Summary
우울증의 만성 절망 마우스 모델 (CDM)은 반복적 인 강제 수영 세션과 판독 된 또 다른 지연 된 수영 단계로 구성됩니다. 이는 적어도 4주 동안 안정한 만성 우울 유사 상태의 유도에 적합한 모델을 나타내며, 아만성 및 급성 치료 개입을 평가하기 위해 수정가능하다.
Abstract
주요 우울 장애는 정신 질환의 가장 보편적 인 형태 중 하나이며 엄청난 개인의 고통과 사회 경제적 부담을 유발합니다. 그 중요성에도 불구하고 현재의 약리학 적 치료는 제한되어 있으며 새로운 치료 옵션이 시급히 필요합니다. 잠재적 인 신약을 찾는 핵심 요소 중 하나는 적절한 동물 모델에서 항우울 효능을 평가하는 것입니다. 고전적인 Porsolt 강제 수영 테스트는 우울증과 같은 상태를 유도하고 평가하기 위해 수십 년 동안이 목적으로 사용되었습니다. 그것은 강제 수영의 두 가지 짧은 기간으로 구성됩니다 : 첫 번째는 우울한 상태를 유도하고 두 번째는 다음 날 두 번의 수영 세션 사이에 주어진 에이전트의 항우울제 효과를 평가합니다. 이 모델은 잠재적 인 항우울제에 대한 스크리닝 도구로 적합 할 수 있지만 많은 항우울제의 작용 지연 발병은 무시합니다. CDM은 최근에 설립되었으며 주목할만한 차이점을 가진 고전 테스트의 수정을 대표했습니다. 마우스는 인간에서 우울증이 급성 스트레스보다는 만성적 인 것에 의해 유발된다는 생각에 따라 5 일 연속 수영을해야합니다. 며칠 (1-3 주)의 휴식 기간 동안 동물은 지속적인 행동 절망을 겪습니다. 표준 판독 방법은 추가 지연 된 수영 세션에서 부동성 시간을 측정하는 것이지만 동물의 기분 상태에 대한 더 넓은 시각을 얻기 위해 몇 가지 대체 방법이 제안됩니다. 행동, 분자 및 전기 생리학적 변화를 표적으로 삼는 여러 분석 도구를 사용할 수 있습니다. 우울한 표현형은 적어도 4 주 동안 안정적이며, 신속하지만 아만성 항우울제 치료 전략을위한 시간 창을 제공합니다. 또한, 우울한 상태의 발달의 변화는이 접근법을 사용하여 해결 될 수 있습니다. 따라서 CDM은 우울증을 더 잘 이해하고 새로운 치료 중재를 개발하는 데 유용한 도구입니다.
Introduction
주요 우울 장애와 같은 정서 장애는 가장 빈번하고 도전적인 정신 질환 중 하나이며 높은 개인의 고통1, 자살 위험의 증가2와 관련이 있으며 사회에 상당한 사회 경제적 부담을 초래합니다3. 그 영향에도 불구하고 치료 옵션은 제한되어 있으며 특히 지난 수십 년 동안 정신 약리학의 혁신 위기로 인해 새로운 항우울 중재의 개발이 시급히 필요합니다. 우울증의 병태생리학을 이해하고 잠재적인 새로운 제제를 시험하기 위해서는 합리적이고 유효한 동물 모델이 시급히 필요하다4. 거의 반세기 동안, 원래 Porsolt5에 의해 묘사 된 고전적인 강제 수영 테스트 (FST)는 잠재적 인 새로운 항우울제의 스크리닝을위한 유도 및 판독으로 사용되었습니다. 그것은 1 일째에 5-15 분 동안 강제 수영 기간, 후속 일회성 약물 적용, 및 다음날 다른 수영 기간에 물에서 움직이지 않는 마우스의 부분 평가로 구성됩니다. 부동성 시간은 누락 된 자연 탈출 행동을 나타내는 것으로 간주되었으며 마우스의 우울증과 같은 상태의 정도와 상관 관계가 있다고 생각되었습니다5.
고전적 FST는 과학계에서뿐만 아니라6,7,8 또한 대중 매체에서8 심하게 비판을 받았다. FST를 둘러싼 대부분의 논쟁은 고전적인 패러다임에서 단 1 일의 짧은 유도 및 치료 기간 때문입니다. FST는 인간의 우울증에 필적하는 상태라기보다는 오히려 급성 외상 모델을 나타낸다고 주장했다. 또한, Porsolt 검사는 잠재적 인 항우울제의 선별 도구로 적합 할 수 있지만 많은 항우울제의 지연된 발병을 무시합니다.
원래의 FST에서 파생 된 만성 절망 모델 (CDM) 9,10,11,12,13,14,15는 우울증에 대한보다 적절한 동물 모델을 나타냅니다. CDM에서 5 일 연속으로 반복되는 수영 스트레스는 급성 외상 효과를 피할 수 있습니다. 반복되고 계속되는 스트레스가 많은 상황에서 벗어나지 못함으로써 생쥐는 무력감, 항복 및 궁극적으로 절망의 상태를 발전시키는 것으로 생각됩니다. 이 패러다임은 외상 후 스트레스 장애의 발병시 일반적으로 경험되는 단일 급성 외상보다 인간의 우울증 발달에 대한 현재의 심리학 이론과 더 비슷합니다. CDM의 우울증 유사 상태는 최대 4주 동안 안정적이며9 따라서 항우울제가 혜택을 나타내기 위해 보통 2-4주가 필요한 임상 조건과 비교할 수 있는 더 긴 치료 기간에 대한 가능성을 열어줍니다16.
우울한 상태에 대한 평가는 다차원적이어야합니다. 고전적인 FST에서와 같이 부동성 시간의 측정은 유용하지만 유일한 결과 매개 변수로 사용해서는 안됩니다. 아래에 설명 된 다양한 방법은 우울한 인간에서 일반적으로 발견되는 증상에 따라 우울 상태의 다른 차원을 매핑 할 수 있어야합니다. 적합한 판독 평가는 탈출 행동 (부동성 시간9,10,17), 꼬리 정지 시험 (TST)9, 무쾌감증 (고전적 수크로오스 선호 시험 (SPT)18), 동기 부여 지향 행동 (코 찌르는 수크로오스 선호도 시험 (NPSPT)10), 기대 / 탐사 행동 (모호한 신호에 대한 반응19; Y-maze test9), 전기생리학(장기 가소성 측정(장기 강화, LTP; 장기 우울증, LTD)20), 분자 평가(즉각적인 초기 유전자(IEGs)의 활성화 패턴; 추가 스트레스 패턴21).
이론적으로, 반복적 인 수영 테스트는 부동성 시간에 대한 평가없이 우울한 상태를 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 그러나 적어도 부동성 시간이 있는 개념 증명 실험 시리즈를 제공하는 것이 좋습니다. 추가적으로, CDM은 유도 단계 동안 부동성 시간을 측정함으로써 우울 유사 상태의 발달을 평가하기에 적합한 모델을 나타낸다. 수영 전에 치료된 특정 마우스 균주 또는 마우스는 스트레스에 대한 탄력성 또는 취약성 및 행동 절망의 유도에 대하여 평가될 수 있다.
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Protocol
모든 실험은 유럽 지침 (EU 2010/63) 및 독일 동물 보호법 (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국가 동물 복지 단체 GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) 가이드에 따라 수행되었으며 프라이부르크 대학의 동물 복지위원회와 Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS, CEEA35) 및 지방 당국. C57Bl6N 야생형 마우스의 성별 모두 10-14주(출생 후 70-98일, PND)에 야생형(WT) 지시 실험을 사용하였다. 스트레스 회복성 라인으로서, 전뇌 뉴런 CaMKII 프로모터 하에서 아데노신 A1 수용체의 발현이 강화된 트랜스제닉 마우스 라인9,15를 사용하였다. 실험 후, 마우스를 자궁경부 탈구에 의해 희생시켰다.
1. 준비
- 철저한 실험 계획을 포함하여 동물 연구 면허를 취득하십시오.
- 도착: 도착시 동물 시설에서 동물을 키워 CDM을 수행하십시오. 동물을 외부 공급 업체로부터 구입 한 경우 새로운 환경에 적응하기 위해 최소 2 주 동안 허용하십시오.
- 주거 : 동물을 수용하려면 추가 스트레스를 피하기 위해 새장이 최대 수의 동물로 채워지지 않도록하십시오. 주택 조건이 마우스 하우징의 국제 권장 사항 (자세한 내용은 see22)과 일치하고 항상 지속적으로 유지되도록하십시오.
참고 : 가장 중요한 표준 하우징 조건에는 시간당 25-120 회의 공기 변화, 12 시간의 밝은 어둠주기, 가능한 한 안정적인 온도 (20-24 ° C 사이에서 적어도 일정), 가능한 한 안정적인 습도 (적어도 45 % -65 % 사이), g아 먹는 재료 및 피난처가 있으며 개별 주택이 없는 개별 환기 케이지가 포함됩니다. - 시점: 하루 중 동시에 모든 실험을 수행합니다.
참고 : CDM에 대한 주간 시간의 영향을 확인하기위한 직접적인 평가는 이루어지지 않았지만 우울한 상태를 평가하는 대부분의 행동 테스트는 하루 중 시간에 따라 변화를 보여 주며23,24,25 낮에도 CDM에 영향을 줄 가능성이 큽니다. - 중첩 재료: 중첩 재료를 최소한으로 줄입니다. 케이지에 달리는 바퀴 등이 없는지 확인하십시오.
참고: 풍부한 환경은 우울한 상태의 유도를 방지합니다. - 그룹 구성: 동물들이 전체 실험 동안 동일한 그룹에 남아있도록 허용한다. 암컷 쥐를 다른 깔짚에서도 함께 그룹화하십시오. 수컷 쥐를 쓰레기 수컷 동물과 함께 그룹화하십시오. 다가오는 공격성, 특히 남성의 공격으로 인해 물기와 이발이 문제가 될 수 있으므로 그룹 구성에 특히 중점을 둡니다. 박탈이 주요 추가 스트레스 요인이기 때문에 단일 주택을 피하십시오.
- 동물: 특정 차이가 관찰되었음에도 불구하고 다른 마우스 균주를 사용합니다.9,10. 빈번하게 사용되는 마우스 균주는 쌍을 이룬 통계 분석을 수행하기 위해 C57Bl6N. 라벨 마우스이다(단계 3.2.4 참조).
- 동물 섹스 : 남성과 여성 마우스를 똑같이 사용하십시오.
- 동물의 나이: 동물이 10주(70PND) 이상 되었는지 확인하십시오. 수영으로 인한 피로로 인해 어린 동물을 사용하지 마십시오.
- 장비: 최소 2L의 용량, 24-26cm의 직경 및 30cm의 최소 높이를 가진 투명한 유리 실린더/비커를 사용하십시오. 추가 요구 사항에는 수온, 종이 타월, 적색 조명 가열 램프 / 난방 매트 또는 난방 소스, 타이머, 스톱워치, 조용한 환경을 확인하는 온도계가 포함됩니다. 오프라인 분석 및 문서화를 위해 수영 세션을 비디오 테이프로 녹화하십시오. 날짜와 시간이 개별 동물의 식별 코드 번호와 함께 테이프/파일에 계속 표시되는지 확인하십시오. 나중에 분석하고 추가 참조를 위해 파일을 저장합니다. 분석을 용이하게하기 위해 위가 아닌 유리 실린더의 측면에서 필름.
2. 유도 단계
- 시작하기 전에
- 물거나 이발사의 징후를 포함하여 이상에 대해 동물을 시각적으로 관찰하십시오. 동물이 최소한의 부상을 보이는 경우 실험 시리즈에서 전체 케이지를 제외하십시오. 실험 중에 부상이 악화되고 스트레스의 영향으로 마우스가 더 공격적으로 변함에 따라 수의사가 언제든지 이용할 수 있는지 확인하십시오.
- 실험을 시작하기 전에 각 동물에 대한 체중을 구하십시오. 자주 관찰되는 체중 감소가 초기 체중의 20 %를 초과하지 않도록하십시오. 체중 감량이 20 % 이상인 동물을 배제하고 높은 고통으로 인해 즉시 안락사하십시오.
- 비커 또는 실린더를 실온에서 물 (22-23 °C)에서 바닥에서 최소 20cm의 높이로 채우고 물 표면과 용기의 상부 경계 사이에 최소 10cm를 남겨 둡니다.
- 공연
- 동물을 부드럽게 물 속으로 옮기십시오. 수영 단계에서 익사를 방지하기 위해 동물을 지속적으로 관찰하십시오. 동물이 실험자를 볼 수없는 위치에서 관찰하십시오 (예 : 옆집 방에서 비디오 관찰).
- 실험 시작 부분에 크로노미터를 설정합니다. 꼬리를 잡기 만하면 10 분 후에 동물들을 물에서 꺼내십시오. 종이 타월로 부드럽게 말리고 가열 조명 또는 난방 매트 아래에 두십시오.
- 한 번에 하나의 동물만 평가합니다. 동물들이 서로를 볼 수 없도록 하십시오 (예를 들어, 방 분배기에 의한 실험 설정에서 하우징 케이지를 분리하십시오).
- 5 일 연속 매일 10 분 동안 강제 수영 세션을 수행하십시오.
- 마무리
- 다섯 번의 수영 세션 후에 동물을 집 새장으로 옮기고 적어도 2 일 동안 휴식을 취하십시오. 그 후 특정 치료 중재를 시작하십시오.
3. 항우울 치료의 평가
- 시간 코스
- CDM을 사용한 급성 및 아만성 치료법을 평가하십시오. 과학적 질문에 따라 유도 단계와 판독 단계 사이의 휴식 기간을 조정하십시오.
- 케타민의 급성 및 급속 작용 효능을 평가하려면 CDM의 유도 단계 후 짧은 휴식 기간 (며칠)을 선택하십시오. 치료 (즉, 복강내 주사)를 적용한 다음, 평가 (추가 수영 세션 또는 다른 평가 방법)를 직후에 수행한다.
- 아만성 치료의 효과를 평가하려면 치료 기간을 최대 4 주까지 늘리십시오 (더 긴 치료 기간 동안 사용할 수있는 데이터가 없습니다). 예를 들어, 유도 단계 후 4주 동안 동물에게 이미프라민으로 경구 처리를 주고 그 후에 평가한다.
- 치료 기간이 끝난 직후, 예를 들어, 다음날 우울한 상태를 평가하기 시작하십시오. 제어 및 실험 조건에 대해 항상 동일한 기간을 선택하십시오.
- 부동성 시간
- 개념 증명
- 부동성 시간을 판독 방법으로 사용하려면 유도 단계 및 시험일의 매일을 평가하여 개념 증명을 제공합니다( 그림 1 참조). 추가 실험 시리즈의 경우 평가를 1일, 5일차 및 시험일로 줄입니다( 그림 1C 참조).
- 각 실험을 비디오 테이프로 녹화합니다. 실험 조건에 눈이 먼 두 명의 훈련된 관찰자가 독립적으로 분석을 수행할 수 있도록 허용합니다. 비디오 분석을 통해 실험자는 다른 방의 동작을 관찰 할 수 있으므로 테스트와의 간섭을 최소화 할 수 있습니다 (예 : 보충 자료의 비디오 파일 참조).
- 조건 : 수영 테스트 중에 세 가지 행동 조건을 관찰하고 확인하십시오 : 고군분투, 수영 및 부동성. 대부분의 연구자들은 부동성에 중점을 둡니다. 고군분투와 수영 사이의 추가 차별화는 거의 유용하지 않으며 분석의 복잡성과 지속 시간을 극적으로 증가시킵니다.
- 고군분투 : 동물은 위협적인 상황에서 적극적으로 탈출하려고합니다. 이것은 모든 팔다리의 움직임과 벽을 향한 머리를 가진 실린더의 측면을 발로 밟는 것을 포함합니다. 물 표면은 전형적으로 약간 난류이다.
- 수영 : 동물은 적어도 뒷발을 움직이고 물 위를 가로 질러 거리를 여행합니다. 그것은 적극적으로 탈출구를 찾고 있지만 선박의 유리 벽을 극복하려고하지는 않습니다. 수영은 물 표면 위의 발을 들어 올리는 것을 포함하지 않으며, 몸은 일반적으로 실린더의 벽과 평행하게 향합니다. 이 상태에서 동물들은 자주 돌아 다니거나 원을 그리며 움직입니다.
- 부동성 : 동물은 얼어 붙은 자세로 가만히 있고 전혀 움직이지 않거나 꼬리 또는 앞발을 움직여 머리를 물 표면 위로 유지합니다. 수동 부동을 제외하고는 거리가 활발히 이동하지 않으며 앞발의 지시 된 움직임이 관찰되지 않습니다.
- 추적
- 오프라인 비디오 녹화를 사용하여 평가를 수행합니다. 두 명의 독립적이고 경험이 풍부한 심사관이 맹검 등급을 사용하고 두 등급 간의 평균을 계산하십시오.
- 두 채점자의 결과가 이전에 결정된 범위 이상으로 다른 경우 등급을 반복합니다. 쥐를 지속적으로 관찰하면 고군분투, 수영 및 부동성 사이에서 다른 조건이 자주 변합니다.
- 스톱워치를 사용하여 마우스가 물 속에 머무르는 10 분 동안 집중된 단계 (일반적으로 부동성)에서 보낸 총 시간을 측정하십시오. 진행중인 시간 측정을 변경하기 전에 약 2 초의 짧은 대기 시간을 고려하십시오 (예를 들어, 동물이 부동성으로 20 초 동안 남아 있고 1 초 미만 동안 한 번만 움직이고 다른 10 초 동안 부동성으로 돌아 오는 경우, 총 부동성 시간은 30 초입니다).
- 통계: 상대적으로 높은 개인 간 표준 편차 (아마도 케이지에서 수영 테스트로의 계층 구조 의존 행동의 전송으로 인해 발생)로 인해 동물에게 페어링 된 (페어링되지 않은) 파라 메트릭 테스트를 수행 할 동물을 표시하거나 레이블을 지정합니다. 정규성 분포를 평가하고 특정 질문에 따라 사후 t-검정 또는 쌍을 이룬 t-검정을 사용하여 분산 분석(ANOVA)을 수행하여 서로 다른 그룹을 비교합니다. 부동성 시간(들)의 절대값 또는 정규화된 값으로 분석을 수행합니다.
- 절대값: 1일째부터 5일째까지의 부동성 시간 및 시험일에 대한 평균 값을 SEM± 제공합니다( 그림 1A 참조). 1일과 5일째에 대한 평균 값을 비교하고, 바람직하게는 쌍을 이룬 t-검정을 사용하여 우울한 상태의 유도를 검증한다. 1일과 5일 사이에 유의한 차이가 있는 경우 5일의 평균값을 시험일의 평균 결과와 비교합니다. 한 실험에서 전형적인 그룹 크기가 6 ~ 10 마리의 동물인지 확인하고 야생형 동물에서 기준선과 유도 후 부동성 시간 사이에 상당한 차이가 있음을 기대하십시오. 기준선 차이로 인해 절대값이 사용되는 경우 쌍을 이루지 않은 t-검정과 서로 다른 그룹을 비교하는 것은 어렵습니다. 따라서 정규화된 값을 사용하십시오.
- 상대적/정규화된 값: 정규화를 통한 다양한 치료 효과를 5일째의 개별 결과와 비교한 다음 이 값을 5일의 백분율로 표현 합니다(그림 1B 참조).
- 제어 실험
참고: 수영 퍼포먼스는 운동과 관련이 있을 수 있습니다. 과잉 운동을 일으키는 물질은 위양성 결과 (즉, 부동성 시간의 감소)를 유발할 수 있습니다. 진정제뿐만 아니라 인위적으로 부동성 시간을 증가시킬 수 있습니다.- 수영 분석을 수행하기 전에 알려지지 않은 물질에 대한 운동 변화를 평가하십시오. 최소 10분 동안 별도의 동물 그룹에서 OFT(Open Field Test)를 사용합니다.
- CDM에서와 동일한 관찰 시간(10분)을 선택하여 높은 타당성을 갖는 부동성 시간의 측정을 통해 CDM 판독에 영향을 미칠 수 있는 시험된 화합물의 비특이적 하이퍼기관차 효과를 검출한다.
- 상당한 하이퍼 기관차 효과의 경우, 항우울 효능을 평가하기 위해 수영 세션을 평가하지 말고 다른 판독 방법 (예 : 자당 선호도, 꼬리 서스펜션 테스트 등)을 사용하십시오.
- 개념 증명
4. 우울한 상태의 발달에 대한 평가
- 우울 장애의 발달을 평가하기 위해, 유도 단계의 매일을 평가하여 부동성 시간을 측정하십시오.
참고: 이 경우, 매일 사이의 부동성 시간의 경미한 증가는 회복력을 나타내는 반면, 치료되지 않은 동물이나 야생형 동물에 비해 더 강하고 더 일찍 증가하면 스트레스로 인한 절망에 대한 취약성이 강화됩니다. 수영 이벤트 전에 마우스를 치료함으로써, 행동 절망의 발달에 관한 예방 개입 또는 트랜스제닉 마우스 라인을 평가할 수 있었다.
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Representative Results
CDM의 유도 단계의 첫 번째 수영 세션에서, 마우스는 일반적으로 190 초에서 230 초 사이의 평균 부동성 시간을 나타내며, 이는 추가 수영 세션마다 지속적으로 상승합니다 (그림 1A). 이 증가는 처음 3 일 동안 더 두드러지며 지난 2-3 일 동안 고원과 같은 단계에 도달합니다. 5 일째에 측정 된 부동성 시간은 최대 4 주 동안 안정적으로 유지되며 안정적인 행동 절망을 나타냅니다. 개입의 항우울제 효능은 유도 단계의 마지막 날과 시험일 사이의 동물을 치료함으로써 평가될 수 있다. 수영 세션 중 절대 득점 시간은 매우 주관적이며 실험자, 나이, 성별 및 사용 된 마우스 라인에 따라 다릅니다. 그러나 세션 간의 상대적 차이는 작은 인터레이터 차이만으로 상당히 안정적입니다.
그림 1에서는 몇 가지 대표적인 치료법이 나와 있습니다. 이미프라민, 수면 부족 및 케타민은 부동성 시간을 현저하게 감소시킨 반면, 수면 부족과 함께 회복된 수면은 우울한 표현형의 유의한 변화를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 적용된 치료법의 항우울 효능과 일치하며 인간 환자에서 관찰 된 효과와 유사합니다. 이 치료에는 식수를 통해 3 주 동안 이미프라민 20 mg / kg / day, 테스트 24 시간 전에 단일 복강 내 주사로 케타민 3 mg / kg, 검사 전 6 시간 동안 수면 부족을 섭취하는 것이 포함되었습니다.
연구 질문에 따라 다양한 표현이 표시 될 수 있습니다. 절대값을 표현하면 실제 데이터 개요를 제공할 수 있으며 유도 단계와 단일 처리를 잘 평가할 수 있습니다(그림 1A,D). 그러나 다양한 치료법의 차이점은 직접 비교할 수 없습니다. 따라서 각 치료 그룹은 5 일째에 부동성 시간의 평균 값이 다릅니다. 따라서 이 경우 정규화된 평균값의 표현을 사용하는 것이 좋습니다(그림 1B). 공간 제한으로 인해 축소된 표현을 선택할 수 있습니다(그림 1C). 적어도 1일, 5일째 및 시험일의 결과를 표시해야 합니다.
그림 1: 절대 및 정규화된 값의 성공적인 결과. (a) 30마리의 마우스에서 우울한 상태의 성공적인 유도가 관찰될 수 있다. 각 점은 특정 날짜에 단일 동물의 부동성 시간을 나타내고 막대는 시험된 동물의 평균 값을 나타냅니다. 부동성 시간은 유도 단계의 매일(제1일 내지 제5일) 및 시험일(점선 후)에 대해 치료 유무에 대해 표현된다. 이 샘플에서는 1일차와 2일 사이에 상당한 증가가 관찰될 수 있습니다. 일부 경우에, 유의 수준은 첫째로 1일째와 3일 사이에 달성된다. 실험을 계속하기 위해서는 1일차와 5일째 사이에 통계적으로 유의한 증가가 필수적이다. 일반적인 천장 효과에 유의하십시오 (4 일과 5 일의 차이와 비교하여 1, 2 및 3 일 사이의 증가). 5일째와 시험일 사이에, 동물들을 추가 처리(CDM) 없이 또는 이미프라민(Imip.)으로 처리하지 않고 그들의 홈 케이지에 4주 동안 수용하였다; 수면 부족 (SD); 수면 부족 및 회복 수면 (RS) 및 케타민 (Ket). (B) 개별 동물의 수행에 대한 예시적인 시간 과정이 매일 주어진다. (c) 도 1A에 이미 도시된 동일한 결과의 정규화된 표현. 각 동물 및 일의 부동성 시간을 5일째에 상응하는 부동성 시간으로 정규화하고 백분율로 표시하였다. 다른 그룹의 치료 후 값은이 접근법을 사용하여 더 잘 표시하고 비교할 수 있습니다. (d) 1일째, 5일째 및 시험일(CDM)에 대한 정규화된 값의 표현. 개념 증명 연구의 성공적인 후, 평가 시간 포인트는 첫날, 다섯 번째 날 및 시험 일로 단축 될 수 있습니다. 이러한 시점은 성공적인 유도를 입증하기 위해 1일째와 5일째 사이의 유의한 증가가 필요하고, 5일째는 치료 효능에 대한 진술을 제공하기 위해 시험일과 비교되어야 하기 때문에 필요하다. (e) 세 개의 상이한 마우스 라인의 부동성 시간의 비교: 야생형(WT)은 성공적인 유도를 나타내고; 예시적인 탄력선(RL)은 처음 사흘 및 시험 당일에 유의하게 감소된 우울증 유사 행동을 나타낸다. Bonferroni 사후 테스트를 사용한 단방향 ANOVA: ∗/#p < 0.05, ∗∗/##p < 0.01, ∗∗∗/###p < 0.001, ∗∗∗∗/####p < 0.0001. (#1일째의 평균값에 대한 차이를 나타내∗도 1A, C의 5일째 평균값과 그림 1E의 WT 마우스 라인에 대한 차이를 나타냄). 데이터는 SEM± 수단으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모든 5일 동안 변하지 않은 부동성 시간의 경우(그림 2), 가해진 스트레스는 행동을 적절하게 변화시킬 수 없었고, 치료 효과를 평가할 수 없었다; 동물을 희생시켜야하며 더 이상 사용해서는 안됩니다.
그림 2: 실패한 결과 비효율적 인 유도의 표현이 그림에 나와 있습니다. 1 일과 5 일 사이의 부동성 시간이 크게 증가하지 않습니다. 따라서 실험 지속에 대한 기준은 달성되지 않았으며 더 이상의 연장은 합리적이지 않습니다 (이 경우 수컷 마우스 만 테스트했으며 회고 조사 후 쓰레기가 아닌 것으로 나타났습니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동물의 행동 절망에 대한 더 넓은 견해를 설명하기 위해 더 많은 판독 방법을 사용해야합니다. 다양한 행동 테스트, 전기 생리학 측정 및 스트레스로 인한 변화에 대한 분자 평가가 가능합니다. 테일 서스펜션 테스트(TST), CDM, 이미프라민 및 케타민 처리, 노즈-포크-수크로오스 선호도 테스트(NPSPT) 및 패치-클램프 기술을 이용한 장기 효능 평가에 대한 예시적인 결과는 도 3에 제시되어 있다. 이러한 결과는 CDM 유도 단계를 행동 절망의 유도를위한 일반적인 도구로 사용하는 것이 좋습니다. 사용된 기술(TST, NPSPT, LTP-평가)에 대한 자세한 내용은 9,10,17,20을 참조하십시오.
그림 3: CDM 마우스를 사용한 추가 결과. (A) 꼬리 현탁액 시험에서 CDM의 효과에 대한 예시적인 표현. 마우스는 꼬리에 의해 정지되었고, 움직이지 않는 시간을 기록하였다(방법론적 세부사항은 참조9). 각 점은 단일 동물의 부동성 시간을 나타내고, 막대는 시험된 동물의 평균 값을 나타낸다. Bonferroni 포스트 혹시 테스트를 사용한 단방향 ANOVA: ∗∗∗p < 0.001. 데이터는 SEM± 의미로서 표현된다. (B) CDM 마우스에서 최근에 확립된 코포크스 수크로오스 선호도 시험의 대표적인 결과. 이 과제에서, 수크로오스 선호도는 수크로오스 병(노즈포크의 수)에 도달하기 위한 점진적인 증가 노력으로 측정되었다(방법론적 세부사항에 대해서는 참조10). CDM에서 슈크로스 선호도가 감소하였고, CDM과 대조군 마우스의 차이가 노력에 따라 점차 증가한다는 점에 유의하여(매일 코찌꺼기의 평균 값은 Nspk1-7로 나타남) 마우스는 달콤한 용액을 마시기 위해 적용해야 했다. Bonferroni 포스트 혹시 테스트를 사용한 양방향 ANOVA: ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001. 데이터는 SEM± 의미로서 표현된다. (C) 장기 시냅스 가소성의 CDM 의존적 변화는 WT 마우스의 해마 뇌 절편에서 연관 LTP 유도 프로토콜의 적용 후 EPSPs의 평균 값의 변화로서 제시된다. 데이터는 CA3-CA1 시냅스의 자극에 의해 얻어졌다(자세한 내용은 문헌 17,20). 쌍을 이루지 않은 t-test, ∗∗p < 0.01, 데이터는 SEM± 수단으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CDM 모델은 새로운 중재의 항우울 효능을 테스트하기위한 적절하고 확립 된 모델을 나타내며 우울증의 병리 생리학을 밝히기 위해 분자 또는 전기 생리학 실험을위한 연장 된 시간 창을 엽니 다. 특히 우울증과 같은 상태를 평가하기 위해 다른 테스트와 결합 할 때 CDM은 높은 얼굴 및 개념 타당성을 가지고 있습니다. 그것은 유도를위한 아만성 스트레스와 획득 된 무력감을 결합하고 오래 지속되는 우울한 상태를 만듭니다. 그것은 고전적인 항우울제의 단일 적용에 둔감하지만 아만성 적용에 반응하므로 인간의 상황을 모방합니다. 4 주간의 시간 창에서 다양한 종류의 항우울제, 비 침습적 뇌 자극, 수면 부족에서 신속하게 작용하는 항우울제 9,10,11에 이르기까지 다양한 항우울제 중재가 효능을 보여줍니다. 더욱이, 유도 단계 동안의 부동성 시간의 측정은 유도 단계 이전에 처리된 트랜스제닉 동물 또는 마우스를 시험하는 경우에 스트레스 탄력성 또는 취약성의 마커로서 사용될 수 있다. 대체로 CDM은 실험실 간의 비용, 기간, 표준화 및 재현성 측면에서 경제적입니다. 성능은 매우 단순 해 보이지만 "마우스를 물 용기에 떨어 뜨려 10 분 후에 꺼내십시오"- 합리적이고 안정적인 결과를 얻으려면 몇 가지 중요한 사항을 명심해야합니다. 대부분의 문제는 준비 또는 분석 중에 정확도가 부족하기 때문입니다.
일반적으로 경험되는 문제는 마우스, 특히 수컷이 유도 단계에서 부동성 시간의 현저한 증가를 나타내지 않는다는 것입니다. 이러한 경우, 마우스는 유도가 시작되기 전에 이미 스트레스를 받았을 수 있습니다. 따라서 수영 프로토콜 중 추가 스트레스가 절망의 관련 증가를 유발하지 않습니다. 부동성 시간은 1 일과 2 일 사이의 증가가 각각 2 일과 3 일 사이의 증가보다 크기 때문에 천장 효과가있는 것으로 보입니다. 3 일째 이후, 일반적으로 더 이상 중요한 증가를 기대할 수 없습니다. 과도한 기준선 스트레스에 대한 일반적인 이유는 동물의 최근 운송 또는 청소년/성인 남성 동물의 동거, 자연에서 결코 발생하지 않는 상태를 포함 할 수 있습니다. 따라서 실험자는 조심해야하며 동물이 쓰레기이며, 새로운 환경에 적응할 수있는 충분한 시간이 있으며, 실험이 시작되기 전에 물거나 이발사 할 징후가 없다는 것을 항상 확신해야합니다. 또한 동물의 체중을 매일 측정해야하며 체중 감량은 초기 체중의 20 %를 초과하지 않도록 제어해야합니다. 반복적 인 수영이 고갈되고 체중을 유지할 수없는 동물이이 피로로 인해 너무 많은 고통을 겪기 때문에 더 큰 체중 감량이 중요한 것으로 간주됩니다. 여기서 중요한 점은 너무 많은 피로로 고통받는 동물들이 시험 중에 10 분 동안 수영하거나 투쟁 할 수 없다는 것입니다. 그 동물들의 부동성 시간을 분석 할 때, 그들은 육체적 인 피로로 인해 거짓 부정적인 결과를 나타내는 경향이 있습니다.
특히 더 긴 치료 기간이 필요할 때 때때로 발생하는 또 다른 문제가되는 상황은 시험 평가에서 부동성 시간의 자발적인 감소입니다. 4 주 후, 부동성 시간은 일반적으로 유도 기간이 끝난 후 2 일 후에 수행 된 평가에 비해 감소합니다 (N.B. 이것은 다른 시간 척도를 사용하지만 우울한 에피소드가 일반적으로 자기 제한적인 인간의 상황에 상응합니다). 이 함정을 최소화하기 위해 동물의 집 케이지에 불필요한 중첩 재료가 적용되지 않도록 보장해야하며, 이는 효과적인 항우울 중재 (농축 된 환경)로 간주 될 수 있습니다. 또한 그룹 크기를 늘리면 분산을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요하다면, 추가적인 수영 세션은 위에서 설명된 표준 프로토콜의 수정으로서 추가될 수 있다. 예를 들어, 7 일 연속으로 5 회에서 일곱 번의 수영 세션으로 증가 할 수 있으며 동물의보다 안정적인 우울 상태를 가져와야합니다. 과도한 피로를 피하기 위해 개별 수영 세션의 지속 시간을 더 늘리는 것은 권장하지 않습니다.
과학계 내에서는 분석해야 할 가장 합리적인 기간에 대한 합의가 없다. 일부 그룹은 10 분 모두를 중요하게 생각하지만9,10, 다른 그룹은 처음 몇 분 동안의 행동이 급성 스트레스 상황을 나타내며 마지막 4 분 또는 6 분18 만 분석한다고 주장합니다. 후자의 가정은 주로 고전적인 FST의 평가 과정에서 일반적인 관행에서 파생됩니다. CDM에서 분석되어야 할 가장 합리적인 시간 프레임의 문제를 다루는 실험적 증거는 누락되었습니다. 다양한 고위급 간행물은 CDM9,10에서 전체 10분의 분석을 이용하였다.
자동화된 비디오 분석을 위한 상용 소프트웨어의 수가 증가하고 있음에도 불구하고, 훈련된 관찰자를 대체하기에 충분한 정확성을 입증한 설정은 없습니다. 대부분의 소프트웨어는 물속에서 생쥐의 운동 추적에 의존하며 위에서 카메라 위치가 필요합니다. 숙련 된 인간에 의한 평가는 운동뿐만 아니라 발 운동의 강도를 포함하여 더 복잡한 움직임의 의도를 가정 할 수 있다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 마우스는 몸을 돌리거나 미묘한 꼬리 움직임으로 머리를 물 위로 유지하기 위해 자주 움직이며, 소프트웨어는 일반적으로 수영으로 추적합니다. 또 다른 예는 짧은 거리에서 잦은 코를 찔러 넣는 것을 포함하여 선박의 유리 벽을 향한 움직임입니다. 수직 운동으로 탈출하려는 명확한 의도에도 불구하고이 소프트웨어는 작은 이동으로 인해 부동성을 자주 추적합니다. 그러나 정확하고 신뢰할 수있는 평가는 여전히 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 숙련 된 실험자가 평가자를 교육하고 두 명의 독립적 인 평가자가 샘플 비디오에 대한 공동 평가를 준비하여 일반적인 정의와 모호성을 논의하는 것이 좋습니다. 또한 CDM을 가진 실험실의 첫 번째 결과는 이전에 발표 된 다른 그룹의 결과와 비교되어야합니다.
CDM을 사용하는 연구자들은 증가 된 부동성이 피할 수 없지만 일시적인 스트레스가 많은 상황에 대한 마우스의 다소 지능적인 최종 에너지 절약 학습 반응이라는 개념을 자주 경험할 수 있습니다. 우리의 의견으로는, 이것은 생쥐의인지 유연성을 과대 평가합니다. 그러나 그것은 부동성 시간과 독립적 인 우울한 상태에 대한 추가 평가의 필요성을 강조합니다. 만성 경증 스트레스 테스트와 같은 우울증의 다른 잘 정립 된 동물 모델이 비슷한 결과를 낳는다고 주장 할 수 있습니다. 우울한 상태 또는 강한 스트레스 요인이 방해를 받으면 인간과 동물 모두에서 학습을 증가시키지 않습니다.17,20,26,27,28,29,30.
동물의 부담은 일반적으로 동물 연구 응용 프로그램에서 높은 것에서 극단적 인 것으로 평가됩니다. 실험 시리즈는 동물의 수를 최소화하기 위해 철저히 계획되어야하며, 동물은 수영 세션 전후에 신중하고 존중하여 다루어야합니다. 그러나 일부 국가에서는 CDM에 대한 동물 연구 허가를 취득하지 못할 수도 있습니다. CDM은 광범위한 중재의 항우울 효능의 평가와 비교적 안정한 우울 상태의 유도를 허용합니다. 인간의 주요 우울 장애의 이질성과 복잡성은 어떤 동물 모델에서도 복제 될 수 없습니다. 우울증의 대부분의 동물 모델은 생쥐에서 스트레스 유발 / 외상과 같은 경험을 기반으로하며, 어린 시절의 박탈, 복잡한 학습 이력 및 / 또는 사회 문화적 위험 요인이 중요한 것처럼 보이는 인간의 경우는 아닙니다. 따라서 우울증의 마우스 모델은 그들이 무엇인지로 인식되어야합니다 : 매우 복잡한 장애에 대한 단순화 된 모델. 그러나 적절하게 수행되고 여러 판독 방법이 사용되는 경우 CDM은 우울증 연구에서 새로운 통찰력과 목표를 찾는 데 적합한 도구입니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 University Clinic Freiburg, Department of Psychiatry and Psychotherapy 및 Berta-Ottenstein Program for Clinician Scientists (SV)의 내부 기금으로 자금을 지원했습니다. TS는 Medical Research Foundation (FRM) (AJE201912009450)과 University of Strasbourg Institute of Advance Studies (USIAS) (2020-035) 및 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), France의 보조금으로 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible |
| Digital Thermometer | Hanna Instruments | 846-4708 | any digital thermometer possible |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | any digital scale possible |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | any standard Personalcomputer possible |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | any high resolution camera possible |
| Stopwatch ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | any stopwatch possible |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | any timer possible |
References
- James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Aleman, A., Denys, D. Mental health: A road map for suicide research and prevention. Nature. 509 (7501), 421-423 (2014).
- Greenberg, P. E., Fournier, A. -A., Sisitsky, T., Pike, C. T., Kessler, R. C. The economic burden of adults with major depressive disorder in the United States (2005 and 2010). The Journal of Clinical Psychiatry. 76 (2), 155-162 (2015).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E.
- Porsolt, R. D., Le Pichon, M., Jalfre, M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 266 (5604), 730-732 (1977).
- Can, A., et al. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Chatterjee, M., Jaiswal, M., Palit, G. Comparative evaluation of forced swim test and tail suspension test as models of negative symptom of schizophrenia in rodents. ISRN Psychiatry. 2012, 595141 (2012).
- Reardon, S. Depression researchers rethink popular mouse swim tests. Nature. 571 (7766), 456-457 (2019).
- Serchov, T., et al. Increased signaling via adenosine A1 receptors, sleep deprivation, imipramine, and ketamine inhibit depressive-like behavior via induction of Homer1a. Neuron. 87 (3), 549-562 (2015).
- Holz, A., et al. Enhanced mGlu5 signaling in excitatory neurons promotes rapid antidepressant effects via AMPA receptor activation. Neuron. 104 (2), 338-352 (2019).
- Sun, P., et al. Increase in cortical pyramidal cell excitability accompanies depression-like behavior in mice: A transcranial magnetic stimulation study. Journal of Neuroscience. 31 (45), 16464-16472 (2011).
- Hellwig, S., et al. Altered microglia morphology and higher resilience to stress-induced depression-like behavior in CX3CR1-deficient mice. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 126-137 (2016).
- Serchov, T., Heumann, R., van Calker, D., Biber, K. Signaling pathways regulating Homer1a expression: implications for antidepressant therapy. Biological Chemistry. 397 (3), 207-214 (2016).
- van Calker, D., Serchov, T., Normann, C., Biber, K. Recent insights into antidepressant therapy: Distinct pathways and potential common mechanisms in the treatment of depressive syndromes. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 88, 63-72 (2018).
- Serchov, T., et al. Enhanced adenosine A1 receptor and Homer1a expression in hippocampus modulates the resilience to stress-induced depression-like behavior. Neuropharmacology. 162, 107834 (2020).
- Quitkin, F. M., Rabkin, J. G., Ross, D., Stewart, J. W. Identification of true drug response to antidepressants. Use of pattern analysis. Archives of General Psychiatry. 41 (8), 782-786 (1984).
- Normann, C., et al. Antidepressants rescue stress-induced disruption of synaptic plasticity via serotonin transporter-independent inhibition of L-type calcium channels. Biological Psychiatry. 84 (1), 55-64 (2018).
- Zanos, P., et al. NMDAR inhibition-independent antidepressant actions of ketamine metabolites. Nature. 533 (7604), 481-486 (2016).
- Alboni, S., et al. Fluoxetine effects on molecular, cellular, and behavioral endophenotypes of depression are driven by the living environment. Molecular Psychiatry. 22 (4), 552-561 (2017).
- Niehusmann, P., et al. Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 30 (18), 6225-6235 (2010).
- Schreiber, S. S., Tocco, G., Shors, T. J., Thompson, R. F. Activation of immediate early genes after acute stress. Neuroreport. 2 (1), 17-20 (1991).
- National centre for the replacement refinement and reduction of animals in research. , Available from: https://www.nc3rs.org.uk (2021).
- Loss, C. M., et al. Influence of environmental enrichment vs. time-of-day on behavioral repertoire of male albino Swiss mice. Neurobiology of Learning and Memory. 125, 63-72 (2015).
- Walker, W. H., Walton, J. C., DeVries, A. C., Nelson, R. J. Circadian rhythm disruption and mental health. Translational Psychiatry. 10 (1), 1-13 (2020).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Reports. 6 (10), 930-935 (2005).
- Holderbach, R., Clark, K., Moreau, J. -L., Bischofberger, J., Normann, C. Enhanced long-term synaptic depression in an animal model of depression. Biological Psychiatry. 62 (1), 92-100 (2007).
- Nissen, C., et al. Learning as a model for neural plasticity in major depression. Biological Psychiatry. 68 (6), 544-552 (2010).
- Kuhn, M., et al. State-dependent partial occlusion of cortical LTP-like plasticity in major depression. Neuropsychopharmacology. 41 (6), 1521-1529 (2016).
- Schwabe, L. Stress and the engagement of multiple memory systems: integration of animal and human studies. Hippocampus. 23 (11), 1035-1043 (2013).
- Ballan, R., Gabay, Y. Does acute stress impact declarative and procedural learning. Frontiers in Psychology. 11, 342 (2020).
