Summary
Het geïsoleerde konijnenlongpreparaat is een gouden standaardinstrument in longonderzoek. Deze publicatie heeft tot doel de techniek te beschrijven zoals ontwikkeld voor de studie van fysiologische en pathologische mechanismen die betrokken zijn bij luchtwegreactiviteit, longbehoud en preklinisch onderzoek bij longtransplantatie en longoedeem.
Abstract
Het geïsoleerde longperfusiesysteem is veel gebruikt in longonderzoek en draagt bij aan het ophelderen van de innerlijke werking van de longen, zowel micro- als macroscopisch. Deze techniek is nuttig bij de karakterisering van longfysiologie en pathologie door metabole activiteiten en ademhalingsfuncties te meten, inclusief interacties tussen circulerende stoffen en de effecten van geïnhaleerde of doordrenkte stoffen, zoals bij het testen van geneesmiddelen. Terwijl in vitro methoden het snijden en kweken van weefsels omvatten, maakt het geïsoleerde ex vivo longperfusiesysteem het mogelijk om te werken met een volledig functioneel orgaan dat de studie van een continue fysiologische functie mogelijk maakt terwijl ventilatie en perfusie worden gerecreëerd. Er moet echter worden opgemerkt dat de effecten van de afwezigheid van centrale innervatie en lymfedrainage nog steeds volledig moeten worden beoordeeld. Dit protocol heeft tot doel de assemblage van het geïsoleerde longapparaat te beschrijven, gevolgd door de chirurgische extractie en cannulatie van longen en hart van proefdieren, evenals om de perfusietechniek en signaalverwerking van gegevens weer te geven. De gemiddelde levensvatbaarheid van de geïsoleerde long varieert tussen 5-8 uur; tijdens deze periode neemt de pulmonale capillaire permeabiliteit toe, waardoor oedeem en longletsel ontstaan. De functionaliteit van geconserveerd longweefsel wordt gemeten aan de hand van de capillaire filtratiecoëfficiënt (Kfc), die wordt gebruikt om de mate van longoedeem door de tijd heen te bepalen.
Introduction
Brodie en Dixon beschreven het ex-vivo longperfusiesysteem voor het eerst in 1903 1. Sindsdien is het een gouden standaardinstrument geworden voor het bestuderen van de fysiologie, farmacologie, toxicologie en biochemie van de longen2,3. De techniek biedt een consistente en reproduceerbare manier om de levensvatbaarheid van longtransplantaties te evalueren en om het effect van ontstekingsmediatoren zoals histamine, arachidonzuurmetabolieten en stof P te bepalen, evenals hun interacties tijdens longverschijnselen zoals bronchoconstrictie, atelectase en longoedeem. Het geïsoleerde longsysteem is een belangrijke techniek geweest bij het onthullen van de belangrijke rol van de longen bij de eliminatie van biogene amines uit de algemene circulatie4,5. Daarnaast is het systeem gebruikt om de biochemie van pulmonale surfactant6 te evalueren. In de afgelopen decennia is het ex-vivo longperfusiesysteem uitgegroeid tot een ideaal platform voor longtransplantatieonderzoek7. In 2001 beschreef een team onder leiding van Stig Steen de eerste klinische toepassing van het ex-vivo longperfusiesysteem door het te gebruiken om de longen van een 19-jarige donor te reconditioneren, die aanvankelijk werd afgewezen door transplantatiecentra vanwege zijn verwondingen. De linkerlong werd geoogst en gedurende 65 minuten doordrenkt; daarna werd het met succes getransplanteerd in een 70-jarige man met COPD8. Verder onderzoek naar longreconditionering met behulp van de ex-vivo perfusie leidde tot de ontwikkeling van de Toronto-techniek voor verlengde longperfusie om gewonde donorlongen te beoordelen en te behandelen9,10. Klinisch gezien is gebleken dat het ex-vivo longperfusiesysteem een veilige strategie is om donorpools te vergroten door substandaard donorlongen te behandelen en te reconditioneren, zonder significant verschil in risico's of uitkomsten ten opzichte van standaardcriteriadonoren10.
Het belangrijkste voordeel van het geïsoleerde longperfusiesysteem is dat de experimentele parameters kunnen worden geëvalueerd in een volledig functioneel orgaan dat zijn fysiologische functie behoudt onder een kunstmatige laboratoriumopstelling. Bovendien maakt het de meting en manipulatie van pulmonale mechanische ventilatie mogelijk om de componenten van de longfysiologie te analyseren, zoals luchtwegweerstand, totale vasculaire weerstand, gasuitwisseling en oedeemvorming, die tot op heden niet precies in vivo op proefdieren kunnen worden gemeten2. Met name de samenstelling van de oplossing waarmee de long wordt geperfuseerd, kan volledig worden gecontroleerd, waardoor de toevoeging van stoffen in realtime hun effecten kan evalueren en monsterverzameling uit perfusie voor verder onderzoek11. Onderzoekers die met het geïsoleerde longsysteem werken, moeten in gedachten houden dat mechanische ventilatie verval van het longweefsel veroorzaakt, waardoor de nuttige tijd wordt verkort. Deze progressieve daling van de mechanische parameters kan aanzienlijk worden vertraagd door de longen af en toe te hyperinflateren tijdens de tijd van het experiment4. Toch kan de voorbereiding meestal niet langer dan acht uur duren. Een andere overweging voor het ex-vivo longperfusiesysteem is de afwezigheid van regulatie van het centrale zenuwstelsel en lymfedrainage. De effecten van hun afwezigheid zijn nog niet volledig begrepen en kunnen mogelijk een bron van vooringenomenheid zijn in bepaalde experimenten.
De geïsoleerde longperfusiesysteemtechniek kan in het konijnenmodel worden uitgevoerd met een hoge mate van consistentie en reproduceerbaarheid. Dit werk beschrijft de technische en chirurgische procedures voor de implementatie van de ex-vivo geïsoleerde longperfusietechniek zoals ontwikkeld voor het konijnenmodel aan het Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias in Mexico-Stad, met de bedoeling de inzichten te delen en een duidelijke gids te bieden voor de belangrijkste stappen in de toepassing van dit experimentele model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het geïsoleerde perfusiesysteem in het konijnenmodel is veel gebruikt in het Bronchiale Hyperresponsiviteitslaboratorium van het Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Het protocol omvat Nieuw-Zeelandse konijnen met een geschat gewicht van 2,5-3 kg. Alle dieren werden gehouden in standaard vivariumomstandigheden en ad libitum voeding in overeenstemming met de officiële Mexicaanse richtlijnen voor proefdieren (NOM 062-ZOO-1999) en onder de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e editie, 2011). Alle dierprocedures en dierverzorgingsmethoden die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn eerder goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
OPMERKING: De voorbereiding van het geïsoleerde longperfusiesysteem omvat de opzettelijke dood van een dier onder anesthesie en via euthanasie.
1. Uitrusting en voorbereiding van apparatuur.
- Uitrusting:
- Stel een operatietafel in met grootte op basis van het gewicht van het konijn.
- Monteer het deksel van de kunstmatige thorax op de stalen kolom met de glazen kamer eronder en de ventilator met een rolpomp aan de zijkanten.
- Zorg ervoor dat de hoes gemakkelijk kan worden gebruikt om de tracheale canule in lijn met de luchtpijp te hebben om een snellere verbinding mogelijk te maken.
- Kunstmatige thorax:
OPMERKING: Het is een essentieel onderdeel van het systeem. Het bestaat uit een glazen kamer met wateromhulsel die is afgedicht door een speciale hoes. De hoes werkt als de orgaanhouder met de verbindingen om de luchtpijp en de daarin ingebedde vaten te cannuleren.- Stel een venturijet in die wordt bediend door perslucht om de onderdruk in de kunstmatige thorax te genereren.
OPMERKING: De ventilatieregelmodule (VCM) maakt afzonderlijke aanpassingen van inspiratoire en eind-expiratoire drukken mogelijk, evenals de ademhalingsfrequentie en de verhouding tussen de inspiratoire duur en de totale cyclusduur.
- Stel een venturijet in die wordt bediend door perslucht om de onderdruk in de kunstmatige thorax te genereren.
- Apparaat:
- Zorg ervoor dat een normaal werkend apparaat bestaat uit een stalen hoofdkolom die is gemonteerd op een bodemplaat waarop de kunstmatige thorax is vastgehouden, met de pneumotachometer en de gewichtsopnemer erboven en achter de voorverwarmingsspiraal met een bellenvanger.
- Sluit een verschildrukomvormer aan op de pneumotachometer en een andere op de kamerdruk. Stel een ander paar drukomvormers achter de thorax in om perfusie en veneuze druk te meten.
- Sluit de wisselvoorraad onder de oxygenator aan op een niveau-elektrode en het ventilatiesysteem naast het apparaat.
2. Chirurgische extractie van het cardiopulmonale blok.
- Anesthesie:
- Gebruik een combinatie van een kalmerend middel (xylazine) en een barbituraat (pentobarbital).
OPMERKING: Verschillende anesthetische cocktails kunnen worden gebruikt zonder effect op experimentele resultaten. - Verdoof eerst de gezonde Nieuw-Zeelandse konijnen met een enkele intramusculaire injectie van xylazinehydrochloride (3-5 mg / kg). Zorg ervoor dat de konijnen kalm en ontspannen blijven om verdere manipulatie na een paar minuten van de injectie mogelijk te maken.
- Gebruik na sedatie de marginale (laterale) ooraders als toegang om de konijnen te verdoven met een intraveneuze injectie van pentobarbital natrium (28 mg/kg).
- Gebruik een combinatie van een kalmerend middel (xylazine) en een barbituraat (pentobarbital).
- Monitoring:
- Om onvoldoende anesthesie of overmatige depressie van hart- en ademhalingsfuncties te voorkomen, controleert u de volgende parameters. Om de diepte van de anesthesie te beoordelen, voert u een teenknijptest uit.
- Zorg ervoor dat het slijmvlies roze is. Blauwe of grijze tinten duiden op hypoxie.
- Zorg ervoor dat de hartslag tussen de 120-135 slagen/min ligt en dat de lichaamstemperatuur niet onder de 36,5 °C daalt.
- Plaatsing van dieren:
- Scheer de romp van het konijn en leg het dier in rugligging op de operatietafel. Plaats het ventilatiesysteem in de buurt van de tafel, achter het hoofd van het konijn, om de canule snel na tracheotomie aan te sluiten om tissulaire schade te voorkomen.
- Incisie en tracheotomie:
- Ontleed de huid met een ventrale mediane lijnincisie van 3-5 cm van het middenrif tot aan de nek.
- Knip met de operatieschaar de voorste 2/3 van de luchtpijp tussen twee kraakbeenringen om de tracheale canule door het tracheale vezelige membraan te steken.
- Plaats een 5 mm (buitendiameter; OD) tracheale canule door het tracheale vezelige membraan en gebruik een 4-0 zijden hechtdraad om het zorgvuldig te fixeren.
- Plaats een tang of pincet onder de luchtpijp om ervoor te zorgen dat de canule niet tegen de luchtpijp buigt.
- Overdrukventilatie:
- Zolang de longen buiten de kunstmatige thorax blijven, gebruikt u een kleine soort ademhalingspomp om een positieve druk te ventileren om longinstorting tijdens de operatie te voorkomen.
- Start de beademing via de tracheale canule die is aangesloten op de ademhalingspomp snel na tracheotomie en voordat de thorax wordt geopend.
- Stel het getijdenvolume in op 10 ml/kg.
OPMERKING: Afhankelijk van de experimentopstelling en het kunstmatige thoraxmodel, moet u positieve drukventilatie bieden door dezelfde ventilatiepomp die wordt gebruikt om negatieve druk te leveren of een andere, waardoor een snelle herkansing mogelijk is.
- Thoracotomie en exsanguinatie:
- Om toegang te krijgen tot de thoracale holte, gebruikt u een scalpel of schaar om de thoraxwand te openen en voert u een mediale sternotomie uit tot aan het bovenste derde deel van de thorax.
- Houd de thoraxhelften open met twee retractors. Verschillende longflappen omringen meestal het hart.
- Lokaliseer de superieure en inferieure vena cava en verwijs ze door met draden.
- Voorafgaand aan de exsanguinatie van het dier, identificeert u de juiste ventrikel en injecteert u 1000 UI / kg heparine.
- Onmiddellijk na de injectie ligaat u de superieure en inferieure vena cava met de voorgelussen draad en voert u exsanguinatie uit.
- Hart-long oogst:
- Oogst het cardiopulmonale blok voorzichtig en snel. Gebruik directe digitale dissectie of veerschaar om het bindweefsel te scheiden om de longen van de thorax te verwijderen.
- Ontleed de vasculatuur in het gebied, evenals de slokdarm.
- Snijd door het manubrium sterni om de mediale sternotomie uit te breiden naar de tracheale canule, waardoor de luchtpijp aan beide zijden vrijkomt van verbindingsweefsel.
- Reseceer nu de luchtpijp boven de tracheale canule. Trek de canule voorzichtig omhoog in een craniocradale as terwijl de dorsale fixatie van de luchtpijp en longen wordt gereseceerd.
- Cannulatie:
- Til de geïsoleerde longen uit de thorax en plaats ze voorzichtig over een steriel gaasje op een petrischaaltje.
- Om atelectase te voorkomen, ventileer de longen met behulp van positieve drukventilatie met positieve eind-expiratoire druk (PEEP) ingesteld op 2 cmH2O.
- Verwijder de ventrikels door ze van het hart af te snijden ter hoogte van de atrioventriculaire groef.
- Na het openen van de twee ventrikels, introduceert u de OD 4,6 mm longslagadercanule voor het konijn met een mand door de longslagader en introduceert u de OD 5,9 mm linker atriumcanule voor het konijn met de mand door de mitralisklep in het linker atrium.
- Gebruik een 4-0 zijden hechtdraad in de longslagader en het linkeratrium om de canules te fixeren. Neem de omliggende weefsels op in de ligaturen van de longslagader en het linkeratrium om het optrekken van deze structuren te voorkomen.
- Injecteer 250 ml zoutoplossing isotone oplossing door de arteriële canule om het resterende bloed uit het vaatbed te spoelen.
3. Perfusietechniek.
- Setup:
- Plaats de geïsoleerde longen voorzichtig in de longkamer.
- Bevestig de luchtpijp aan de transductor op het deksel van de kamer.
- Sluit de cannulated vaten aan op het perfusiesysteem.
- Sluit de kamer en zet deze vast met het roterende slot.
OPMERKING: Het recirculerende perfusiecircuit bestaat uit een open veneus reservoir, een peristaltische pomp, een warmtewisselaar en een bellenvanger. - Bevestig op dit punt het kamerdeksel en schakel een stopkraan om over te schakelen van positieve naar negatieve drukventilatie. Om de onderdrukventilatie van de longen en de luchtdichte sluiting van de kamer te controleren, inspecteert u de ademhalingsexcursie van de long- en kamerdruk op de manometer.
- Perfundeer de longen met 200 ml kunstmatig bloedvrij perfusaat (een Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer met 2,5% runderalbumine).
- Start de perfusaatstroom bij 3 ml/min/kg en voer de stroom vervolgens langzaam op over een periode van 5 minuten tot 5 ml/min/kg. Bereik een debiet van 8 ml/min/kg in de komende 5 minuten en bereik dan na nog een periode van 5 minuten een maximale flux van 10 ml/min/kg. Zorg ervoor dat er geen lucht in het circuit komt.
OPMERKING: Houd de pH en de temperatuur van het perfusaat binnen fysiologische bereiken (pH 7,4-7,5; temperatuur, 37 °C-38 °C). Om de pH aan te passen, voegt u NaHCO3 (1N) toe of verhoogt u de stroom koolstofdioxide. U kunt ook HCl (0,1N) gebruiken om te verzuren.
- Parameters:
- Controleer of de vooraf bepaalde perfusie- en ventilatieparameters naar wens zijn ingesteld.
- Ventileer de longen met bevochtigde lucht met een frequentie van 30 bpm, een getijdenvolume van 10 ml / kg en een eind-expiratoire druk (Pe) van 2 cmH2O.
OPMERKING: De pulmonale arteriële druk (0-20 mmHg) komt overeen met de hoogte van het vloeistofniveau in de oxygenator of het reservoir in centimeters boven de pulmonale romp, terwijl de pulmonale veneuze druk overeenkomt met de hoogte van de drukevenwichtkamer boven het linkeratrium. Beide waarden kunnen worden gewijzigd. Merk op dat de druk van het linkeratrium ook 0-20 mmHg is.
- Het bereiken van zone 3 voorwaarden:
- Gebruik de twee katheters die zijn aangesloten op zijpoorten van de canule die zijn vastgezet in de longslagader, het linkeratrium en drukomvormers om de arteriële (Pa) en veneuze (Pv) druk te meten.
- Stel de basislijndruk in op het niveau van het long hilum (nulreferentie).
- Voer de experimenten uit onder zone 3 ventilatieomstandigheden. Om dit te bereiken, wacht u 10-15 minuten om een evenwicht te verkrijgen dat wordt gekenmerkt door een isogravimetrische toestand.
- Zorg ervoor dat de veneuze druk hoger is dan de alveolaire druk (Palv) en dat de arteriële druk hoger blijft dan beide (Pa > Pv > Palv) voor zone 3-omstandigheden.
- Zorg ervoor dat het gewicht van de longen constant blijft en dat de arteriële en linker atriale druk stabiel is om zone 3-omstandigheden te bereiken om een maximaal aantal longvaten te openen en de microvasculaire bedinhoud tijdens het experiment te behouden.
OPMERKING: De meting van Kfc als indicator van longoedeem heeft geen variatie tussen een handmatig en een automatisch perfusiesysteem.
- Elektronische besturing en signaalverwerking: Zorg ervoor dat onder andere de ademhalingsstroom, gewichtsveranderingen, microvasculaire druk, getijdenvolume, vasculaire weerstand worden geregistreerd op een meervoudige centrale elektronica-eenheid die signalen van de transducers integreert en weergeeft op het evaluatiesysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het geïsoleerde longperfusiesysteem maakt orgaanmanipulatie mogelijk voor biopsie, monsterverzameling van perfusie en real-time gegevensverzameling van fysiologische parameters. Het geïsoleerde systeem kan worden gebruikt om veel hypothesen te testen met betrekking tot verschillende functies en longverschijnselen, van metabole en enzymatische activiteit tot oedeemvorming en conserveringsperioden voor longtransplantaties.
Figuur 1 toont een diagram van het volledig geassembleerde geïsoleerde longperfusiesysteem, samen met het ventilatiesysteem en de berekende gegevensverzameling. De perfusiecomponent van het systeem zorgt ervoor dat het perfusaat constant door de geïsoleerde longen stroomt. De longslagader is gecannuleerd om instroomperfusie te bieden, terwijl perfusaatuitstroom wordt geleverd door het linkeratrium van het hart te cannuleren. Het perfusaat wordt met behulp van de rolpomp geleid, zodat perfusaat door de warmtewisselaar gaat, vervolgens door de bellenvanger in de longslagader en uiteindelijk in het longvaatsbed. De ventilatiecomponent van het systeem zorgt ervoor dat het ventilatiemedium constant langs het distale uiteinde van de pneumotachometer rechtstreeks via de tracheale canule in de longen stroomt.
Figuur 2 toont de concentratie MAO (figuur 2A) en 5-HT (figuur 2B) in een geïsoleerde long die bewaard is gebleven bij 4 °C tot 24 uur. Serotonine- en monoamineoxidasespiegels werden bepaald uit intravasculaire vloeistofmonsters die op verschillende tijdstippen werden verkregen en geanalyseerd door ELISA. De 5-HT-concentratie piekte na 15 minuten conservering en nam vervolgens af gedurende de volgende 6 uur. Daarna vertoonden de perfusieniveaus een niet-statistisch significante toename tot het 24e uur. MAO-niveaus vertoonden een vergelijkbaar gedrag, piekend na 15 minuten conservering en vervolgens afnemend gedurende de volgende zes uur tot het 24e uur12. Figuur 3 toont 5-HT- en MAO-afgiftesnelheden, uitgedrukt als een percentage van de beginwaarde, gemeten tot 24 uur in een geïsoleerd longpreparaat bij 4 °C. Tijdens het eerste uur van conservering stegen de 5-HT-niveaus hoger dan MAO en daalden binnen 6 uur na herovering door endotheelcellen en bloedplaatjes, evenals MAO-gemedieerd katabolisme12.
Figuur 4 toont NEP (optische dichtheden/mg eiwit/min) en ACE-enzymatische activiteit (optische dichtheden/mg eiwit/min) door de tijd heen in een geïsoleerd longpreparaat. NEP-activiteit (figuur 4A) werd bepaald door spectrofotometrische analyse met behulp van N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly als NEP-substraat gevolgd door enalapril-toevoeging om ACE te remmen. ACE-activiteit (figuur 4B) werd bepaald door spectrofotometrische analyse met enalapril als ACE-substraat, gevolgd door fosforamidontoevoeging om NEP te remmen. Aangezien beide oplossingen enalapril bevatten, werd de ACE-activiteit berekend als het verschil in fluorescentie tussen monsters met en zonder enalapril13.
Figuur 5 toont het effect van longconservering op capillaire permeabiliteit (mKfc) gedurende een periode van 24 uur in het geïsoleerde longperfusiesysteem in het konijnenmodel. Een controlegroep (n = 6), onmiddellijk na het oogsten beoordeeld, had een mKfc van 2,8 ± 0,8 (ml / min / cmH2O / g) standaardfout, daarentegen leed de geperfuseerde long een progressieve toename op mKfc met een score van 7,5 ± 1,4 (n = 6) bij 6 uur, 10,8 ± 2,3 (n = 6) na 12 uur en bereikte 16,3 ± 2,5 (n = 6) na 24 uur conservering13.
Figuur 6 toont het effect van verschillende additieven op de capillaire permeabiliteit van het geïsoleerde longperfusiesysteem onder uiteenlopende omstandigheden. Een plotselinge drukverhoging van 10 cmH2O wordt gegenereerd door een gedeeltelijke obstructie van de veneuze uitstroom om de permeabiliteit van het capillaire bed door de capillaire filtratiecoëfficiënt (Kfc) te meten. Om de Kfc te meten, werd de uitstroombuis die uit de linker ventrikel naar het Krebs-reservoir gaat gedeeltelijk geklemd. Vervolgens werd de gedeeltelijke klem gedurende 3 minuten gehandhaafd om ervoor te zorgen dat de drukverhoging 10 cmH2O bereikte. Het klemmen werd losgelaten en de normale stroming ging door. Deze manoeuvre werd geregistreerd als een toename van de arteriële druk en een longgewichtsvergroting. Deze laatste parameter wordt beschouwd als de Kfc.
Figuur 1: Diagram voor het geïsoleerde longperfusiesysteem. Dit cijfer is aangepast van Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Concentratie van serotonine (5-HT) en monoamineoxidase (MAO) betrokken bij longmetabolisme en vasculaire permeabiliteit. De concentratie van (A) MAO en (B) 5-HT in een geïsoleerde long bewaard bij 4°C tot 24 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afgiftesnelheden van serotonine (5-HT) en monoamineoxidase (MAO). De afgiftesnelheden van 5-HT en MAO, uitgedrukt als een percentage van de beginwaarde, gemeten tot 24 uur in een geïsoleerd longpreparaat bij 4 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Enzymatische activiteit van Neutraal endopeptidase (NEP) en Angiotensine-converterend enzym (ACE). Enzymatische activiteit van (A) NEP en (B) ACE door de tijd heen in een geïsoleerde long bewaard bij 4 °C tot 24 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effect van longconservering in capillaire permeabiliteit (mKfc). De gegevens tonen het effect van longbehoud in capillaire permeabiliteit (mKfc) gedurende een periode van 24 uur in het geïsoleerde longperfusiesysteem in het konijnenmodel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Effect van verschillende additieven op de capillaire permeabiliteit. Het effect van verschillende additieven in de capillaire permeabiliteit van het geïsoleerde longperfusiesysteem onder verschillende omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk geeft een algemeen beeld van het geïsoleerde longperfusiesysteem, een essentiële techniek in longfysiologisch onderzoek. Het geïsoleerde longperfusiesysteem biedt een grote mate van veelzijdigheid in zijn toepassingen en maakt de evaluatie mogelijk van verschillende parameters die relevant zijn voor het testen van een breed scala aan hypothesen15. Een geïsoleerd longsysteem is een hulpmiddel met wereldwijde aanwezigheid dat in het afgelopen decennium zijn relevantie voor orgaanspecifieke evaluaties verder heeft vastgesteld en ook zijn bruikbaarheid heeft uitgebreid als een uitbreiding van state-of-the-art technologieën en nieuwe therapieën met mesenchymale stamcellen16 en CRISPR / Cas9-genoomtechnologie17, onder anderen. De huidige ex vivo longperfusieonderzoeksgebieden omvatten in grote lijnen ontstekingsremmende strategieën, ventilatieletselbeheer en -preventie, anti-afstotingsbehandeling en anti-pulmonale oedeemprestaties15.
Een goede montage van het apparaat is vereist om een correcte gegevensverzameling te garanderen. Zoals te zien is in figuur 1 bestaat het hele systeem uit een natte onderdrukkamer die is bevestigd aan een ventilatiesysteem en een perfusiesysteem dat respectievelijk de ademhalings- en bloedsomloopfuncties van de longen nabootst. Beide systemen zijn verbonden met een data-acquisitiesysteem dat de toevoeging van meetapparatuur mogelijk maakt die kan worden aangepast aan de behoeften van elk protocol. Het chirurgische proces van het oogsten van het cardio-pulmonale blok moet snel worden uitgevoerd, bij voorkeur door ervaren personeel, om extra weefselbeschadiging te voorkomen om de long zo intact mogelijk te houden, zodat de fysiologische functie tijdens het experiment zonder verdere interferentie kan worden voortgezet. Het systeem maakt ook real-time perfusiemonsterverzameling mogelijk die kan worden gebruikt om het effect van bepaalde moleculen in verschillende longfuncties te bepalen (bijvoorbeeld heparine-effect op longbehoud).
Om een goede verdeling van de perfusiestroom over longvaten, namelijk haarvaten, te bereiken, moeten zone 3-omstandigheden worden verkregen. Zone 1-omstandigheden worden gedefinieerd als het gebied waar de arteriële druk onder de alveolaire druk daalt en meestal de atmosferische druk nadert. Wanneer dit gebeurt, worden de haarvaten afgeplat, waardoor bloed of perfusiestroom onmogelijk wordt. Onder normale omstandigheden kan zone 1 niet bestaan, omdat de arteriële druk voldoende is om de stroomverdeling te garanderen. Zone 1-omstandigheden kunnen echter optreden als de arteriële druk daalt of de alveolaire druk toeneemt (zoals tijdens positieve drukventilatie). Zone 1-omstandigheden leiden tot een onbegeleide geventileerde long die niet in staat is om een gasuitwisseling uit te voeren. In zone 2-omstandigheden is de arteriële druk hoger dan de alveolaire druk. De veneuze druk blijft echter onder de alveolaire druk, wat resulteert in een perfusiestroom die wordt bepaald door het verschil tussen arteriële en alveolaire druk. Dit gedrag kan worden gemodelleerd met behulp van een Spreeuwweerstand. Zone 3-omstandigheden worden bepaald door het verschil tussen arteriële en veneuze druk. De toename van de perfusiestroom in zone 3 treedt op omdat de haarvaten opzwollen, waardoor de opening van een maximaal aantal longvaten wordt geconditioneerd.
De eenheid van het systeem bestaat uit zeven modules: twee analoge transducerversterkermodules (TAM-A) uitgerust met een analoog LED-staafdiagramsignaal om dynamische signalen (bloeddruk, ademhalingsluchtstroom, contractiekracht, enz.) te bewaken, één digitale transducerversterkermodule (TAM-D) met een digitaal numeriek display dat is ontworpen om langzaam veranderende pulsatielesignalen te bewaken; een servoregelaar voor perfusiemodule (SCP) die samenwerkt met TAM-A- en TAM-D-versterkers voor perfusiecontrole van geïsoleerde orgaanperfusies met behulp van de peristaltische pomp, de pompsnelheid kan in constante drukmodus worden ingesteld of handmatig worden geregeld via het SCP; een oedeembalansmodule (EBM) die het longgewicht meet; een ventilatieregelmodule (VCM) om positieve en negatieve drukventilatie te regelen, en een timertellermodule (TCM) die kan worden ingesteld om de VCM te activeren om diepe inspiratiecycli uit te voeren.
De hoge wereldwijde prevalentie van pulmonale en respiratoire aandoeningen en de beperkingen van de huidige therapeutische opties dwingen tot een grotere vraag naar longtransplantaties, omdat het de gouden standaardbehandeling blijft voor patiënten met terminale longziekte18. Het ex-vivo longperfusiesysteem is een uitstekend platform om gerichte therapieën te testen in zowel fundamenteel als klinisch onderzoek. Op klinisch niveau kan het ex-vivo perfusiesysteem worden gebruikt om transplantaatweefsel buiten het lichaam te evalueren, waardoor het geïsoleerde orgaan vóór de transplantatie kan worden getest, waardoor klinische gegevens worden verzameld voor een nauwkeuriger prognostiek over de effectiviteit van de transplantatie. Rationeel gebruik van het geïsoleerde longperfusiesysteem zou kunnen helpen bij het optimaliseren van longtransplantatiechirurgie, waardoor ze een veiligere en meer electieve procedure worden. Het geïsoleerde longmodel is ook nuttig in het fundamenteel onderzoek van geavanceerde diagnose- en therapietechnieken zoals instillatie van mesenchymale stamcellen en andere immuungemedieerde therapieën; veel rapporten hebben het potentieel aangetoond van de ex-vivo perfusietechniek als een platform om verder onderzoek te doen naar longbehoud bij de ontwikkeling van technieken om ischemie-reperfusieletsel en longoedeem te voorkomen, waardoor de levensvatbaarheid van het orgaan wordt verlengd15. Enkele stappen en beperkingen in verband met het geïsoleerde longmodel zijn voornamelijk de korte beschikbare tijd van deze techniek voor mogelijke oedeemgeneratie geïnduceerd door lymfedafvoerbeperking en het systemische effect van de techniek. De bepaling van de capillaire filtratiecoëfficiënt (Kfc) is een betrouwbaar criterium om de functionaliteit van geconserveerd longweefsel te meten en de mate van oedeem door de tijd heen vast te stellen. Er is geen verschil gevonden tussen de handmatige en automatische bepalingen van Kfc19.
Naarmate het gebruik van het geïsoleerde longperfusiesysteem populariseert en nieuwe therapieën het klinische landschap veranderen, wordt de ex-vivo perfusietechniek een keuzekeuze om de resultaten van patiënten in verschillende longpathologieën te verbeteren en de pool van potentiële longdonoren te vergroten zonder de veiligheid van de ontvanger in gevaar te brengen, wat een nieuw tijdperk in longbehoud en longtransplantatie belooft. De opkomst van de Covid-19-pandemie en de toename van de prevalentie van COPD18,20 in de wereldbevolking benadrukt de noodzaak van verder fundamenteel onderzoek naar longfysiologie, longbehoud en longtransplantatie, evenals preklinisch onderzoek van nieuwe therapieën met het oog op translationele geneeskunde. Bovendien is het ex-vivo konijnenmodel een toegankelijk en praktisch model om bewoners en studenten te trainen op het gebied van pulmonologie, met name degenen die betrokken zijn bij thoracale chirurgie en ECMO. Elk laboratorium dat betrokken is bij respiratoire of thoracopulmonale onderzoeksprotocollen wordt aangemoedigd om het geïsoleerde longperfusiesysteem te beschouwen als onderdeel van hun dagelijkse hulpmiddelen voor hun experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Ph.D. Bettina Sommer Cervantes bedanken voor haar steun bij het schrijven van dit manuscript, en Kitzia Elena Lara Safont voor haar steun bij de illustraties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
