות עם מגוון מערכות מיקרוסקופיה, כולל סטריאוסקופים ומיקרוסקופים זקופים והפוכים. שיטה זו אינה דורשת טיפול כימי במשטחים תוך השגת בהירות אופטית דומה המתקבלת בשיטות קיימות מבוססות זכוכית שנדונו לעיל. הוא נועד לדמות שכבה של תמציות בעובי אחיד על פני שדה דו-ממדי, וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לדמות נפח תלת-ממדי של תמציות. הוא מתאים היטב להדמיה בהילוך מהיר של התנהגות ציטופלסמית קולקטיבית על פני שדה ראייה גדול.

השתמשנו בתמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה כדי להדגים את שיטת ההדמיה שלנו. הכנת התמצית עוקבת אחר הפרוטוקול של דמינג וקורנבלות'19. בקצרה, ביצים שנעצרו באופן טבעי במטאפאזה של מיוזה II נמעכות על ידי ספין במהירות נמוכה. ספין זה משחרר את הציטופלסמה ממעצר מיוטי ומאפשר לתמצית להמשיך לאינטרפאזה. בדרך כלל, ציטוכלזין B מתווסף לפני ספין הריסוק כדי לעכב היווצרות F-אקטין. עם זאת, ניתן להשמיט אותו אם רוצים F-actin. ציקלוהקסימיד מתווסף גם לפני ספין הריסוק כדי למנוע מתמצית האינטרפאזה להיכנס למיטוזה הבאה. התמציות ממוקמות לאחר מכן בתאי ההדמיה הנ"ל ומונחות על מיקרוסקופ. לבסוף, תמונות מתועדות לאורך זמן במרווחי זמן מוגדרים על ידי מצלמה המחוברת למיקרוסקופ, ומייצרות סדרות תמונות בהילוך מהיר הלוכדות את ההתנהגות הדינמית של התמצית בשדה דו-ממדי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת סטנפורד.

1. הכנת שקופיות וכיסויים

  1. החל שכבה של סרט דבק אתילן פרופילן פלואוריד (FEP) על מגלשת זכוכית עם אפליקטור רולר. חותכים סרט הדבקה מוגזם על הקצוות בעזרת סכין גילוח נקי. הכינו כיסויים מצופים בנייר דבק FEP באותו אופן (איור 1A).
  2. החל מרווח הדמיה דביק דו-צדדי על הצד המצופה בסרט FEP של השקופית. השאירו את תוחם המגן בחלק העליון ללא כיסוי (איור 1A).
    הערה: יש להכין את השקופיות והכיסויים לפני הניסוי. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן אותם בקופסאות כדי למנוע הצטברות אבק על משטחים. עומק הבאר במרווח ההדמיה הוא 120 מיקרומטר וקוטרה 9 מ"מ.

2. הכנה והדמיה חיה של תמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה

הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מדמינג וקורנבלות'19, מאריי20, סמיית' וניופורט25 עם שינויים. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת.

  1. שלושה עד עשרה ימים לפני איסוף הביצים, יש להזריק נקבות בוגרות של צפרדעי Xenopus laevis באופן תת-עורי לתוך שק הלימפה הגבי עם 100 יחב"ל של גונדוטרופין בסוסה הרה (PMSG).
  2. שש עשרה עד שמונה עשרה שעות לפני איסוף הביצים המתוכנן, הזריקו לצפרדעים משלב 2.1 500 יחב"ל של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). השאירו צפרדעים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס במאגר הטלת ביצים (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2·2H2 O, 0.5 mMHEPES, 0.1 mM EDTA, הכינו כפתרון מלאי 20x ב- pH7.4 ודללו עם מי מיכל צפרדע נקיים עד פי 1 לפני השימוש) עד לאיסוף הביצים.
  3. ביום הניסוי, אספו ביצים בצלחת פטרי זכוכית גדולה ובדקו את איכות הביצים. השליכו את כל הביצים שנראות כמו כדורים לבנים נפוחים או מופיעות בחוט (איור 1B). בחנו את הביצים תחת סטריאוסקופ, שמרו על הביצים בעלות מראה תקין (איור 1C), והשליכו אותן עם פיגמנט לא סדיר או מנומר (איור 1D).
    הערה: פרוטוקול זה עובד עם ביצים שנאספו מצפרדע בודדת, אשר בדרך כלל מטילה 25 מ"ל של ביצים על ידי 16 שעות לאחר הזרקת hCG. בדרך כלל, סך של 3 עד 6 צפרדעים מושרות על ידי hCG, ואת הצפרדע עם איכות הביצים הגבוהה ביותר נבחר לניסוי הכנת תמצית.
  4. מעבירים ביצים לכוס זכוכית של 400 מ"ל, ומסירים כמה שיותר חיץ מטיל ביצים על ידי פירוק.
  5. לדגום את הביצים ב-100 מ"ל של תמיסת דג'ל טרייה (2% עם L-ציסטאין במים, להסתגל ל-pH 8.0 עם NaOH) ולסובב אותן בעדינות מעת לעת. לאחר כ-3 דקות, יוצקים את התמיסה, ומוסיפים 100 מ"ל של תמיסת דג'לי טרייה. ממשיכים את הדגירה עד שהביצים ארוזות היטב (אין רווח בין הביצים), אך הימנעו מהשארת ביצים בתמיסת הפסולת למשך יותר מ-5 דקות בסך הכל.
  6. הסר כמה שיותר מתמיסת ההרגעה על ידי פירוק, ושטוף את הביצים בחיץ MMR 0.25x (25 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.25 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl2, 0.025 mM EDTA, 1.25 mM HEPES, מוכן כתמיסת מלאי 10x, מותאם ל- pH 7.8 עם NaOH, ומדולל במי Milli-Q לפני השימוש) על ידי הוספת המאגר, מערבלים את הביצים, ואז שופכים את החיץ. חזרו על הפעולה מספר פעמים עד לשימוש כולל של 1 ליטר מהמאגר לשטיפה.
  7. שטפו את הביצים מספר פעמים עם סך של 400 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים (250 מ"מ סוכרוז, 10 מ"ל HEPES, 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl2, 1 mM DTT, עשוי טרי ומותאם ל- pH 7.7 עם KOH). הסר ביצים עם מראה חריג באמצעות פיפטה פסטר בין השטיפות.
    הערה: ביצים עם מראה לא תקין מתייחסות לאלה שנראות כמו כדורים נפוחים לבנים (איור 1B), שיש להן פיגמנטציה מנומרת (איור 1D), מתדרדרות עם אזור לבן שגדל (איור 1E), או מראות אזור פיגמנטי כהה ומכווץ בחצי הכדור של בעלי החיים (איור 1F).
  8. באמצעות פיפטה העברה עם קצה פתוח לרווחה, מעבירים את הביצים לצינור צנטריפוגה עגול-תחתון 17 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים. סובבו את הצינור בצנטריפוגה קלינית בגודל 400 x גרם למשך 15 שניות כדי לארוז את הביצים.
  9. הסירו כמה שיותר ממאגר התסיסה של הביצים מהחלק העליון של ביצים ארוזות בעזרת פיפטה של פסטר.
    הערה: חשוב להסיר כמה שיותר חיץ מהביצים הארוזות, על מנת למזער את דילול תמצית הביצית. לפעמים יש צורך להסיר כמה ביצים רופפות יחד עם החיץ השיורי כדי להשיג זאת.
  10. קבעו את הנפח המשוער של הביצים הארוזות, ולאחר מכן הוסיפו 5 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל לאופטין, 5 מיקרוגרם/מ"ל ציטוכלזין B ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד ישירות על גבי הביצים הארוזה.
    הערה: אפרוטינין ולאופפטין הם מעכבי פרוטאז. ציטוכלזין B מעכב פולימריזציה של אקטין, ומונע מהתמצית להתכווץ ולג'ל26. ציקלוהקסימיד מעכב סינתזת חלבונים, ובכך שומר על התמצית באינטרפאזה של מחזור התא.
  11. מרסקים את הביצים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב 12,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות, ברוטור דלי מתנדנד.
    הערה: בסוף הצנטריפוגה, הביצים היו צריכות להיקרע והליזאט הופרד לשלוש שכבות עיקריות: שכבת שומנים צהובה למעלה, תמצית ציטופלסמית (הנקראת גם תמצית גולמית) באמצע, ושכבה צפופה כהה המכילה את גרגירי הפיגמנט בתחתית (איור 1G).
  12. חברו מחט באורך 18 מ"מ למזרק. כאשר שיקוע קצה המחט פונה כלפי מעלה, לנקב את הצינור מהצד בתחתית השכבה הציטופלסמית, ולשחזר את התמצית על ידי ציור לאט.
    הערה: יש לשאוב את התמצית הציטופלסמית באיטיות כדי למנוע הכללה של תוכן מזהם משכבת השומנים הצהובה.
  13. העבירו את התמצית הציטופלסמית המשוחזרת לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והחזיקו אותה על קרח. השתמש בתמצית תוך שעה.
  14. כשאתם מוכנים לתמונה, השלימו את התמצית עם הריאגנטים הרצויים ובדיקות הדמיה פלואורסצנטיות.
    הערה: בדיקות הדמיה פלואורסצנטיות מסמנות מבנים ציטופלסמיים ספציפיים כך שניתן לדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  15. הסר את תוחם המגן העליון ממרווח ההדמיה בשקופית שהוכנה בשלב 1.2, והפקיד כ -7 μL של תמצית במרכז הבאר. יש למרוח מיד את הכיסוי המצופה בנייר דבק של FEP כאשר צד ה-FEP פונה לתמצית כדי לאטום את הבאר. המשיכו במהירות להדמיה (איור 1H,I).
  16. הנח את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך או זקוף עם במה ממונעת ומצלמה דיגיטלית. צלמו את החלציות במיקומים המרחביים ובמרווחי הזמן הרצויים, הן בערוצי השדה הבהיר והן בערוצים הפלואורסצנטיים.
    הערה: בדרך כלל, מטרה פי 5 משמשת להדמיה. השלב הממונע מאפשר קליטת תמונה אוטומטית במספר מיקומים מרחביים מוגדרים. מיקרוסקופיית שדה בהיר מדמיינת מבנים ציטופלסמיים עם דרגות שונות של שקיפות. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ממחישה את המבנים הציטופלסמיים שסומנו במיוחד על ידי בדיקות ההדמיה הפלואורסצנטיות שנוספו בשלב 2.14. המצלמה מתעדת תמונות בהילוך מהיר של מבנים אלה, ובכך לוכדת את הדינמיקה של הארגון הציטופלסמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להשתמש בתמציות ביצים של Xenopus laevis כדי לחקור את הארגון העצמי של הציטופלסמה במהלך interphase. איור 2A מראה תוצאות מניסוי מוצלח. הוספנו תמציות אינטרפאזה עם גרעיני זרע 19 שעברו דה-ממברן של Xenopus laevis בריכוז של 27 גרעינים/μL ו-GST-GFP-NLS מטוהרים בנפח של 0.38 מיקרומטר בריכוז של 27,28,29,30 (חלבון היתוך המורכב מגלוטתיון-S-טרנספראז, חלבון פלואורסצנטי ירוק ורצף לוקליזציה גרעיני) כדי לאפשר שחזור והדמיהשל גרעינים בין-פאזיים. הוספנו גם טובולין אחד עם תווית פלואורסצנטית כדי להמחיש מיקרוטובולים, ו-500 ננומטר MitoTracker Red CMXRos כדי להמחיש את המיטוכונדריה. רגעים לאחר שהתמצית הונחה בתא ההדמיה, הציטופלסמה נראתה לא מאורגנת. במהלך 30 הדקות הבאות בטמפרטורת החדר, הציטופלסמה החלה להתארגן בעצמה לתאים דמויי תאים. אסטרים של מיקרוטובולים גדלו מצנטרוזומים שהוכנסו עם גרעיני הזרע, ויצרו אזורי גבול מדולדלים במיקרוטובולים כאשר נפגשו עם מיקרוטובולים מאסטרה שכנה. חלבון GST-GFP-NLS שעבר טרנסלוקציה לגרעינים הבין-פאזיים העגולים המורכבים בעצמם מגרעיני הזרע הנוספים שעברו דה-ממברן. אזורים שהתרוקנו מרכיבים ציטופלסמיים המפוזרים באור נראו גם בתעלות שדה בהיר וגם בתעלות מיטוכונדריה (איור 2A, 20 דקות ו-35 דקות). המיטוכונדריה גם התרוקנה מהגבולות שנקבעו על ידי מיקרוטובולים, והתעשרה בתאים מבודדים שהתיישרו עם תאי מיקרוטובולים. עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, תבנית מרחבית המורכבת מתאים דמויי תאים צריכה להיות מבוססת היטב, כאשר מיקרוטובולים יוצרים מבנה חלול דמוי זר, והמיטוכונדריה מחולקת בבירור לכל תא (איור 2A, 53 דקות).

איור 2B משווה את ביצועי החילוץ בתאי הדמיה עם ובלי קלטות FEP על זכוכית. הוספנו תמציות אינטרפאזה עם גרעיני זרע 19 שעברו דה-ממברן של Xenopus laevis בריכוז של 27 גרעינים/μL ו-0.35 מיקרומטר GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (חלבון היתוך המורכב מגלוטתיון-S-טרנספראז, חלבון פלואורסצנטי mCherry ורצף לוקליזציה גרעינית) כדי לאפשר שחזור והדמיה של גרעינים בין-פאזיים. הוספנו גם טובולין עם תווית פלואורסצנטית של 1 μM כדי להמחיש מיקרוטובולים. ההבדלים בדינמיקה התבררו בכ-20 דקות בטמפרטורת החדר. בתא העשוי מזכוכית מודבקת FEP, התמצית מאורגנת בעצמה בתבניות רגילות דמויות תאים (איור 2B, תמונות בשורות 1 ו-3). עם זאת, בתא שבו משטחי זכוכית לא כוסו על-ידי סרט FEP (unpassivated), התמצית הראתה תבניות חריגות של שדה בהיר ומיקרוטובולים שהשתבשו יותר ויותר עם הזמן (איור 2B, תמונות בשורות 2 ו-4). לא נצפו הבדלים משמעותיים ביבוא גרעיני של חלבון GST-mCherry-NLS (איור 2B, תמונות בשורות 5 ו-6).

Figure 1
איור 1: סכמות ותמונות הקשורות להליך הניסוי. (A) דיאגרמה סכמטית להכנת כיסויי זכוכית מצופים סרט FEP ושקופיות. (B) ביצי Xenopus laevis שהופקדו במאגר הטלת ביצים, עם דוגמאות לביצים באיכות ירודה המסומנות על ידי חצים. חצים צהובים, דוגמאות לביצים שנראות כמו כדורים נפוחים לבנים. חצים אדומים, דוגמאות לביצים המופיעות במחרוזת. (C) דוגמאות לביצי קסנופוס לאוויס בעלות מראה תקין. (D) דוגמאות לביצים באיכות ירודה עם פיגמנט לא סדיר או מנומר. (E) ביצה מתדרדרת עם אזור לבן גדל. (F) ביצית שמראה אזור פיגמנטי כהה ומכווץ, אולי כתוצאה מהפעלה פרתנוגנטית. (G) השכבות שנוצרו על ידי ביצי Xenopus laevis שנקרעו לאחר צנטריפוגה של 12,000 x גרם בשלב 2.11. (H) סכמות להכנת תא הדמיה של מחלץ בשלב 2.15. (I) תמונה של תא הדמיה מוכן עם תמצית ביצים בתוכו. (C) ו- (D) חולקים את אותו סרגל קנה מידה בתחתית (D). (E) ו- (F) חולקים את אותו סרגל קנה מידה בתחתית (F). סרגלי קנה המידה ב- (B) (C) (D) (E) (F) ו- (I) הם משוערים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמציות ביצים שנעצרו על-ידי אינטרפאזה מתארגנות באופן עצמי בתאים דמויי תאים . (A) מונטאז' של קיטועי זמן של היווצרות תבנית מאורגנת עצמית בשכבה דקה (120 מיקרומטר) של תמצית ביצת Xenopus laevis שנעצרה על ידי אינטרפאזה. התמצית נוספה עם 27 גרעינים/μL של גרעיני זרע Xenopus laevis שעברו דה-מברן כדי לאפשר בנייה מחדש של גרעיני האינטרפאזה. מיקרוטובולים הודגמו על ידי טובולין בעל תווית HiLyte 647 (מוצג במגנטה), מיטוכונדריה על ידי MitoTracker אדום CMXRos (מוצג באדום), וגרעינים על ידי GST-GFP-NLS (מוצג בירוק). (B) יצירת תבניות מאורגנות בעצמן בתמציות ביצי Xenopus laevis שנעצרו על ידי אינטרפאזה המונחות בתאים עם ובלי משטחי זכוכית מכוסים בנייר דבק FEP. התמציות נוספו עם 27 גרעינים/μL של גרעיני זרע Xenopus laevis שעברו דה-ממברן כדי לאפשר בנייה מחדש של גרעיני האינטרפאזה. מיקרוטובולים הודגמו על ידי טובולין בעל תווית HiLyte 488 (מוצג במגנטה) וגרעינים על ידי GST-mCherry-NLS (מוצגים בירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אטימה משנית אופציונלית עבור תא ההדמיה. סכמות להכנת חותם משני אופציונלי עם שמן מינרלי כדי למנוע מהתמצית מגע ממושך עם האוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תמציות הביצים של Xenopus laevis התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקרים מבוססי הדמיה של מבנים תת-תאיים שונים 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 וארגון ציטופלסמי בכללותו סולם תאים9. כאן תיארנו שיטת הדמיה חיה המתאימה להדמיה של ארגון ציטופלסמי דינמי בדו-ממד. האפקטיביות של השיטה מודגמת על ידי תוצאות מייצגות.

מספר שלבים הם קריטיים להצלחת השיטה. איכות הביצים חשובה לתמציות, ולכן שלבים 2.3 ו-2.7 הם קריטיים. מניסיוננו, להמיספרה החייתית של ביצים איכותיות יש פיגמנטציה אחידה, נקודה לבנה מובהקת במרכז (מעידה על פירוק שלפוחית נבטית, GVBD), וגבול ברור עם חצי הכדור הצמחי (איור 1C). לתמציות העשויות מביצים איכותיות יש ביצועים טובים יותר בתנאי ההדמיה שלנו. אם ליותר מ-5% מהביצים יש פיגמנט מנומר (איור 1D), שהן הכהו והתכווצו באזור הפיגמנט (איור 1F), נראות כמו כדורים נפוחים לבנים (איור 1B), מופיעות בחוט (איור 1B), או מראות סימני הידרדרות לאחר השטיפה בשלבים 2.6 ו-2.7 (איור 1E), יש להשליך את כל קבוצת הביצים. התמציות שומרות על פעילות ביולוגית יוצאת דופן מכיוון שהן למעשה ציטופלסמה לא מדוללת. לכן, השלב שמטרתו למזער את דילול התמצית (שלב 2.9) חשוב להצלחת הניסוי. לצורך הדמיה, התמציות מטופלות בכמויות קטנות מאוד, והן יתאדו במהירות אם הן במגע ממושך עם האוויר. זה ישפיע לרעה על הפעילות שלהם. לכן, בשלב 2.15, לאחר הפקדת התמצית, יש לאטום אותה עם הצד המצופה בנייר דבק FEP של הכיסוי בהקדם האפשרי. ניתן לאשר את האיטום באופן חזותי על ידי שינוי המרקם באתר המגע בין הדבק על המרווח לבין הכיסוי. המרווח אמור להיות מסוגל ליצור אטימה מלאה אם הוא מיושם כראוי. עם זאת, אם רוצים אטימה נוספת, ניתן לחלק שמן מינרלי בין המכסה לבין מגלשת הזכוכית. השמן יכול ליצור אטימה נוספת סביב הספייסר על ידי פעולה נימית (איור 3). פסיבציה של משטחי זכוכית יכולה להפחית ספיחה לא ספציפית של מולקולות, והיא חשובה למיקרוטובול אסטרים אינטרפאזה בתמציות21,37. נראה כי היישום של סרט FEP על משטח זכוכית המתואר כאן מציע יתרונות דומים, כפי שהוצע על ידי הרכבה של אסטרים מיקרוטובולים אינטרפאזה רגילים (איור 2, 6 דקות). לכן, שלב 1.1 הוא גם קריטי.

הדגמנו את היישום של שיטת הדמיה באמצעות תמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה בהתאם לפרוטוקול של דמינג וקורנבלות'19. כברירת מחדל, הפרוטוקול משלים את התמציות עם מעכב הפולימריזציה אקטין ציטוכלזין B כדי למנוע התכווצות ג'לציה בתמציות לאחר דגירה ממושכת בטמפרטורת החדר26. כדי לאפשר פילמור אקטין ולבחון את הדינמיקה של אקטין, ניתן להשאיר את הציטוכלסין B בשלב 2.10 של הפרוטוקול9. שינוי שעשינו בפרוטוקול דמינג וקורנבלות' הוא שאנחנו לא משלימים תמציות עם תערובת אנרגיה כדי לחדש את ATP19. הסיבה לכך היא שבידיים שלנו, בתמציות בתוספת תערובת התחדשות ATPזו 19 וגרעיני זרע, מיקרוטובולים יוצרים מדי פעם סריג מוצלב שמפריע להיווצרות תבנית ציטופלסמית. לכן, הפרוטוקול אינו כולל את השלב המוסיף את תערובת האנרגיה לתמציות19.

פרוטוקול התמצית הבין-פאזית מסתמך על ריסוק ביצים במאגר נטול EGTA כדי לשחרר אותן ממעצר מיוטי (CSF-arrest)37. התמציות מתקדמות לאחר מכן לאינטרפאזה, ונשמרות באינטרפאזה על ידי ציקלוהקסימיד. ישנן שיטות מבוססות אחרות להכנת תמציות interphase. חלק מהשיטות מכינות תחילה תמציות השומרות על מעצר מיוטי על ידי ריסוק ביצים בחיץ תזה עם EGTA38, ולאחר מכן משחררות את המעצר על ידי הוספת סידן, מה שמניע את התמצית לתוך interphase 21,37,39. התמציות יכולות להיות מוחזקות לאחר מכן באינטרפאזה על ידי תוספת של מעכבי סינתזת חלבונים כגון cycloheximide37,39. שיטות אחרות מפעילות באופן פרתנוגנטי ביצים עם סידן יונופור (A23187) או הלם חשמלי כדי לשחרר אותן ממעצר מיוטי, לפני ריסוק הביצים בהיעדר EGTA20,28 (נבדק ב- Field et al.37). תמציות אלה יכולות להיכנס לאינטרפאזה אך בדרך כלל לא יישארו שם מכיוון שהן מסוגלות לעבור מחזורי תאים מרובים. כמו כן, פותחו שיטות מבוססות היטב המותאמות להכנת תמציות עם שלד אקטין שלם 10,37,39. שיטת ההדמיה עשויה להתאים לסוגים אלה של תמציות, אך לא בדקנו אותה באמצעותן.

לצורך הדמיית הארגון הפנימי של הציטופלסמה, מערכת ההדמיה המוצגת כאן קלה יחסית להתקנה, ודורשת רק מריחת סרט FEP על משטחי זכוכית. הוא מאפשר הרכבה של מבנים ציטוסקטליים בתמציות9 המדווחות במערכות הדמיה מתוחכמות יותר שבהן משטחי זכוכית עוברים טיפול בפולי-L-ליזין-g-פוליאתילן גליקול (PLL-g-PEG) או מצופים בדו-שכבתי שומנים נתמכים10,21. השיטה מאפשרת לשכבת החילוץ להיווצר בעובי מוגדר (שנקבע על ידי עומק המרווח, שהוא 120 מיקרומטר עבור המערכת המוצגת באיור 1A, 1H, 1I ואיור 2). אנו יכולים להתאים את העובי על ידי ערימת מרווחים נוספים. ערמנו עד 6 ספייסרים כאלה (בעובי 720 מיקרומטר) והתאים נוצרו כרגיל. גמישות זו מאפשרת יישומים עתידיים כגון הדמיה של התמציות בתלת-ממד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או יריעות אור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לג'יי קמנץ, י' צ'ן וו' י' סי הואנג על הערותיהם על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM110564, P50 GM107615 ו- R35 GM131792) שהוענקו לג'יימס א. פרל הבן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17 ml centrifuge tube Beckman Coulter 337986
22x22 mm square #1 cover glass Corning 284522
Aprotinin MilliporeSigma 10236624001 Protease inhibitor
Cycloheximide MilliporeSigma 01810 Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B MilliporeSigma C6762 Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs Nasco LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL488M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL670M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape CS Hyde company 23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG) MilliporeSigma CG10
Imaging spacer Electron Microscopy Sciences 70327-8S
Leupeptin MilliporeSigma 11017101001 Protease inhibitor
Microscope slides Fisher Scientific 12-518-100B
Mineral oil MilliporeSigma 330760
MitoTracker Red CMXRos Thermo Fisher Scientific M7512 For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) BioVendor RP1782725000
Roller applicator Amazon B07HMBJSP8 For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640 For removing excessive FEP tape
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-7M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 172 Xenopus laevis תמצית ביצים היווצרות דפוסים ארגון עצמי הדמיה חיה מערכות ללא תאים ביולוגיה של התא ביוכימיה ביולוגיה התפתחותית
<em>קסנופוס לאוויס</em> הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, X., Ferrell, Jr., J. E.… More

Cheng, X., Ferrell, Jr., J. E. Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization. J. Vis. Exp. (172), e61923, doi:10.3791/61923 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter