Summary
Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için bir yöntem tanımladık.
Abstract
Geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılan Xenopus laevis yumurta ekstraktları, sitokinezi, mitotik iğ oluşumu ve çekirdeğin montajı gibi sitoplazmik fenomenleri incelemek için güçlü bir görüntüleme tabanlı araç olarak ortaya çıkmıştır. Seyrek zaman noktalarında örneklenen sabit ekstraktları görüntüleyen erken yöntemlere dayanarak, son yaklaşımlar hızlandırılmış mikroskopi kullanarak canlı ekstraktları görüntüleyerek gelişmiş zamansal çözünürlükle daha dinamik özellikler ortaya çıkarır. Bu yöntemler genellikle görüntüleme kabının sofistike yüzey işlemlerini gerektirir. Burada, kimyasal yüzey işlemi gerektirmeyen yumurta ekstraktlarının canlı görüntülenmesi için alternatif bir yöntem sunuyoruz. Uygulanması kolaydır ve görüntüleme için seri üretilen laboratuvar sarf malzemelerini kullanır. Hem geniş alan hem de konfokal mikroskopi için kullanılabilecek bir sistemi tanımlıyoruz. 2 boyutlu (2D) bir alanda ekstraktları görüntülemek için tasarlanmıştır, ancak 3D'de görüntülemeye kolayca genişletilebilir. Sitoplazma içindeki mekansal desen oluşumunu incelemek için çok uygundur. Temsili verilerle, bu yöntem kullanılarak hazırlanan interfaz ekstraktlarında mikrotübüllerin, çekirdeklerin ve mitokondrilerin tipik dinamik organizasyonunu gösteriyoruz. Bu görüntü verileri, sitoplazmik dinamikler ve mekansal organizasyon hakkında nicel bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Sitoplazma, bir hücrenin ana hacmini oluşturur ve ayrı bir organizasyona sahiptir. Ökaryotik sitoplazmanın bileşenleri, mikrotübül asterleri ve Golgi aparatı gibi çok çeşitli mekansal yapılara kendiliğinden toplanabilir ve bunlar da hücrenin kimliğine ve fizyolojik durumuna bağlı olarak dinamik olarak düzenlenir ve döndürülür. Sitoplazmanın mekansal organizasyonunu ve hücresel fonksiyonlara olan bağlantısını anlamak, hücrenin nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir. Xenopus laevis yumurta ekstraktları geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8, ancak son çalışmalar onları sitoplazmik yapıların mekanik çalışmaları ve hücresel fonksiyonları için güçlü bir canlı görüntüleme sistemi olarak kurmaktadır 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Bu seyreltilmemiş ekstraktlar, sitoplazmanın birçok yapısını ve fonksiyonunu korurken, geleneksel hücre bazlı modellerde elde edilemeyen sitoplazmik içeriğin doğrudan manipülasyonlarına izin verir19,20. Bu, onları sitoplazmik fenomenleri karakterize etmek ve mekanik temellerini incelemek için ideal kılar.
Ekstraktları görüntülemek için mevcut yöntemler, kimyasal yüzey modifikasyonları veya mikroakışkan cihazların üretilmesini gerektirir. Bir coverslip bazlı yöntem, cam kapakların polietilen glikol (PEG) pasivasyonunu gerektirir21. Mikroemülsiyon bazlı bir yöntem, trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silanın cam yüzeylerde buhar birikimini gerektirir22,23. Mikroakışkan tabanlı sistemler, ekstrakt damlacıklarının hacminin, geometrisinin ve bileşiminin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar, ancak özel mikrofabrikasyon tesisleri gerektirir11,12,24.
Burada, yumurta ekstraktlarını görüntülemek için uygulaması kolay ve kolayca temin edilebilen, düşük maliyetli malzemeler kullanan alternatif bir yöntem sunuyoruz. Bu, bir slayt ve florlu etilen propilen (FEP) bant ile kaplanmış bir kapak kapağı ile bir görüntüleme odasının hazırlanmasını içerir. Oda, stereoskoplar ve dik ve ters mikroskoplar dahil olmak üzere çeşitli mikroskopi sistemleriyle ekstraktları görüntülemek için kullanılabilir. Bu yöntem, yukarıda tartışılan mevcut cam bazlı yöntemlerle elde edilen benzer optik netliği elde ederken yüzeylerin kimyasal olarak işlenmesini gerektirmez. Bir 2B alan boyunca eşit kalınlığa sahip bir ekstrakt katmanını görüntülemek için tasarlanmıştır ve 3B ekstrakt hacmini görüntülemek için kolayca genişletilebilir. Geniş bir görüş alanı üzerinde kolektif sitoplazmik davranışın hızlandırılmış görüntülenmesi için çok uygundur.
Görüntüleme yöntemimizi göstermek için interfaz tutuklamalı yumurta ekstraktları kullandık. Ekstrakt preparatı, Deming ve Kornbluth19 protokolünü takip eder. Kısacası, mayoz II'nin metafazında doğal olarak tutuklanan yumurtalar, düşük hızlı bir spin ile ezilir. Bu spin, sitoplazmayı mayotik arrestten serbest bırakır ve ekstraktın interfaza geçmesine izin verir. Normalde, F-aktin oluşumunu inhibe etmek için ezme spininden önce sitokalasin B eklenir. Bununla birlikte, F-aktin isteniyorsa atlanabilir. Sikloheksimid, interfaz ekstraktının bir sonraki mitoza girmesini önlemek için ezme spininden önce de eklenir. Ekstraktlar daha sonra yukarıda belirtilen görüntüleme odalarına yerleştirilir ve mikroskop üzerine yerleştirilir. Son olarak, görüntüler mikroskopa bağlı bir kamera tarafından belirli aralıklarla zaman içinde kaydedilir ve 2D alanda ekstraktın dinamik davranışını yakalayan hızlandırılmış görüntü serileri üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Slaytların ve kapak fişlerinin hazırlanması
- Bir rulo aplikatörlü cam slayta bir florlu etilen propilen (FEP) yapışkan bant tabakası uygulayın. Kenarlardaki aşırı bandı temiz bir tıraş bıçağı ile kesin. FEP bant kaplı kapak fişlerini de aynı şekilde hazırlayın (Şekil 1A).
- Kızağın FEP bant kaplı tarafına çift taraflı yapışkan görüntüleme ara parçası uygulayın. Üstteki koruyucu astarı soyulmadan bırakın (Şekil 1A).
NOT: Slaytlar ve kapak fişleri deneyden önce hazırlanmalıdır. Hemen kullanılabilir veya yüzeylerde toz birikmesini önlemek için kutularda saklanabilirler. Görüntüleme ara parçasındaki kuyu 120 μm derinliğindedir ve 9 mm çapındadır.
2. İnterfaz tutuklu yumurta ekstraktlarının hazırlanması ve canlı görüntülenmesi
NOT: Aşağıdaki protokol Deming ve Kornbluth19, Murray20 ve Smythe ve Newport25'ten değişikliklerle uyarlanmıştır. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
- Yumurta toplamadan üç ila on gün önce, olgun dişi Xenopus laevis kurbağalarını deri altından dorsal lenf kesesine 100 IU hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) ile enjekte edin.
- Planlanan yumurta toplamadan on altı ila on sekiz saat önce, kurbağalara adım 2.1'den itibaren 500 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte edin. Kurbağaları yumurtlama tamponunda (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl2·2H 2 O,0.5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA) 18 °C'de bırakın, yumurta toplanana kadar pH7.4'te 20x stok çözeltisi olarak hazırlayın ve kullanımdan önce temiz kurbağa tankı suyuyla 1x'e kadar seyreltin).
- Deney gününde, yumurtaları büyük bir cam Petri kabında toplayın ve yumurta kalitesini değerlendirin. Beyaz kabarık toplara benzeyen veya bir dizede görünen yumurtaları atın (Şekil 1B). Yumurtaları bir stereoskop altında inceleyin, yumurtaları normal görünümde tutun (Şekil 1C) ve düzensiz veya benekli pigmentli olanları atın (Şekil 1D).
NOT: Bu protokol, tipik olarak hCG enjeksiyonundan 16 saat sonra 25 mL yumurta bırakan tek bir kurbağadan toplanan yumurtalarla çalışır. Genellikle, toplam 3 ila 6 kurbağa hCG tarafından indüklenir ve ekstrakt hazırlama deneyi için en yüksek yumurta kalitesine sahip kurbağa seçilir. - Yumurtaları 400 mL'lik bir cam behere aktarın ve dekantasyon yaparak mümkün olduğunca fazla yumurtlama tamponunu çıkarın.
- Yumurtaları 100 mL taze hazırlanmış jöle çözücü çözelti içinde (suda% 2 w / v L-sistein, NaOH ile pH 8.0'a ayarlayın) inkübe edin ve periyodik olarak hafifçe döndürün. Yaklaşık 3 dakika sonra, çözeltiyi dökün ve 100 mL taze jöle çözeltisi ekleyin. Yumurtalar sıkıca paketlenene kadar inkübasyona devam edin (yumurtalar arasında boşluk yoktur), ancak yumurtaları jöle çözeltisinde toplam 5 dakikadan fazla bırakmaktan kaçının.
- Dekantasyon yaparak jelleştirici çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve tamponu ekleyerek yumurtaları 0,25x MMR tamponunda (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, 10x stok çözeltisi olarak hazırlanmış, NaOH ile pH 7,8'e ayarlanmış ve kullanımdan önce Milli-Q suda seyreltilmiş) yıkayın, yumurtaları döndürün ve sonra tamponu dökün. Yıkamalar için toplam 1 L tampon kullanılıncaya kadar birkaç kez tekrarlayın.
- Yumurtaları toplam 400 mL yumurta lizis tamponu ile birkaç kez yıkayın (250 mM sakaroz, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, taze yapılmış ve KOH ile pH 7,7'ye ayarlanmış). Yıkamalar arasında bir Pasteur pipet kullanarak anormal görünümlü yumurtaları çıkarın.
NOT: Anormal görünüme sahip yumurtalar, beyaz kabarık toplara benzeyen (Şekil 1B), benekli pigmentasyona sahip (Şekil 1D), büyüyen beyaz bir bölgeyle bozulan (Şekil 1E) veya hayvan yarımküresinde koyulaşmış ve daralmış pigmentli alan gösterenleri ifade eder (Şekil 1F). - Ucu tamamen açık kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak, yumurtaları 1 mL yumurta lizis tamponu içeren 17 mL'lik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Yumurtaları paketlemek için tüpü 400 x g'de klinik bir santrifüjde 15 saniye boyunca döndürün.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak paketlenmiş yumurtaların üstünden yumurta lizis tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
NOT: Yumurta ekstraktının seyreltilmesini en aza indirmek için paketlenmiş yumurtalardan mümkün olduğunca fazla tampon çıkarmak önemlidir. Bazen bunu başarmak için artık tamponla birlikte bazı gevşek yumurtaların çıkarılması gerekir. - Paketlenmiş yumurtaların yaklaşık hacmini belirleyin ve ardından doğrudan paketlenmiş yumurtaların üzerine 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL leupeptin, 5 μg / mL sitokalkasin B ve 50 μg / mL sikloheksimid ekleyin.
NOT: Aprotinin ve löpeptin proteaz inhibitörleridir. Sitokalasin B, aktin polimerizasyonunu inhibe ederek ekstraktın büzülmesini ve jelleşmesini önler26. Sikloheksimid, protein sentezini inhibe eder, böylece ekstraktı hücre döngüsünün interfazında tutar. - Tüpü 12.000 x g, 4 ° C'de, sallanan bir kova rotorunda 15 dakika boyunca santrifüj ederek yumurtaları ezin.
NOT: Santrifüjlemenin sonunda, yumurtalar yırtılmış ve lizat üç ana tabakaya ayrılmış olmalıdır: üstte sarı bir lipit tabakası, ortada sitoplazmik ekstrakt (ham ekstrakt olarak da adlandırılır) ve altta pigment granüllerini içeren koyu yoğun bir tabaka (Şekil 1G). - Bir şırıngaya 18 gauge iğne takın. İğne ucu eğimi yukarı bakacak şekilde, tüpü sitoplazmik tabakanın altındaki taraftan delin ve yavaşça çizerek ekstraktı geri kazanın.
NOT: Sarı lipit tabakasından kirletici içeriğin dahil edilmesini önlemek için sitoplazmik ekstraktı yavaşça çekin. - Geri kazanılan sitoplazmik ekstraktı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun. Özü 1 saat içinde kullanın.
- Görüntülemeye hazır olduğunda, ekstraktı istenen reaktifler ve floresan görüntüleme probları ile destekleyin.
NOT: Floresan görüntüleme probları, bir floresan mikroskobu ile görselleştirilebilmeleri için spesifik sitoplazmik yapıları etiketler. - Üst koruyucu astarı, adım 1.2'de hazırlanan slayt üzerindeki görüntüleme aralayıcısından çıkarın ve kuyunun ortasına yaklaşık 7 μL ekstrakt biriktirin. Kuyuyu kapatmak için FEP bant kaplı kapak kapağını, FEP tarafı ekstrakta bakacak şekilde derhal uygulayın. Hızlı bir şekilde görüntülemeye geçin (Şekil 1H,I).
- Slaytı, motorlu bir sahne ve dijital kamera ile ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop üzerine ayarlayın. Ekstraktları hem parlak alan hem de floresan kanallarında istenen uzamsal konumlarda ve zaman aralıklarında görüntüleyin.
NOT: Genellikle, görüntüleme için 5x hedefi kullanılır. Motorlu aşama, birden fazla tanımlanmış uzamsal konumda otomatik görüntü yakalama sağlar. Parlak alan mikroskobu, sitoplazmik yapıları farklı derecelerde şeffaflıkla görselleştirir. Floresan mikroskobu, adım 2.14'te eklenen floresan görüntüleme probları tarafından özel olarak etiketlenmiş sitoplazmik yapıları görselleştirir. Kamera bu yapıların hızlandırılmış görüntülerini kaydeder, böylece sitoplazmik organizasyonun dinamiklerini yakalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus laevis yumurta ekstreleri, interfaz sırasında sitoplazmanın kendi kendine organizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Şekil 2A, başarılı bir deneyin sonuçlarını göstermektedir. İnterfaz çekirdeklerinin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için fazlar arası tutuklanmış ekstraktları, fazlar arası çekirdeklerin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için 27 çekirdek / μL ve 0.38 μM saflaştırılmış GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (glutatyon-S-transferaz, yeşil floresan proteini ve bir nükleer lokalizasyon dizisinden oluşan füzyon proteini) konsantrasyonunda demembrane edilmiş Xenopus laevis sperm çekirdeği 19 ile destekledik. Ayrıca mikrotübülleri görselleştirmek için 1 μM floresan etiketli tübülin ve mitokondrileri görselleştirmek için 500 nM MitoTracker Kırmızı CMXRos ekledik. Ekstrakt görüntüleme odasına yerleştirildikten birkaç dakika sonra, sitoplazma düzensiz görünüyordu. Oda sıcaklığında sonraki 30 dakika boyunca, sitoplazma hücre benzeri bölmeler halinde kendi kendine organize olmaya başladı. Mikrotübül asterleri, sperm çekirdekleriyle birlikte verilen sentrozomlardan büyüdü ve komşu asterlerden gelen mikrotübüllerle karşılaştığında mikrotübül tükenmiş sınır bölgeleri oluşturdu. GST-GFP-NLS proteini, eklenen demembrane edilmiş sperm çekirdeklerinden kendi kendine monte edilen yuvarlak fazlar arası çekirdeklere translokasyon yapar. Işık saçılan sitoplazmik bileşenlerin tükendiği alanlar hem parlak alan hem de mitokondri kanallarında görülebiliyordu (Şekil 2A, 20 dakika ve 35 dakika). Mitokondri ayrıca mikrotübüller tarafından oluşturulan sınırlardan tükendi ve mikrotübül bölmeleriyle aynı hizada olan izole bölmelerde zenginleştirildi. Oda sıcaklığında 60 dakikaya kadar, hücre benzeri bölmelerden oluşan uzamsal bir desen iyi kurulmalı, mikrotübüller içi boş çelenk benzeri bir yapı oluşturmalı ve mitokondri her bölmeye açıkça bölünmelidir (Şekil 2A, 53 dakika).
Şekil 2B, cam üzerinde FEP bantları olan ve olmayan görüntüleme odalarındaki ekstrakt performansını karşılaştırır. İnterfaz çekirdeğin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için fazlar arası tutuklanmış ekstraktları, fazlar arası çekirdeklerin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için 27 çekirdek / μL ve 0.35 μM GST-mCherry-NLS 27,28,29,30 (glutatyon-S-transferaz, mCherry floresan proteini ve bir nükleer lokalizasyon dizisinden oluşan füzyon proteini) konsantrasyonunda demembrane edilmiş Xenopus laevis sperm çekirdeği 19 ile destekledik. Ayrıca mikrotübülleri görselleştirmek için 1 μM floresan etiketli tübülin ekledik. Dinamiklerdeki farklılıklar oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika belirginleşti. FEP-bantlı camdan yapılmış odada, ekstrakt normal hücre benzeri desenler halinde kendi kendini organize etti (Şekil 2B, satır 1 ve 3'teki görüntüler). Bununla birlikte, cam yüzeylerin FEP bandı (pasifleştirilmemiş) tarafından örtülmediği odada, ekstrakt, zamanla giderek daha fazla bozulan anormal parlak alan ve mikrotübül desenleri göstermiştir (Şekil 2B, satır 2 ve 4'teki görüntüler). GST-mCherry-NLS proteininin nükleer ithalatında anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 2B, satır 5 ve 6'daki görüntüler).
Resim 1: Deneysel prosedürle ilgili şemalar ve fotoğraflar. (A) FEP bant kaplı cam kapaklar ve slaytlar hazırlamak için şematik diyagram. (B) Yumurtlama tamponunda biriken Xenopus laevis yumurtaları, oklarla gösterilen düşük kaliteli yumurta örnekleriyle. Sarı oklar, beyaz kabarık toplara benzeyen yumurta örnekleri. Kırmızı oklar, bir dizede görünen yumurta örnekleri. (C) Normal görünümlü Xenopus laevis yumurtası örnekleri. (D) Düzensiz veya benekli pigmentli düşük kaliteli yumurta örnekleri. (E) Büyüyen beyaz bir bölgeye sahip bozulan bir yumurta. (F) Muhtemelen partenogenetik aktivasyon nedeniyle koyulaşmış ve daralmış pigmentli alan gösteren bir yumurta. (G) Adım 2.11'deki 12.000 x g santrifüjlemeden sonra yırtılmış Xenopus laevis yumurtalarının oluşturduğu tabakalar. (H) Adım 2.15'te ekstrakt görüntüleme odasını hazırlamak için şemalar. (I) İçinde yumurta ekstresi bulunan hazırlanmış bir görüntüleme odasının fotoğrafı. (C) ve (D), (D)'nin altındaki aynı ölçek çubuğunu paylaşır. (E) ve (F), (F)'nin altındaki aynı ölçek çubuğunu paylaşır. (B) (C) (D) (E) (F) ve (I) içindeki ölçek çubukları yaklaşık değerlerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnterfaz tarafından tutuklanan yumurta ekstraktları, hücre benzeri bölmeler halinde kendi kendini organize eder. (A) İnterfaz tarafından tutuklanmış Xenopus laevis yumurta ekstraktının ince bir tabakasında (120 μm) kendi kendini organize eden desen oluşumunun hızlandırılmış montajı. Ekstrakt, interfaz çekirdeklerinin yeniden sulandırılmasına izin vermek için 27 çekirdek / μL demembrane Xenopus laevis sperm çekirdeği ile desteklendi. Mikrotübüller, HiLyte 647 etiketli tübülin (macenta ile gösterilmiştir), MitoTracker Red CMXRos tarafından mitokondri (kırmızı ile gösterilmiştir) ve çekirdekler GST-GFP-NLS (yeşil renkle gösterilmiştir) ile görselleştirilmiştir. (B) FEP-bant kaplı cam yüzeyli ve FEP-bant kaplı cam yüzeysiz odalara yerleştirilen interfaz tutuklamalı Xenopus laevis yumurta ekstraktlarında kendi kendini organize eden desen oluşumu. Ekstraktlar, interfaz çekirdeklerinin sulandırılmasına izin vermek için 27 çekirdek / μL demembrane Xenopus laevis sperm çekirdeği ile desteklendi. Mikrotübüller, HiLyte 488 etiketli tübülin (macenta ile gösterilmiştir) ve çekirdekler GST-mCherry-NLS (yeşil renkle gösterilmiştir) ile görselleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntüleme odası için isteğe bağlı ikincil conta. Ekstraktın hava ile uzun süre temas etmesini önlemek için mineral yağ ile isteğe bağlı bir ikincil conta hazırlamak için şemalar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis yumurta ekstreleri, çeşitli hücre altı yapıların 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 ve bir bütün olarak sitoplazmik organizasyonun görüntülenmesine dayalı çalışmalar için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. hücre ölçeği9. Burada dinamik sitoplazmik organizasyonu 2D olarak görselleştirmek için uygun canlı bir görüntüleme yöntemi tarif ettik. Yöntemin etkinliği temsili sonuçlarla gösterilmiştir.
Yöntemin başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Yumurta kalitesi ekstraktlar için önemlidir, bu nedenle 2.3 ve 2.7 numaralı adımlar kritiktir. Deneyimlerimize göre, yüksek kaliteli yumurtaların hayvan yarımküresi düzgün pigmentasyona, merkezde belirgin bir beyaz noktaya (germinal vezikül parçalanmasının göstergesi, GVBD) ve bitkisel yarımküre ile net bir sınıra sahiptir (Şekil 1C). Yüksek kaliteli yumurtalardan yapılan ekstraktlar, görüntüleme koşullarımız altında daha iyi performansa sahiptir. Yumurtaların% 5'inden fazlası benekli pigmente sahipse (Şekil 1D), koyulaşmış ve daralmış pigmentli alana sahipse (Şekil 1F), beyaz kabarık toplara benziyorsa (Şekil 1B), bir ipte görünüyorsa (Şekil 1B) veya 2.6 ve 2.7. adımlarda (Şekil 1E) yıkamalardan sonra bozulma belirtileri gösteriyorsa, o zaman tüm yumurta grubu atılmalıdır. Ekstraktlar dikkate değer biyolojik aktiviteyi korurlar, çünkü esasen seyreltilmemiş sitoplazmadırlar. Bu nedenle, ekstraktın seyreltilmesini en aza indirmeyi amaçlayan adım (adım 2.9) deneyin başarısı için önemlidir. Görüntüleme için, ekstraktlar çok küçük hacimlerde işlenir ve hava ile uzun süre temas ederse hızla buharlaşır. Bu, faaliyetlerini olumsuz yönde etkileyecektir. Bu nedenle, adım 2.15'te, ekstrakt biriktirildikten sonra, mümkün olan en kısa sürede kapak kaymasının FEP bant kaplı tarafı ile kapatılmalıdır. Sızdırmazlık, ara parçadaki yapıştırıcı ile kapak kayması arasındaki temas alanındaki doku değişikliği ile görsel olarak doğrulanabilir. Ara parça, uygun şekilde uygulanırsa tam bir sızdırmazlık oluşturabilmelidir. Bununla birlikte, ek bir conta istenirse, kapak kaymasının çıkıntısı ile cam kızak arasına mineral yağ dağıtılabilir. Yağ, kılcal hareketle ara parçanın etrafında ek bir sızdırmazlık oluşturabilir (Şekil 3). Cam yüzeylerin pasivasyonu, moleküllerin spesifik olmayan adsorpsiyonunu azaltabilir ve21,37 ekstraktlarındaki interfaz mikrotübül asterleri için önemlidir. FEP bandının burada tarif edilen bir cam yüzey üzerine uygulanması, normal fazlar arası mikrotübül asterlerinin montajında önerildiği gibi benzer faydalar sunuyor gibi görünmektedir (Şekil 2, 6 dakika). Bu nedenle, adım 1.1 de kritiktir.
Deming ve Kornbluth19 protokolünü takiben interfaz tutuklamış yumurta ekstraktlarını kullanan bir görüntüleme yönteminin uygulanmasını gösterdik. Varsayılan olarak, protokol, oda sıcaklığında26 oda sıcaklığında uzatılmış inkübasyondan sonra ekstraktlarda jelleşme-büzülmeyi önlemek için ekstraktları aktin polimerizasyon inhibitörü sitochalasin B ile tamamlar. Aktin polimerizasyonuna izin vermek ve aktin dinamiklerini gözlemlemek için, protokol9'un 2.10. adımında sitokalasin B'yi dışarıda bırakabilir. Deming ve Kornbluth protokolünde yaptığımız bir değişiklik, ATP19'u yeniden oluşturmak için ekstraktları bir enerji karışımı ile desteklemememizdir. Bunun nedeni, ellerimizde, bu ATP yenileyici karışım19 ve sperm çekirdeği ile desteklenen ekstraktlarda, mikrotübüllerin bazen sitoplazmik patern oluşumuna müdahale eden çapraz bağlı bir kafes oluşturmasıdır. Bu nedenle, protokol enerji karışımınıekstraktlar 19'a ekleyen adımı içermez.
Faz arası ekstrakt protokolü, yumurtaları mayotik arrestten (CSF-arrest) serbest bırakmak için EGTA'sız tamponda ezmeye dayanır37. Ekstraktlar daha sonra interfaza ilerler ve sikloheksimid tarafından interfazda tutulur. Fazlar arası ekstraktları hazırlamak için başka yerleşik yöntemler de vardır. Bazı yöntemler ilk önce yumurtaları EGTA38 ile lizis tamponunda ezerek mayotik arresti koruyan ekstraktlar hazırlar ve daha sonra kalsiyum ekleyerek tutuklamayı serbest bırakır ve ekstraktı interfaz 21,37,39'a sürer. Ekstraktlar daha sonra sikloheksimid37,39 gibi protein sentez inhibitörlerinin eklenmesiyle interfazda tutulabilir. Diğer yöntemler, EGTA 20,28'in yokluğunda yumurtaları ezmeden önce, mayotik arrestten serbest bırakmak için kalsiyum iyonofor (A23187) veya elektrik şoku ile partenogenetik olarak aktive eder (Field ve ark.37'de gözden geçirilmiştir). Bu ekstraktlar interfaza girebilir, ancak tipik olarak çoklu hücre döngülerinden geçebildikleri için orada kalmazlar. Benzer şekilde, bozulmamış aktin sitoiskeleti ile ekstraktların hazırlanması için optimize edilmiş köklü yöntemler geliştirilmiştir 10,37,39. Görüntüleme yöntemi bu tür ekstraktlar için uygun olabilir, ancak onlarla test etmedik.
Sitoplazmanın iç organizasyonunu görüntülemek amacıyla, burada sunulan görüntüleme sisteminin kurulumu nispeten kolaydır ve sadece cam yüzeylere bir FEP bandı uygulanmasını gerektirir. Cam yüzeylerin poli-L-lizin-g-polietilen glikol (PLL-g-PEG) tedavisi ile pasifleştirildiği veya desteklenen lipit çift katmanlı10,21 ile kaplandığı daha sofistike görüntüleme sistemlerinde bildirilenekstraktlarda 9 sitoiskelet yapılarının birleştirilmesine izin verir. Yöntem, ekstrakt katmanının tanımlanmış bir kalınlıkta oluşmasına izin verir (Şekil 1A, 1H, 1I ve Şekil 2'de gösterilen sistem için 120 μm olan ara parçanın derinliği ile belirlenir). Ek ara parçaları istifleyerek kalınlığı ayarlayabiliriz. Bu tür 6 adede kadar ara parçayı (720 μm kalınlığında) istifledik ve bölmeler normal şekilde oluştu. Bu esneklik, ekstraktların konfokal veya ışık tabakası mikroskobu kullanılarak 3D olarak görüntülenmesi gibi gelecekteki uygulamaları mümkün kılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
J. Kamenz, Y. Chen ve W. Y. C. Huang'a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, James E. Ferrell, Jr.'a verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 GM110564, P50 GM107615 ve R35 GM131792) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W.
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
