Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63008
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

Summary

هذه المادة تفاصيل بروتوكول لتحديد سريع من indels الناجمة عن CRISPR / Cas9 واختيار خطوط متحولة في Aedes aegypti البعوض باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة.

Abstract

أصبح تحرير الجينات البعوض روتينية في العديد من المختبرات مع إنشاء نظم مثل النسخ المنشط مثل النوى تأثير (TALENs)، نواة الزنك إصبع (ZFNs)، وتوجيه الإندونوكلياس (HEs). وفي الآونة الأخيرة، قدمت تكنولوجيا البروتين 9 (Cas9) المترابطة بانتظام القصيرة المترابطة (CRISPR)/CRISPR المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) بديلا أسهل وأرخص لهندسة الجينوم الدقيقة. بعد عمل النيوكليز، سوف إصلاح مسارات إصلاح الحمض النووي إصلاح نهايات الحمض النووي مكسورة، وإدخال indels في كثير من الأحيان. ثم تستخدم هذه الطفرات خارج الإطار لفهم وظيفة الجينات في الكائنات الحية المستهدفة. ومع ذلك، فإن العيب هو أن الأفراد المتحولين لا يحملون علامة مهيمنة، مما يجعل تحديد وتتبع الأليل المتحولة أمرا صعبا، خاصة على المقاييس اللازمة للعديد من التجارب.

تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) هو وسيلة بسيطة لتحديد الاختلافات في تسلسل الحمض النووي ويستخدم منحنيات ذوبان PCR للكشف عن مثل هذه الاختلافات. تستخدم طريقة تحليل ما بعد PCR هذه الأصباغ الفلورية المزدوجة الملزمة للحمض النووي مع أجهزة لديها قدرة على التقاط البيانات التحكم في درجة الحرارة ويتم تحجيمها بسهولة إلى تنسيقات 96 لوحة جيدة. وصف هنا هو سير عمل بسيط باستخدام HRMA للكشف السريع عن كريسبر / Cas9 الناجمة عن indels وإنشاء خطوط متحولة في Ae. aegypti البعوض. بشكل حاسم ، يمكن تنفيذ جميع الخطوات مع كمية صغيرة من أنسجة الساق ولا تتطلب التضحية بالكائن الحي ، مما يسمح بإجراء الصلبان الوراثية أو المقايسات الفينوتيبينج بعد الكتابة الجينية.

Introduction

وباعتبار البعوض نواقل لمسببات الأمراض مثل فيروسات حمى الضنك 1 وزيكا 2 وشيكونغونيا3 ، فضلا عن طفيليات الملاريا4، فإن البعوض يمثل تهديدا كبيرا للصحة العامة للبشر. وبالنسبة لجميع هذه الأمراض، هناك تركيز كبير للتدخل في انتقال العدوى على مكافحة ناقلات البعوض. دراسة الجينات الهامة في، على سبيل المثال، التساهل مع مسببات الأمراض، واللياقة البدنية للبعوض، والناجية، والتكاثر، ومقاومة المبيدات الحشرية أمر أساسي لوضع استراتيجيات جديدة لمكافحة البعوض. ولهذه الأغراض، أصبح تحرير الجينوم في البعوض ممارسة شائعة، لا سيما مع تطوير تكنولوجيات مثل HEs و ZFNs و TALENs ومؤخرا CRISPR مع Cas9. إنشاء سلالات تحرير الجينات ينطوي عادة على الأفراد backcrossing تحمل الطفرات المطلوبة لبضعة أجيال للحد من الآثار خارج الهدف ومؤسس (عنق الزجاجة) ، تليها عبور الأفراد heterozygous لتوليد خطوط homozygous أو عبر heterozygous. في غياب علامة مهيمنة ، من الضروري الكتابة الجينية الجزيئية في هذه العملية لأنه ، في كثير من الحالات ، لا يمكن الكشف عن سمات واضحة فينوتيبيك للمسوخ heterozygous.

على الرغم من أن التسلسل هو المعيار الذهبي لتوصيف الجينية ، فإن تنفيذ ذلك عبر المئات ، أو ربما الآلاف من الأفراد ، يفرض تكاليف كبيرة ، والعمالة ، والوقت اللازم للحصول على النتائج ، وهو أمر بالغ الأهمية للكائنات الحية ذات العمر القصير مثل البعوض. البدائل شائعة الاستخدام هي المساح النيوكليز assay5 (SNA)، T7E1 المقايسة6، وتحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA، استعرضت in7). كل من SNA و T7E1 استخدام endonucleases التي تلتصق قواعد غير متطابقة فقط. عندما يتم تضخيم منطقة متحولة من الجينوم المتحول heterozygous ، يتم تضخيم شظايا الحمض النووي من الأليل المتحولة والبرية لجعل الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل غير متطابقة (dsDNA). SNA يكشف عن وجود عدم التطابق عن طريق الهضم مع الإندونوكلياز عدم التطابق محددة وبسيطة agarose هلام الكهربائي. بدلا من ذلك، يستخدم HRMA الخصائص الديناميكية الحرارية ل dsDNA التي تم اكتشافها بواسطة الأصباغ الفلورية الملزمة dsDNA، مع اختلاف درجة حرارة فصل الصبغة استنادا إلى وجود ونوع الطفرة. وقد استخدمت HRMA للكشف عن تعدد الأشكال أحادية النيوكليوتيدات (SNPs)8، وال جينوتيب متحولة من حمار وحشي fish9، التطبيقات الميكروبيولوجية10، والبحوث الوراثية النباتية11، من بين أمور أخرى.

تصف هذه الورقة HRMA ، وهي طريقة بسيطة للجنوة الجزيئية للبعوض المتحول الناتج عن تقنية CRISPR /Cas9. مزايا HRMA على التقنيات البديلة تشمل 1) المرونة، كما ثبت أنها مفيدة لمختلف الجينات، ومجموعة واسعة من أحجام indel، فضلا عن التمييز بين أحجام indel مختلفة و heterozygous، homozygous، وعبر heterozygous differentiation12،13،14، 2) التكلفة، كما أنها تقوم على الكواشف PCR المستخدمة عادة، و 3) توفير الوقت، كما يمكن أن يؤديها في غضون ساعات قليلة. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم البروتوكول جزءا صغيرا من الجسم (ساقا) كمصدر للحمض النووي ، مما يسمح للبعوض بالبقاء على قيد الحياة في عملية الكتابة الجينية ، مما يسمح بإنشاء وصيانة خطوط متحولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المسح الضوئي لتعدد الأشكال النيوكليوتيدات واحد (SNPs)، تصميم التمهيدي HRMA، والتحقق من صحة التمهيدي

  1. تحديد SNP في البعوض مستعمرة مختبر من النوع البري
    1. حدد exon الهدف لتعطيل الترجمة البوليبتيد المناسبة.
      ملاحظة: يجب أن يكون الهدف قريبا من كودون البداية أو بين المخلفات الرئيسية المطلوبة لوظيفة البروتين. كلما كان exon أقصر (على سبيل المثال ، ≤200 قاعدة) ، كلما كان من الصعب استهدافه وتحليله. تجنب التحرير بالقرب من حدود exon ، لأن هذا يجبر أحد التمهيديين HRMA إما على عبور intron أو أن يكون في intron. وهذا أمر غير مرغوب فيه لأن معدلات الحزب الوطني السوري تميل إلى أن تكون أكبر بكثير في تلك المناطق.
    2. تصميم التمهيدي
      1. انتقل إلى انفجار NCBI - Primer Blast website15، انسخ ولصق exon المختار في المربع الموجود أعلى الصفحة | اختيار حجم المنتج PCR (ضمان أنه يشمل معظم exon) | اختيار الكائن الحي.
      2. انقر على المعلمات المتقدمة | اختر (لPCR المنتج TM) وإضافة 60 (لدرجة حرارة مثالية من 60 درجة مئوية) | الحصول على التمهيديات. الاحتفاظ المعلمات الأخرى كإعداد افتراضي.
    3. الحصول على الحمض النووي الجينومي (gDNA) من مستعمرة مختبر البرية من النوع. خصص 10 بعوضة، وخدرها ب ثاني أكسيد الكربون، ووضعها في طبق بيتري على الجليد لإبقائها غير نشطة. إعداد 10 أنابيب تحتوي على 0.5 ميكرولتر من الكاشف لإطلاق الحمض النووي من الأنسجة و 20 ميكرولتر من العازلة التخفيف، وكلاهما المنصوص عليها في مجموعة إطلاق الحمض النووي المقترحة في جدول المواد.
    4. إزالة ساق واحدة من بعوضة واحدة باستخدام ملقط ووضعه في أنبوب المقابلة من محلول مخفف من كاشف إطلاق الحمض النووي (من الخطوة 1.1.3)، غمر تماما الساق في الحل. كرر هذه الخطوة مع البعوض المتبقي ، ومسح ملقط مع الإيثانول 70 ٪ قبل الشروع في واحد المقبل.
    5. احتضان الحل الذي يحتوي على الساق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق، ثم في 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والسماح لها لتهدئة أثناء إعداد رد فعل PCR.
      ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات التي تحتوي على gDNA الصادرة عند -20 درجة مئوية، ويمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة.
    6. إعداد 10 أنابيب تحتوي على 10 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix، والتمهيدات لتركيز نهائي 0.5 ميكرومتر، وماء الصف الجزيئي إلى حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر، ونقل 1 ميكرولتر من العينة المخففة إلى كل أنبوب. تنفيذ PCR التالية معلمات ركوب الدراجات هذه: 98 °C 5 دقيقة, 40 دورات من 98 °C ل 5 ق, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s لكل كيلوبايت; التمديد النهائي ل 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
    7. تنقية منتجات PCR مع إنزيم لتتحلل التمهيديات PCR المتبقية وdNTPs dephosphorylate الزائدة أو أي عمود تنظيف عدة. تابع تسلسل العينات.
    8. تحليل كل electropherogram لوجود القمم المزدوجة / قواعد غامضة ، وضبط المكالمات الأساسية يدويا في كل تسلسل باستخدام رمز قاعدة المنحطة المناسبة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة قبل محاذاة تسلسل متعددة كما هو شائع لبرنامج استدعاء قاعدة لتحديد الذروة أكثر بروزا ك استدعاء قاعدة "true" إعطاء انطباعا خاطئا غياب SNPs.
    9. قم بإجراء محاذاة تسلسل متعددة باستخدام برنامج المحاذاة، SeqMan Pro، المدرج في جدول المواد أو برامج المحاذاة مفتوحة المصدر الأخرى، مثل ClustalW16 أو T-Coffee17.
      1. فتح برنامج المحاذاة | انقر على إضافة تسلسلات | حدد التسلسلات المطلوبة وانقر على إضافة | بمجرد اختيار جميع التسلسلات، انقر على تم.
      2. انقر على تجميع لأداء المحاذاة. لفتح المحاذاة، انقر على Contig 1 وتحليل المحاذاة وتحديد SNPs (الشكل 1).
        ملاحظة: كبديل للخطوات 1.1.3-1.1.6، يمكن إجراء PCR من الحمض النووي الجينومي المعزول الذي تم الحصول عليه من عينات السائبة (المستمدة من >10 أفراد). يمكن تحليل التضخيمات المتسلسلة مباشرة لوجود SNPs التي تظهر كقمم مزدوجة في الفيروغرام الكهربائي ، على الرغم من أن SNPs النادرة سيكون من الصعب اكتشافها.
    10. تصميم 3-5 دليل واحد RNAs (sgRNAs)، وتجنب المناطق التي تحتوي على أي SNP المحددة أعلاه، وفقا للبروتوكول الموصوف في18.
  2. تصميم التمهيدي HRMA
    1. اختبار تسلسل exon لتشكيل المحتملة من الهياكل الثانوية أثناء PCR باستخدام mFold19.
      1. انتقل إلى خادم الويب UNAFold | انقر على | mFold في القائمة المنسدلة، انقر على التطبيقات | نموذج طي الحمض النووي.
      2. أدخل اسم التسلسل في المربع والصق exon.
      3. تغيير درجة الحرارة القابلة للطي إلى 60 درجة مئوية. على الشروط الأيونية، تغيير [مغ ++] إلى 1.5 وعلى وحدات التبديل إلى mM؛ انقر على طية DNA.
      4. على الإخراج، تحت هيكل 1، انقر على قوات الدفاع الشعبي لفتح المؤامرات هيكل دائري.
    2. انتقل إلى NCBI Blast - Primer Blast15 لتصميم التمهيدي.
    3. نسخ ولصق تسلسل exon المحددة بواسطة التسلسل في الخطوة 1.1 (التسلسل الذي يحتوي على أقل عدد من SNPs أو لا SNPs) في المربع الموجود أعلى الصفحة.
    4. استخدم الرمز < > لوضع علامة على التسلسلات التي تحتوي على SNPs والموقع الهدف والمناطق التي يمكن تكوينها من البنية الثانوية واستبعادها.
    5. حدد حجم منتج PCR ليكون بين 80 و 150 نقطة أساس واختر الكائن الحي.
      ملاحظة: يمكن استخدام أحجام الأجزاء الأكبر بنجاح (~300 bp). ومع ذلك، قد يقلل من حساسية أطول amplicons بين تسلسل تختلف في واحد أو بضعة أزواج قاعدة.
    6. انقر على الحصول على التمهيديات. حدد أزواج 2-3 من التهيئة ليتم اختبارها (من الناحية المثالية ، مواقع التمهيدي هي ≥20-50 نقطة أساس بعيدا عن أي مواقع الهدف CRISPR).
  3. التحقق من صحة التمهيدي
    1. تنفيذ PCR التدرج باستخدام gDNA من فرد واحد.
      1. قم بإعداد مزيج رئيسي وإزالة عينة واحدة لعنصر التحكم غير القالب (NTC) في أنبوب منفصل. إضافة القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقية وaliquot في لوحة 96 جيدا.
      2. اتبع معلمات ركوب الدراجات: 98 درجة مئوية 30 s, 34 دورات من 98 °C ل 10 s, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; التمديد النهائي من 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      3. توليد ملامح ذوبان الحرارية بعد المعلمات: التشبع الخطوة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تذوب منحنى الكشف بين 75 درجة مئوية و 95 درجة مئوية في 0.2 درجة مئوية الزيادات، مع وقت الانتظار من 10 ثانية في كل درجة حرارة.
        ملاحظة: يجب استخدام درجات الحرارة التي تملص فقط مع ملف تعريف ذوبان حراري واحد.
  4. المضي قدما لتوليد خطوط متحولة مع حقن الأجنة كما هو موضح في12.

2. إعداد الحمض النووي الجينومي من أرجل البعوض

  1. فصل البعوض G1 حسب الجنس في مرحلة الجرو بحيث لا تتزاوج قبل genotyping، وتأكد من أن البعوض مكافحة مطابقة للعمر، من النوع البري سوف تكون متاحة لاستخدامها في المراجع و backcrosses. الجنس فصل لهم بالمثل.
  2. جمع المواد اللازمة (الشكل 2A) وإعداد لوحة 96 PCR جيدا مع 0.5 ميكرولتر من كاشف إطلاق الحمض النووي و 20 ميكرولتر من العازلة تخفيف (من عدة الافراج عن gDNA) للفرد الواحد لتكون النمط الجيني (الشكل 2B) وتركها على الجليد. حجز ردين فعل للمجلس الوطني الانتقالي.
  3. تسمية صينية لقارورات البعوض (قوارير Drosophila ) بحيث يتوافق كل بئر على لوحة 96 مع قارورة البعوض المعنية في الدرج.
  4. تخدير البعوض G1 مع ثاني أكسيد الكربون ووضعها في طبق بيتري الزجاج للحفاظ عليها مخدرة (الشكل 2C، D). تخدير ووضع 8 البعوض البرية من نوع في طبق بيتري الثاني.
  5. مسح زوج من الملاقط مع الإيثانول 70٪ وإزالة واحدة من الساقين الخلفية البعوض (الشكل 2E، F).
  6. غمر الساق في محلول كاشف إطلاق الحمض النووي ، ووضع البعوض في القارورة المقابلة ، وإغلاقه بإسفنجة (الشكل 2G ، H).
  7. مسح الملاقط مرة أخرى مع الإيثانول 70٪ والمضي قدما في إزالة الساق من البعوض المقبل. كرر الخطوات 2.5-2.7 حتى يتم الانتهاء من لوحة 96 جيدا.
    ملاحظة: من المهم مسح الملاقط بالإيثانول بنسبة 70٪. وهذا يقلل من التلوث عبر الحمض النووي.
  8. ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية (الشكل 2I) واحتضان لوحة 96 جيدا تحتوي على الساقين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2-5 دقيقة ثم في 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. السماح للوح لتهدئة لRT أثناء إعداد مزيج PCR.
    ملاحظة: تستغرق العملية بأكملها عادة 3-4 ساعة. إذا كان يجب الاحتفاظ بالبعوض في القنينات لفترة أطول من المدة المتوقعة (خاصة ≥1 يوم) ، ضع قطعة صغيرة من الزبيب (أو مصدر السكر والماء) مع كل بعوضة لضمان بقاء البعوض أثناء الحضانات الموسعة.

3. HRMA

  1. تنفيذ PCR.
    1. إعداد مزيج رئيسي يحتوي على المكونات التالية لكل رد فعل: 10 ميكرولتر من العازلة 2x (من مجموعة الإفراج gDNA)، 0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي، 1 ميكرولتر من صبغة EvaGreen، 0.4 ميكرولتر من البوليميراز (من عدة إطلاق gDNA)، وكاملة إلى 19 ميكروغرام مع الماء الجزيئي الصف.
    2. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر. نقل 1 ميكرولتر من محلول إطلاق الحمض النووي الذي يحتوي على الحمض النووي للبعوض المعد في القسم 2 إلى اللوحة (الشكل 3A). ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية.
    3. إجراء PCR التالية المعلمات ركوب الدراجات: 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 39 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، ودرجة حرارة العلة المختار (72 درجة مئوية) لمدة 30 s؛ التمديد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  2. توليد ملامح ذوبان الحرارية بعد المعلمات: التشبع الخطوة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تذوب منحنى الكشف بين 75 درجة مئوية و 95 درجة مئوية في 0.2 درجة مئوية الزيادات، مع وقت الانتظار من 10 ثانية في كل درجة حرارة. راجع المواد التكميلية والشكل التكميلي S1-S5 للحصول على وصف مفصل لإعداد البرامج لتشغيل HRMA باستخدام نظام CFX96 في الوقت الحقيقي.
  3. فحص ملامح ذوبان (الشكل 3B). تعيين عنصر تحكم نوع wild إلى الكتلة المرجعية.
    ملاحظة: البرنامج (راجع جدول المواد) تلقائيا تطبيع البيانات وتعيين الكتل مع الألوان لمنحنيات melt مختلفة.
  4. وضع علامة على المجموعات المختلفة ذات الألوان المطابقة على القالب 96-well (الشكل 3C).
  5. حدد الأفراد مع منحنيات الاهتمام، وإزالتها من الأنابيب، و backcross (الشكل 3D). الدم تغذية الإناث تزاوج وجمع البيض G2 .

4. التحقق من التسلسل من قبل تسلسل سانجر

  1. تنقية منتج PCR من الآبار مع البعوض المحدد (من لوحة أعدت في القسم 3.1)، وذلك باستخدام إنزيم لتتحلل التمهيديات PCR المتبقية، وdNTPs الزائدة dephosphorylate. بدلا من ذلك، استخدم أي مجموعة تنظيف العمود والمضي قدما في تسلسل العينات.
    ملاحظة: التسلسل المباشر قد يكون أكثر تحديا عندما يكون حجم المنتج PCR صغيرة (≤200 bp). في مثل هذه الحالات، تصميم التمهيديات لتضخيم شظايا أكبر تشمل الموقع المستهدف (≥250 نقطة أساس) وتضخيم بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي في لوحة 96 بئر (الخطوة 2.2).
  2. تحليل وتحديد indels باستخدام برنامج عارض التتبع (الشكل 4). بدلا من ذلك، بولي بيك محلل software20 يمكن أن تساعد في الكشف عن طفرة في الأفراد heterozygous.
    1. انتقل إلى موقع Poly Peak Parser على الويب، وحدد التسلسل من الأفراد المتحولين في القائمة استعراض ، وانسخ التسلسل المرجعي والصقه في المربع.
      ملاحظة: سوف تظهر المحاذاة بين أليل البديل والمرجع تلقائيا على الجانب الأيمن من الشاشة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الحصول على البعوض الذي يحتوي على طفرات في الجينات AaeZIP11 (الناقل المفترض الحديد21) وميو فيم (جين الميوسين المتحيزة للإناث المتعلقة عضلات الطيران13) باستخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9، النمط الجيني باستخدام HRMA، والتحقق من التسلسل (الشكل 5). الشكل 5A والشكل 5C تظهر كثافة الفلورية تطبيع من منحنيات إدارة الموارد البشرية من AaeZIP11 وعينات متحولة ميو-fem ، على التوالي، جنبا إلى جنب مع الضوابط البرية من نوع. الشكل 4B والشكل 4D تظهر تكبير منحنيات الفرق (من AaeZIP11 وعينات متحولة ميو فام ، على التوالي) بين ملامح ذوبان المجموعات المختلفة التي خصصتها البرمجيات بعد طرح كل منحنى من مرجع البرية من نوع. تم وضع الأفراد Heterozygous و homozygous متحولة AaeZIP11 في مجموعات مختلفة ويتم تمييزها بسهولة من الضوابط البرية من نوع (الشكل 5B). Heterozygous متحولة ميو المرأة الأفراد هي أيضا متميزة عن الضوابط (الشكل 5D). لاحظ وجود مجموعتين ضمن عناصر التحكم البرية في كلتا الحالتين، ويرجع ذلك على الأرجح إلى وجود برامج SNPs في المنطقة المستهدفة (الشكل 5)، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى استخدام عينات تحكم متعددة لتجنب تصنيف الضوابط على أنها متحولة عندما لا يمكن تجنب الأنظمة غير المتحولة.

يظهر الشكل 4A تحليل تسلسل متحولة AaeZIP11 . يشير مخطط كهربية الكتروفيروغرام من متحولات AaeZIP11 heterozygous إلى موضع النيوكليوتيدات حيث حدث ال indel. ويمثل ذلك التحول من القمم الفردية إلى القمم المزدوجة حيث أن المواقف المتعددة الأشكال سوف تظهر كلا النيوكليوتيدات بتزامن (الشكل 4A). تم حساب عدد أزواج الأساس المحذوفة أو المدرجة عن طريق حساب القمم المفردة في نهاية المدى (الشكل 4B) حيث أن أحد خيوط الحمض النووي سيكون أقصر أو أطول من الآخر بعدد الأزواج الأساسية المحذوفة أو المدرجة على التوالي. من المستحسن استخدام gDNA التحقق من التسلسل من المسوخ كمرجع لتحديد heterozygotes للمساعدة في تحليلات HRMA للأجيال اللاحقة. قد تكون هناك حاجة إلى تعيين يدوي للمنحنيات عندما يتم تعيين منحنيات مماثلة تلقائيا إلى مجموعات مختلفة. ويمكن القيام بذلك عن طريق مقارنة المنحنيات التي تحولت درجة الحرارة ومنحنيات الفرق. قد تكون هناك حاجة إلى تعديل يدوي للبرنامج لتعيين عينات بشكل صحيح إلى المجموعات. تظهر نتائج HRMA من AaeZIP11 ومتحول يسمى Aeflightin أن هناك حاجة إلى تحليلات عينات فردية لتصنيف التروزيغوتات والهوزيغوتات العابرة للتروزوغوت بنجاح. في البداية، لم يكن من الممكن أن تميز التعيين التلقائي للمجموعات من البرنامج بشكل صحيح بين المجموعات (الشكل 6A والشكل 6C والشكل 6E والشكل 6G). ثم تم تحليل كل عينة بشكل فردي وتعيينها إلى المجموعات الصحيحة على أساس التشابه مع العينات المرجعية من الهتيروزوتات والتجانسات وعبر التروزيغوت (تم التحقق منها مسبقا عن طريق التسلسل) (الشكل 6B والشكل 6D والشكل 6F والشكل 6H).

Figure 1
الشكل 1: تحديد هوية الحزب الوطني السوري. تمثيل تخطيطي لمحاذاة تسلسل متعددة من جزء AaeZIP11 من النوع البري. في الحمراء هي SNPs، والأخضر هي شظايا خالية من SNPs؛ ويقترح هذه المنطقة خالية من SNP لتصميم SgRNA والتمهيدي. المختصرات: SNP = تعدد الأشكال النيوكليوتيدية المفردة؛ sgRNA = دليل واحد الجيش الملكي النيبالي؛ LVP = سلالة ليفربول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إجراء تجريبي للحصول على الحمض النووي الجينومي من سيقان البعوض لإذاعة وتلفزيون كرواتيا. (أ) مواد للحصول على الحمض النووي الجينومي بما في ذلك ماصة، نصائح، لوحة PCR، الختم البصري، الخزان، العازلة تخفيف، ومحلول إطلاق الحمض النووي. (ب) إعداد لوحة PCR التي تحتوي على كاشف إطلاق الحمض النووي وحاجز التخفيف. (ج) تخدير البعوض مع ثاني أكسيد الكربون. (د) مسح الملاقط بالإيثانول بنسبة 70٪ لمنع التلوث بين العينات. (ه) الإعداد التجريبي بما في ذلك ملاقط، رف لقارورات البعوض، طبق بيتري على رأس حاوية الثلج مع البعوض مخدر، ولوحة PCR المعدة سابقا. (و) إزالة ساق البعوض. (G) عرض تكبير ساق البعوض التي تغمرها في محلول كاشف إطلاق الحمض النووي. (ح) بعوضة واحدة موضوعة في القارورة. (I) ختم لوحة PCR التي تحتوي على أرجل البعوض. اختصار: HRMA = تحليل ذوبان عالية الدقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الإجراء التجريبي لتحليل إدارة الموارد البشرية. (أ) نقل gDNA صدر إلى لوحة 96 جيدا تحتوي على مزيج PCR. (ب) الفحص البصري لمنحنيات الفرق. (C) وضع علامة على كل عينة على قالب 96 جيدا بنفس لون لون منحنى الفرق الخاص بها. (د) العودة عبر الأفراد من نفس المجموعة. الاختصارات: إدارة الموارد البشرية = ذوبان عالي الدقة؛ gDNA = الحمض النووي الجينومي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل تسلسل متحولة AaeZIP11 . (أ) محاذاة النيوكليوتيدات للمتحول AaeZIP11Δ56. شرطات تمييز باللون الأصفر هي القواعد المحذوفة. في المربع، ينتقل الرسم الكهربائي من القمم المفردة إلى القمم المزدوجة، مما يصور الموضع الذي حدث فيه الحذف (السهم). (ب) الكتروفيروغرام لنهاية سلسلة المراحل والانتقال من القمم المزدوجة إلى القمم المفردة. لاحظ أن عدد القمم المفردة يمثل عدد القواعد المحذوفة (المستطيل الرمادي). يتم توفير تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي S1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: HRMA من الحمض النووي المستخرج من أرجل البعوض. تم استخراج الحمض النووي من ساق واحدة من AaeZIP11 (A و B) وميو-fem (C و D) بالضربة القاضية Ae. aegypti البعوض وتحليلها من قبل HRMA. A و C تدل على إشارات الفلورسينس تطبيع العينات إلى القيم النسبية من 1.0 إلى 0. B و D تدل على تكبير الاختلافات منحنى عن طريق طرح كل منحنى من مرجع البرية من نوع (سلالة ليفربول). الاختصارات: HRMA = تحليل ذوبان عالي الدقة؛ LVP = سلالة ليفربول; RFU = وحدات الفلورسينس النسبية. يتم توفير تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي S1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: أمثلة على تعيينات المجموعات اليدوية. (A و C) يتم تجميع منحنيات الذوبان (منحنيات المقياس الخطي العادية ومنحنيات الفرق ، على التوالي) تلقائيا بواسطة برنامج تحليل الدقة الذائبة. (ب) تطبيع المنحنيات التفاضلية التي تتغير يدويا. (د) بعد تغيير تطبيع المنحنيات التفاضلية، تم تعيين كل عينة بشكل فردي من خلال درجات الحرارة القصوى في منحنيات الفرق للضوابط الإيجابية المقابلة (عينات متسلسلة سابقا تم تحديدها من قبل Δ4 و Δ5 heterozygotes و Δ4Δ5 عبر heterozygotes)، مما يتيح تحديد واضح للمجموعات 3. تضاف الأسهم الحمراء والبني لتسليط الضوء على القمم في درجات حرارة مختلفة. (E-H) HRMA للمسوخ AaeZIP11. (E و G) يتم تعيين منحنيات تذوب تلقائيا من قبل البرنامج. (F و H) تم تعيين المسوخ في تقاطع heterozygous الذاتي الثاني بشكل مناسب للمجموعات الصحيحة من خلال تشابه منحنيات التطبيع والفرق إلى المراجع المحددة مسبقا (مرمزة بالألوان في المنحنيات). Heterozygotes asg، هوموزيغتس أسغ، وعبر heterozygotes asg: تعيين منحنيات ذوبان من قبل الدقة تذوب تحليل البرمجيات. الاختصارات: HRMA = تحليل ذوبان عالي الدقة؛ LVP = سلالة ليفربول; RFU = وحدات الفلورسينس النسبية. يتم توفير تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي S1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد التكميلية: بروتوكول مفصل لإعداد HRMA في نظام CFX96 في الوقت الحقيقي (على سبيل المثال، بيو راد).

الشكل التكميلي S1: إرشادات خطوة بخطوة لإعداد بروتوكول ركوب الدراجات على مدير Bio-rad CFX. انظر المواد التكميلية 2.1-2.3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: إرشادات خطوة بخطوة لإعداد لوحة على إدارة بيو راد CFX. انظر المواد التكميلية 3.1-3.4. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: إرشادات خطوة بخطوة لإعداد لوحة على مدير بيو راد CFX. انظر المواد التكميلية 3.5-3.6. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: إرشادات خطوة بخطوة لإعداد التشغيل على إدارة CFX بيو راد. انظر المواد التكميلية 4.1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S5: إرشادات خطوة بخطوة لتحليل HRMA على إدارة بيو راد CFX. انظر المواد التكميلية 5.1-5.3. اختصار: HRMA = تحليل ذوبان عالية الدقة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: قائمة العناوين التمهيدية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليل ذوبان عالية الدقة يقدم حلا بسيطا وسريعا لتحديد indels التي تم إنشاؤها بواسطة تكنولوجيا CRISPR / Cas9 في البعوض ناقلات Ae. aegypti. وهو يوفر المرونة، مما يتيح جنوة البعوض تحور لمجموعة واسعة من الجينات من عضلات الطيران إلى استقلاب الحديد وأكثر13،14. يمكن إجراء HRMA في غضون ساعات قليلة من جمع العينات إلى التحليلات النهائية. يلزم وقت إضافي لتصميم التمهيدي وسيعتمد أيضا على الوقت لتلقي أي نتائج تسلسل مطلوبة (لتحديد SNPs) وتحليلات التسلسل وترتيب التمهيدي.

ويفصل البروتوكول المعروض هنا الأساليب التدريجية للتحليلات الناجحة. واحدة من أهم الخطوات في هذه العملية هو التصميم السليم للمبرمجين. HRMA حساسة بما فيه الكفاية أن وجود حتى SNP واحد داخل جزء تضخيم يمكن أن يؤدي إلى منحنى الفرق القوي الذي يمكن أن يساء تفسيره على أنه طفرة. تسلسل عينات مستعمرة مختبر قبل تكوين كريسبر يسمح للكشف وتجنب المناطق الغنية SNP عند تصميم الهدف; سوف تساعد التمهيديات HRMA لمنع هذه المشكلة. تصميم التمهيديات للتضخيم الصغيرة (70-100 نقطة أساس) يمكن أيضا تحسين حساسية والاستنساخ للتجربة كما شظايا أكبر يمكن أن تقدم العديد من المجالات تذوب، مما يقلل من فرصة التمييز variants22. ومن القيود المفروضة على هذه التقنية أن تجنب الملوثات غير المورثية غير المورثية تماما قد لا يكون ممكنا تبعا للجين؛ وبالتالي، فإن تسلسل واستخدام العديد من أفراد مكافحة الأنواع البرية قد يساعد في التحليلات.

خصيصا لهذا البروتوكول ، من المهم الحفاظ على البعوض النمط الجيني على قيد الحياة حتى يمكن عبورها مرة أخرى لإنشاء خطوط متحولة. إزالة واحدة من أرجل البعوض لاستخراج gDNA قد يكون السبيل الأقل الغازية لتحقيق ذلك; ومع ذلك، فإن كمية gDNA تعافى من هذا النسيج هو الحد الأدنى. وكانت المجموعة المقترحة في جدول المواد كافية للحصول على الحمض النووي من ساق البعوض وإجراء PCR لإكمال HRMA.

HRMA يمكن أن توفر المزيد من المرونة من حيث الكشف عن مجموعة واسعة من أحجام indel، تختلف من عدم التطابق قاعدة واحدة لأزواج قاعدة متعددة (AaeZIP11 كان حذف 56 نقطة أساس) وتجاوز أساليب مثل SNA أو T7E1 (كل من اختبار انشقاق عدم تطابق الإنزيم) التي تقتصر على عدم تطابق قاعدة واحدة أو حذف صغير (~ 20 bp)5، 23- ال 23- الأرباح التي ي بالإضافة إلى ذلك، لا يكشف SNA المسوخ متجانسة كما لا تحتوي على منتجات PCR عدم تطابق. وعلاوة على ذلك، قد تكون نتائج SNA ملثمين أيضا من قبل تعدد الأشكال الأليلية التي تحدث بشكل طبيعي عندما يكون لمنتجات PCR المعالجة بالنيوكلياز طول مماثل لل alleles المتحولة. ولا ينطبق أي من هذه القيود على قانون حقوق الإنسان والموارد البشرية. في نهاية المطاف، التسلسل ضروري لتحديد تسلسل الحمض النووي المتحولة. ومع ذلك ، بمجرد معرفة طفرة في السؤال ، HRMA المستخدمة لتحديد الأفراد متحولة أسرع بكثير من التسلسل المباشر. وتحافظ هذه الطريقة على عينات قيمة (المزيد من البعوض سيبقى على قيد الحياة، وكلما قل صبره على نتائج النمط الجيني) ويقلل من الحاجة إلى تسلسل أعداد كبيرة من العينات، مما يقلل من التكلفة الإجمالية للتجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

Acknowledgments

تم إنشاء جميع الأرقام مع Biorender.com بموجب ترخيص لجامعة تكساس A &؛ M. تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI137112 وAI115138 إلى Z.N.A.) ، وتكساس A & M AgriLife Research في إطار برنامج منحة الأمراض الموجهة الحشرية ، والمعهد الوطني للأغذية والزراعة في وزارة الزراعة الأمريكية ، مشروع هاتش 1018401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Tags

علم الوراثة، العدد 175،
Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في <em>Aedes البعوض aegypti</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes,… More

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O'Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter