Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63008
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Abstract

Die Mücken-Gen-Editierung ist in mehreren Labors zur Routine geworden, wobei Systeme wie transkriptionsaktivatorähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zinkfingernukleasen (ZFNs) und Homing-Endonukleasen (HEs) etabliert wurden. In jüngster Zeit hat die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) eine einfachere und kostengünstigere Alternative für das Precision Genome Engineering angeboten. Nach der Nuklease-Aktion fixieren DNA-Reparaturwege die gebrochenen DNA-Enden und führen oft Indel ein. Diese Out-of-Frame-Mutationen werden dann verwendet, um die Genfunktion in den Zielorganismen zu verstehen. Ein Nachteil ist jedoch, dass mutierte Individuen keinen dominanten Marker tragen, was die Identifizierung und Verfolgung von mutierten Allelen schwierig macht, insbesondere in Skalen, die für viele Experimente benötigt werden.

Die hochauflösende Schmelzeanalyse (HRMA) ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Variationen in Nukleinsäuresequenzen und verwendet PCR-Schmelzkurven, um solche Variationen nachzuweisen. Diese Post-PCR-Analysemethode verwendet fluoreszierende doppelsträngige DNA-bindende Farbstoffe mit Instrumenten, die über eine Datenerfassungsfunktion zur Temperaturrampenregelung verfügen und leicht auf 96-Well-Plattenformate skaliert werden können. Beschrieben wird hier ein einfacher Workflow mit HRMA zum schnellen Nachweis von CRISPR/Cas9-induzierten Indeln und der Etablierung von Mutantenlinien in der Mücke Ae. aegypti. Entscheidend ist, dass alle Schritte mit einer kleinen Menge Anleggewebe durchgeführt werden können und keine Opferung des Organismus erfordern, so dass genetische Kreuzungen oder Phänotypisierungsassays nach der Genotypisierung durchgeführt werden können.

Introduction

Als Vektoren von Krankheitserregern wie Dengue1-, Zika2- und Chikungunya3-Viren sowie Malariaparasiten4 stellen Moskitos eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit des Menschen dar. Bei all diesen Erkrankungen liegt ein wesentlicher Schwerpunkt der Übertragungsintervention auf der Bekämpfung von Mückenvektoren. Die Untersuchung der Gene, die beispielsweise für die Permissivität gegenüber Krankheitserregern, die Fitness von Mücken, das Überleben, die Fortpflanzung und die Resistenz gegen Insektizide wichtig sind, ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Strategien zur Bekämpfung von Mücken. Für solche Zwecke wird die Genom-Editierung bei Moskitos zu einer gängigen Praxis, insbesondere mit der Entwicklung von Technologien wie HEs, ZFNs, TALENs und zuletzt CRISPR mit Cas9. Die Etablierung von geneditierten Stämmen beinhaltet typischerweise die Rückkreuzung von Individuen, die die gewünschten Mutationen für einige Generationen tragen, um Off-Target- und Gründer- (Engpass-) Effekte zu minimieren, gefolgt von der Kreuzung heterozygoter Individuen, um homozygote oder trans-heterozygote Linien zu erzeugen. In Ermangelung eines dominanten Markers ist in diesem Prozess eine molekulare Genotypisierung notwendig, da in vielen Fällen keine eindeutigen phänotypischen Merkmale für heterozygote Mutanten nachgewiesen werden können.

Obwohl die Sequenzierung der Goldstandard für die genotypische Charakterisierung ist, stellt die Durchführung bei Hunderten oder möglicherweise Tausenden von Individuen erhebliche Kosten, Arbeit und Zeit dar, die erforderlich sind, um Ergebnisse zu erzielen, was besonders für Organismen mit kurzer Lebensdauer wie Moskitos von entscheidender Bedeutung ist. Häufig verwendete Alternativen sind Surveyor Nuclease Assay5 (SNA), T7E1 Assay6 und High Resolution Melt Analysis (HRMA, überprüft in7). Sowohl SNA als auch T7E1 verwenden Endonukleasen, die nur nicht übereinstimmende Basen spalten. Wenn eine mutierte Region des heterozygoten mutanten Genoms amplifiziert wird, werden DNA-Fragmente von mutierten und Wildtyp-Allelen geglüht, um eine nicht übereinstimmende doppelsträngige DNA (dsDNA) herzustellen. SNA erkennt das Vorhandensein von Mismatches über die Verdauung mit einer Mismatch-spezifischen Endonuklease und einer einfachen Agarosegelelektrophorese. Alternativ nutzt HRMA die thermodynamischen Eigenschaften von dsDNA, die durch dsDNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden, wobei die Dissoziationstemperatur des Farbstoffs je nach Vorhandensein und Art der Mutation variiert. HRMA wurde unter anderem für den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs)8, die mutierte Genotypisierung von Zebrafischen9, mikrobiologische Anwendungen10 und pflanzengenetische Forschung11 eingesetzt.

Dieser Artikel beschreibt HRMA, eine einfache Methode der molekularen Genotypisierung für mutierte Moskitos, die durch die CRISPR / Cas9-Technologie erzeugt werden. Zu den Vorteilen von HRMA gegenüber alternativen Techniken gehören 1) Flexibilität, da sie sich für verschiedene Gene als nützlich erwiesen hat, eine breite Palette von Indelgrößen sowie die Unterscheidung zwischen verschiedenen Indelgrößen und heterozygoter, homozygoter und trans-heterozygoter Differenzierung12,13,14, 2) Kosten, da sie auf häufig verwendeten PCR-Reagenzien basiert, und 3) Zeitersparnis, da es in nur wenigen Stunden durchgeführt werden kann. Darüber hinaus verwendet das Protokoll einen kleinen Körperteil (ein Bein) als DNA-Quelle, so dass die Mücke den Genotypisierungsprozess überleben kann, was die Etablierung und Aufrechterhaltung von Mutantenlinien ermöglicht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Scannen auf Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), HRMA-Primer-Design und Primer-Validierung

  1. SNP-Identifizierung bei Wildtyp-Laborkolonienmücken
    1. Wählen Sie das Ziel-Exon aus, um die korrekte Polypeptid-Translation zu stören.
      ANMERKUNG: Das Ziel sollte in der Nähe des Startcodons oder unter den für die Proteinfunktion erforderlichen Schlüsselrückständen liegen. Je kürzer das Exon (z. B. ≤200 Basen), desto schwieriger ist es, es zu zielen und zu analysieren. Vermeiden Sie es, in der Nähe der Grenzen eines Exons zu editieren, da dies einen der HRMA-Primer zwingt, entweder ein Intron zu überqueren oder sich in einem Intron zu befinden. Dies ist unerwünscht, da die SNP-Raten in diesen Regionen tendenziell viel höher sind.
    2. Primer-Design
      1. Gehen Sie auf die NCBI Blast - Primer Blast Website15, kopieren Sie das ausgewählte Exon und fügen Sie es in das Feld oben auf der Seite | Wählen Sie die PCR-Produktgröße (stellen Sie sicher, dass sie den größten Teil des Exons umfasst) | Wählen Sie den Organismus.
      2. Klicken Sie auf Erweiterte Parameter | Entscheiden Sie sich (für PCR-Produkt Tm) und fügen Sie 60 (für eine optimale Temperatur von 60 ° C) | Holen Sie sich Primer. Behalten Sie die anderen Parameter als Standard bei.
    3. Erhalten Sie genomische DNA (gDNA) aus der Wildtyp-Laborkolonie. Legen Sie 10 Moskitos beiseite, betäuben Sie sie mit CO2 und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis, um sie inaktiv zu halten. Stellen Sie 10 Röhrchen mit 0,5 μL des Reagenzes für die Freisetzung von DNA aus Gewebe und 20 μL Verdünnungspuffer auf, die beide in dem in der Materialtabelle vorgeschlagenen DNA-Freisetzungskit enthalten sind.
    4. Entfernen Sie ein Bein von einer einzelnen Mücke mit einer Pinzette und legen Sie es in ein entsprechendes Röhrchen einer verdünnten Lösung des DNA-Freisetzungsreagenzes (aus Schritt 1.1.3), wobei das Bein vollständig in die Lösung eingetaucht wird. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den verbleibenden Moskitos und wischen Sie die Pinzette mit 70% Ethanol ab, bevor Sie mit dem nächsten fortfahren.
    5. Die beinhaltige Lösung bei Raumtemperatur für 2-5 min, dann bei 98 °C für 2 min inkubieren und beim Einrichten der PCR-Reaktion abkühlen lassen.
      HINWEIS: Platten, die die freigesetzte gDNA enthalten, können bei -20 °C gelagert werden, und das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden.
    6. Bereiten Sie 10 Röhrchen mit 10 μL 2x PCR Master Mix, Primer auf eine Endkonzentration von 0,5 μM und Molekularwasser auf ein Endvolumen von 20 μL vor und übertragen Sie 1 μL der verdünnten Probe in jedes Röhrchen. PCR nach diesen Zyklusparametern durchführen: 98 °C 5 min, 40 Zyklen von 98 °C für 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s pro kb; Endausdehnung von 72 °C für 1 Min.
    7. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Enzym, um die verbleibenden PCR-Primer abzubauen und überschüssige dNTPs oder ein beliebiges Säulenreinigungskit zu dephosphorylieren. Fahren Sie mit der Sequenzierung der Proben fort.
    8. Analysieren Sie jedes Elektropherogramm auf das Vorhandensein von doppelten Peaks / mehrdeutigen Basen und passen Sie die Basisaufrufe in jeder Sequenz manuell mit dem entsprechenden entarteten Basiscode an.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss vor der Ausrichtung mehrerer Sequenzen ausgeführt werden, da es üblich ist, dass die Basisrufsoftware den prominenteren Peak als "echten" Basisaufruf auswählt, was den falschen Eindruck erweckt, dass keine SNPs vorhanden sind.
    9. Führen Sie eine Ausrichtung mit mehreren Sequenzen mit der Ausrichtungssoftware SeqMan Pro durch, die in der Materialtabelle aufgeführt ist, oder einer anderen Open-Source-Ausrichtungssoftware wie ClustalW16 oder T-Coffee17.
      1. Öffnen Sie die ausrichtungssoftware | Klicken Sie auf Sequenzen hinzufügen | Wählen Sie die gewünschten Sequenzen aus und klicken Sie auf Add | Sobald alle Sequenzen ausgewählt sind, klicken Sie auf Fertig.
      2. Klicken Sie auf Assemblieren , um die Ausrichtung durchzuführen. Um die Ausrichtung zu öffnen, klicken Sie auf Contig 1 und analysieren Sie die Ausrichtung und identifizieren Sie die SNPs (Abbildung 1).
        HINWEIS: Alternativ zu den Schritten 1.1.3-1.1.6 kann die PCR aus isolierter genomischer DNA durchgeführt werden, die aus Massenproben gewonnen wurde (abgeleitet von >10 Individuen). Sequenzierte Amplikone können direkt auf das Vorhandensein von SNPs analysiert werden, die als Doppelpeaks im Elektropherogramm erscheinen, obwohl seltene SNPs schwieriger zu erkennen sind.
    10. Entwurf 3-5 Single Guide RNAs (sgRNAs), Vermeidung von Regionen, die oben identifizierte SNP enthalten, gemäß dem unter18 beschriebenen Protokoll.
  2. HRMA-Primer-Design
    1. Testen Sie die Exonsequenz auf die mögliche Bildung von Sekundärstrukturen während der PCR mit mFold19.
      1. Gehen Sie zum UNAFold Web Server | Klicken Sie auf mFold | Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Anwendungen | DNA-Faltungsform.
      2. Geben Sie den Sequenznamen in das Feld ein und fügen Sie das Exon ein.
      3. Ändern Sie die Falztemperatur auf 60 °C; ändern Sie unter den ionischen Bedingungen [Mg++] auf 1,5 und auf Einheiten auf mM; Klicken Sie auf DNA falten.
      4. Klicken Sie unter Ausgabe unter Struktur 1 auf pdf , um die kreisförmigen Strukturdiagramme zu öffnen.
    2. Gehen Sie zu NCBI Blast - Primer Blast15 für das Primer-Design.
    3. Kopieren Sie die ausgewählte Exon-Sequenz, die durch Sequenzierung in Schritt 1.1 ermittelt wurde (die Sequenz, die die niedrigste Anzahl von SNPs oder keine SNPs enthält), und fügen Sie sie in das Feld oben auf der Seite ein.
    4. Verwenden Sie das Symbol < > , um Sequenzen zu markieren und auszuschließen, die SNPs, den Zielstandort und Regionen mit möglicher Bildung von Sekundärstrukturen enthalten.
    5. Wählen Sie die PCR-Produktgröße zwischen 80 und 150 bp und wählen Sie den Organismus.
      HINWEIS: Größere Fragmentgrößen können erfolgreich verwendet werden (~300 bp). Längere Amplikone können jedoch die Empfindlichkeit zwischen Sequenzen verringern, die sich in einem oder nur wenigen Basenpaaren unterscheiden.
    6. Klicken Sie auf Primers abrufen. Wählen Sie 2-3 Paare von Primern aus, die getestet werden sollen (idealerweise sind Primer-Sites ≥20-50 bp von allen CRISPR-Zielstandorten entfernt).
  3. Primer-Validierung
    1. Führen Sie eine Gradienten-PCR mit gDNA von einer einzelnen Person durch.
      1. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, und entfernen Sie eine Probe für das Nicht-Vorlagensteuerelement (NTC) in einem separaten Röhrchen. Fügen Sie die Vorlage dem verbleibenden Master-Mix hinzu und aliquot in eine 96-Well-Platte.
      2. Befolgen Sie die Zyklusparameter: 98 °C 30 s, 34 Zyklen von 98 °C für 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; Endausdehnung von 72 °C für 10 min.
      3. Generieren Sie thermische Schmelzeprofile nach den Parametern: Denaturierungsschritt 95 °C für 1 min, Glühen 60 °C für 1 min, Schmelzkurvenerkennung zwischen 75 °C und 95 °C in 0,2 °C-Schritten mit einer Haltezeit von 10 s bei jeder Temperatur.
        HINWEIS: Es sollten nur Glühtemperaturen mit einem einzigen thermischen Schmelzeprofil verwendet werden.
  4. Fahren Sie fort, die Mutantenlinien mit Embryoneninjektionen wie in12 beschrieben zu erzeugen.

2. Herstellung von genomischer DNA aus Mückenbeinen

  1. Trennen Sie die G1-Mücken im Puppenstadium nach Geschlecht, damit sie sich vor der Genotypisierung nicht paaren, und stellen Sie sicher, dass altersangepasste Wildtyp-Kontrollmücken für Referenzen und Rückkreuzungen zur Verfügung stehen. Trennen Sie sie gleichermaßen nach Geschlechtern.
  2. Sammeln Sie die benötigten Materialien (Abbildung 2A) und bereiten Sie eine 96-Well-PCR-Platte mit 0,5 μL des DNA-Freisetzungsreagenzes und 20 μL Verdünnungspuffer (aus dem gDNA-Freisetzungskit) pro zu genotypisierendem Individuum vor (Abbildung 2B) und lassen Sie es auf Eis liegen. Reservieren Sie zwei Reaktionen für NTC.
  3. Beschriften Sie ein Tablett für Mückenfläschchen (Drosophila Fläschchen), so dass jede Vertiefung auf der 96er Platte dem jeweiligen Mückenfläschchen im Tablett entspricht.
  4. Betäuben Sie die G1-Mücken mit CO2 und legen Sie sie in eine Glas-Petrischale, um sie sediert zu halten (Abbildung 2C, D). Betäuben Sie und legen Sie 8 Wildtyp-Moskitos in eine zweite Petrischale.
  5. Wischen Sie eine Pinzette mit 70% Ethanol ab und entfernen Sie eines der Hinterbeine der Mücke (Abbildung 2E,F).
  6. Tauchen Sie das Bein in die DNA-Freisetzungsreagenzlösung, legen Sie die Mücke in die entsprechende Durchstechflasche und schließen Sie sie mit einem Schwamm (Abbildung 2G, H).
  7. Wischen Sie die Pinzette erneut mit 70% Ethanol ab und entfernen Sie das Bein von der nächsten Mücke. Wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.7, bis die 96-Well-Platte fertig ist.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Pinzette mit 70% Ethanol abzuwischen. Dies minimiert die DNA-Kreuzkontamination.
  8. Versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattendichtung (Abbildung 2I) und inkubieren Sie die 96-Well-Platte, die die Beine enthält, bei Raumtemperatur (RT) für 2-5 min und dann bei 98 °C für 2 min. Lassen Sie die Platte während der Zubereitung der PCR-Mischung auf RT abkühlen.
    HINWEIS: Der gesamte Prozess dauert in der Regel 3-4 h. Wenn die Moskitos länger als die erwartete Dauer (insbesondere ≥1 Tag) in den Fläschchen aufbewahrt werden müssen, legen Sie bei jeder Mücke ein kleines Stück Rosine (oder eine Quelle für Zucker und Wasser) auf, um das Überleben der Moskitos während längerer Inkubationen zu gewährleisten.

3. HRMA

  1. Führen Sie eine PCR durch.
    1. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, die die folgenden Komponenten pro Reaktion enthält: 10 μL 2x Puffer (aus dem gDNA-Freisetzungskit), 0,5 μM jeder Grundierung, 1 μL EvaGreen-Farbstoff, 0,4 μL Polymerase (aus gDNA-Freisetzungskit) und bis zu 19 μL mit molekularem Wasser.
    2. Übertragen Sie mit einem Mehrkanal-Pipett 19 μL des Master-Mixes in jede Vertiefung. 1 μL der in Abschnitt 2 hergestellten DNA-Freisetzungslösung, die Mücken-DNA enthält, auf die Platte übertragen (Abbildung 3A). Versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattendichtung.
    3. Führen Sie die PCR nach den Zyklusparametern durch: 98 °C für 5 min, 39 Zyklen von 98 °C für 10 s, die gewählte Glühtemperatur (72 °C) für 30 s; Endverlängerung 72 °C für 2 min.
  2. Generieren Sie thermische Schmelzeprofile nach den Parametern: Denaturierungsschritt 95 °C für 1 min, Glühen 60 °C für 1 min, Schmelzkurvenerkennung zwischen 75 °C und 95 °C in 0,2 °C-Schritten mit einer Haltezeit von 10 s bei jeder Temperatur. Eine detaillierte Beschreibung des Software-Setups für HRMA-Ausführung mit dem CFX96-Echtzeitsystem finden Sie im Ergänzenden Material und in der ergänzenden Abbildung S1-S5 .
  3. Untersuchen Sie die Schmelzeprofile (Abbildung 3B). Weisen Sie dem Referenzcluster ein Wildtype-Steuerelement zu.
    HINWEIS: Die Software (siehe Materialtabelle) normalisiert die Daten automatisch und bezeichnet Cluster mit Farben für verschiedene Schmelzekurven.
  4. Markieren Sie die verschiedenen Cluster mit den entsprechenden Farben auf der 96-Well-Vorlage (Abbildung 3C).
  5. Wählen Sie die Personen mit interessanten Kurven aus, entfernen Sie sie aus den Röhren, und kreuzen Sie sie zurück (Abbildung 3D). Füttern Sie die gepaarten Weibchen mit Blut und sammeln Sie G2-Eier .

4. Sequenzverifikation durch Sanger-Sequenzierung

  1. Reinigen Sie das PCR-Produkt aus den Vertiefungen mit ausgewählten Moskitos (von der in Abschnitt 3.1 vorbereiteten Platte), verwenden Sie ein Enzym, um die verbleibenden PCR-Primer abzubauen, und dephosphorylieren Sie überschüssige dNTPs. Alternativ können Sie ein beliebiges Spaltenbereinigungskit verwenden und mit der Sequenzierung der Proben fortfahren.
    HINWEIS: Die direkte Sequenzierung kann schwieriger sein, wenn die PCR-Produktgröße klein ist (≤200 bp). Entwerfen Sie in solchen Fällen Primer, um größere Fragmente, die die Zielstelle umfassen (≥250 bp), zu amplifizieren und durch PCR unter Verwendung der DNA in der 96-Well-Platte zu amplifizieren (Schritt 2.2).
  2. Analysieren und identifizieren Sie die Indels mithilfe der Trace-Viewer-Software (Abbildung 4). Alternativ kann die Poly Peak Parser Software20 helfen, die Mutation bei heterozygoten Personen nachzuweisen.
    1. Gehen Sie zur Poly Peak Parser-Website, wählen Sie die Sequenz aus den mutierten Individuen im Menü Durchsuchen aus und kopieren Sie die Referenzsequenz und fügen Sie sie in das Feld ein.
      HINWEIS: Die Ausrichtung zwischen dem alternativen Allel und der Referenz wird automatisch auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Moskitos, die Mutationen in den Genen AaeZIP11 (mutmaßlicher Eisentransporter21) und Myo-fem (ein weiblich voreingenommenes Myosin-Gen im Zusammenhang mit Flugmuskeln13) enthalten, wurden mit der CRISPR/Cas9-Technologie gewonnen, mit HRMA genotypisiert und sequenzverifiziert (Abbildung 5). Abbildung 5A und Abbildung 5C zeigen die normalisierte Fluoreszenzintensität aus den HRM-Kurven aus AaeZIP11- bzw. Myo-Fem-Mutantenproben zusammen mit Wildtyp-Kontrollen. Abbildung 4B und Abbildung 4D zeigen die Vergrößerung der Differenzkurven (aus den AaeZIP11- bzw. Myo-fem-Mutantenproben) zwischen den Schmelzprofilen der verschiedenen Cluster, die von der Software nach Abzug jeder Kurve von der Wildtypreferenz zugewiesen wurden. Heterozygote und homozygote mutierte AaeZIP11-Individuen wurden in verschiedenen Clustern platziert und sind leicht von den Wildtyp-Kontrollen zu unterscheiden (Abbildung 5B). Heterozygote mutierte Myo-Fem-Individuen unterscheiden sich ebenfalls von den Kontrollen (Abbildung 5D). Beachten Sie, dass in beiden Fällen zwei Cluster innerhalb der Wildtyp-Kontrollen vorhanden waren, höchstwahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von SNPs in der Zielregion (Abbildung 5), was die Notwendigkeit unterstreicht, mehrere Kontrollproben zu verwenden, um die Kategorisierung von Kontrollen als Mutanten zu vermeiden, wenn SNPs nicht vermieden werden können.

Abbildung 4A zeigt die Sequenzanalyse der AaeZIP11-Mutante . Das Elektropherogramm von AaeZIP11 heterozygoten Mutanten zeigt die Nukleotidposition an, in der der Indel aufgetreten ist. Dies wird durch eine Verschiebung von Einzel- zu Doppelpeaks dargestellt, da polymorphe Positionen beide Nukleotide gleichzeitig zeigen (Abbildung 4A). Die Anzahl der gelöschten oder eingefügten Basenpaare wurde berechnet, indem die einzelnen Peaks am Ende des Laufs gezählt wurden (Abbildung 4B), da einer der DNA-Stränge kürzer oder länger ist als der andere um die Anzahl der basenpaare, die gelöscht bzw. eingefügt wurden. Es wird empfohlen, sequenzverifizierte gDNA aus den Mutanten als Referenz für die Identifizierung der Heterozygoten zu verwenden, um HRMA-Analysen für nachfolgende Generationen zu unterstützen. Eine manuelle Zuweisung für die Kurven kann erforderlich sein, wenn ähnliche Kurven automatisch verschiedenen Clustern zugewiesen werden. Dies kann durch den Vergleich der temperaturverschobenen Kurven und Differenzkurven erfolgen. Möglicherweise ist eine manuelle Anpassung der Software erforderlich, um Samples den Clustern ordnungsgemäß zuzuordnen. HRMA-Ergebnisse von AaeZIP11 und einer Mutante namens Aeflightin zeigen, dass individuelle Probenanalysen erforderlich waren, um Heterozygoten, Homozygoten und Transheterozygoten erfolgreich zu kategorisieren. Anfangs konnte die automatische Clusterzuweisung aus der Software keine richtige Unterscheidung zwischen den Gruppen treffen (Abbildung 6A, Abbildung 6C, Abbildung 6E und Abbildung 6G). Jede Probe wurde dann einzeln analysiert und den richtigen Gruppen zugeordnet, basierend auf der Ähnlichkeit mit Referenzproben von Heterozygoten, Homozygoten und Trans-Heterozygoten (zuvor durch Sequenzierung verifiziert) (Abbildung 6B, Abbildung 6D, Abbildung 6F und Abbildung 6H).

Figure 1
Abbildung 1: SNP-Identifikation. Schematische Darstellung der Ausrichtung mehrerer Sequenzen des AaeZIP11-Fragments aus wild-type. In Rot sind die SNPs, und in Grün sind die Fragmente frei von SNPs; Diese sNP-freie Region wird für das sgRNA- und Primer-Design vorgeschlagen. Abkürzungen: SNP = Single Nucleotide Polymorphism; sgRNA = Einzelleiter-RNA; LVP = Liverpool-Stamm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Experimentelles Verfahren zur Gewinnung genomischer DNA aus Mückenbeinen für HRMA. (A) Materialien zur Gewinnung genomischer DNA, einschließlich Pipetten, Spitzen, PCR-Platte, optisches Siegel, Reservoir, Verdünnungspuffer und DNA-Freisetzungslösung. (B) PCR-Plattenpräparat mit DNA-Freisetzungsreagenz und Verdünnungspuffer. (C) Mückenanästhesie mit CO2. (D) Abwischen der Pinzette mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden. (E) Versuchsaufbau mit Pinzette, Gestell für Mückenfläschchen, Petrischale auf einem Eisbehälter mit betäubten Moskitos und der zuvor vorbereiteten PCR-Platte. (F) Entfernung des Mückenbeins. (G) Zoom-Ansicht des Mückenbeins, das in die DNA-Freisetzungsreagenzlösung eingetaucht wird. H) Einzelne Mücke in der Durchstechflasche. (I) Versiegelung der PCR-Platte mit den Mückenbeinen. Abkürzung: HRMA = High-Resolution Melt Analysis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Experimentelle Vorgehensweise für HRM-Analysen. (A) Übertragung der freigesetzten gDNA auf eine 96-Well-Platte, die die PCR-Mischung enthält. (B) Sichtprüfung der Differenzkurven. (C) Markieren jeder Probe auf der 96-Well-Schablone mit der gleichen Farbe wie die jeweilige Differenzkurvenfarbe. (D) Rückkreuzung der Individuen aus demselben Cluster. Abkürzungen: HRM = high-resolution melt; gDNA = genomische DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Sequenzanalyse einer AaeZIP11-Mutante . (A) Nukleotid-Alignment der AaeZIP11Δ56-Mutante. Gelb hervorgehobene Bindestriche sind die gelöschten Basen. In der Box geht das Elektropherogramm von einzelnen Peaks zu doppelten Peaks über und zeigt die Position an, an der die Deletion stattgefunden hat (Pfeil). (B) Elektropherogramm des Endes des Sequenzierungslaufs und des Übergangs von Double Peaks zu Single Peaks. Beachten Sie, dass die Anzahl der einzelnen Peaks die Anzahl der gelöschten Basen darstellt (graues Rechteck). Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: HRMA von DNA, die aus Mückenbeinen extrahiert wurde. DNA wurde aus einem einzigen Bein aus AaeZIP11 (A und B) und Myo-Fem (C und D) Knockout Ae. aegypti Moskitos extrahiert und von HRMA analysiert. A und C bezeichnen die normierten Fluoreszenzsignale der Proben auf Relativwerte von 1,0 bis 0. B und D bezeichnen die Vergrößerung der Kurvendifferenzen, indem jede Kurve von der Wildtypreferenz (Liverpool-Dehnung) subtrahiert wird. Abkürzungen: HRMA = high-resolution melt analysis; LVP = Liverpool-Stamm; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Beispiele für manuelle Gruppenzuordnungen. (A-D) HRMA für Aeflightin-Mutanten. (A und C) Schmelzekurven (normalisierte lineare Skalenkurven bzw. Differenzkurven) werden automatisch von der Precision Melt Analysis Software gruppiert. (B) Normalisierung von Differentialkurven, die manuell geändert wurden. (D) Nach Änderung der Normalisierung der Differentialkurven wurde jede Probe individuell durch die Spitzentemperaturen in den Differenzkurven für entsprechende Positivkontrollen (zuvor sequenzierte Proben, die durch Δ4- und Δ5-Heterozygoten und Δ4Δ5-Transheterozygoten identifiziert wurden) zugeordnet, was die eindeutige Identifizierung der 3 Gruppen ermöglichte. Rote und braune Pfeile werden hinzugefügt, um die Gipfel bei verschiedenen Temperaturen hervorzuheben. (E-H) HRMA für AaeZIP11-Mutanten. (E und G) Schmelzekurven werden von der Software automatisch zugewiesen. (F und H) Mutanten in der zweiten heterozygoten Selbstkreuzung wurden durch die Ähnlichkeit der normalisierten und Differenzkurven zu zuvor bestimmten Referenzen (farbcodiert in Kurven) den richtigen Gruppen zugeordnet. Heterozygotes asg, Homozygotes asg und Trans-heterozygotes asg: zugewiesene Schmelzkurven von precision melt analysis software. Abkürzungen: HRMA = high-resolution melt analysis; LVP = Liverpool-Stamm; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Material: Detailliertes Protokoll zur Einrichtung von HRMA im CFX96 Real-Time System (z.B. Bio-rad).

Ergänzende Abbildung S1: Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Einrichten des Zyklusprotokolls auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 2.1-2.3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Einrichtung einer Platte auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 3.1-3.4. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Schritt-für-Schritt-Anleitung für eine Platteneinrichtung auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 3.5-3.6. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Run-Setup auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 4.1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S5: Schritt-für-Schritt-Anleitung für die HRMA-Analyse auf Bio-rad CFX Manager. Siehe ergänzendes Material 5.1-5.3. Abkürzung: HRMA = High-Resolution Melt Analysis. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Liste der Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die hochauflösende Schmelzeanalyse bietet eine einfache und schnelle Lösung für die Identifizierung von Indeln, die durch die CRISPR/Cas9-Technologie in der Vektormücke Ae. aegypti erzeugt werden. Es bietet Flexibilität und ermöglicht die Genotypisierung von Mücken, die für eine Vielzahl von Genen mutiert sind, vom Flugmuskel bis zum Eisenstoffwechsel und mehr13,14. HRMA kann in nur wenigen Stunden von der Probenentnahme bis zur endgültigen Analyse durchgeführt werden. Zusätzliche Zeit ist für das Primerdesign erforderlich und hängt auch von der Zeit ab, um die benötigten Sequenzierungsergebnisse (zur Identifizierung der SNPs), Sequenzanalysen und Primerreihenfolge zu erhalten.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Schritt-für-Schritt-Methoden für erfolgreiche Analysen. Einer der kritischsten Schritte in diesem Prozess ist das richtige Design der Primer. HRMA ist so empfindlich, dass das Vorhandensein eines einzigen SNP innerhalb des amplifizierten Fragments zu einer starken Differenzkurve führen kann, die als Mutation fehlinterpretiert werden könnte. Die Sequenzierung von Laborkolonieproben vor der CRISPR-Mutagenese ermöglicht den Nachweis und die Vermeidung von SNP-reichen Regionen bei der Gestaltung des Ziels. die HRMA-Primer werden dazu beitragen, dieses Problem zu verhindern. Die Entwicklung von Primern für kleine Amplikonen (70-100 bp) kann auch die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Experiments verbessern, da größere Fragmente mehrere Schmelzdomänen aufweisen können, was die Wahrscheinlichkeit verringert, Varianten zu unterscheiden22. Eine Einschränkung der Technik besteht darin, dass die vollständige Vermeidung von SNPs je nach Gen möglicherweise nicht möglich ist. Daher kann die Sequenzierung und weitere Verwendung mehrerer Wildtyp-Kontrollindividuen die Analysen unterstützen.

Speziell für dieses Protokoll ist es wichtig, genotypisierte Moskitos am Leben zu erhalten, damit sie für die Etablierung von Mutantenlinien rückgekreuzt werden können. Das Entfernen eines der Mückenbeine zur Extraktion von gDNA kann der am wenigsten invasive Weg sein, dies zu erreichen. Die Menge an gDNA, die aus diesem Gewebe gewonnen wird, ist jedoch minimal. Das in der Materialtabelle vorgeschlagene Kit war ausreichend, um DNA aus einem Mückenbein zu gewinnen und die PCR durchzuführen, um HRMA abzuschließen.

HRMA kann mehr Flexibilität in Bezug auf den Nachweis eines breiten Spektrums von Indelgrößen bieten, die von Single-Base-Mismatches bis hin zu mehreren Basenpaaren (AaeZIP11 hatte eine 56-bp-Deletion) und übertreffende Methoden wie SNA oder T7E1 (beide Enzyme Mismatch-Spaltungsassays), die auf Single-Base-Mismatch oder kleine Deletionen (~ 20 bp) beschränkt sind5, 23. Auflage. Darüber hinaus weist SNA keine homozygoten Mutanten nach, da die PCR-Produkte keine Mismatches enthalten. Darüber hinaus können SNA-Ergebnisse auch durch natürlich vorkommende allelische Polymorphismen maskiert werden, wenn die mit Nuklease behandelten PCR-Produkte eine ähnliche Länge wie die mutierten Allele aufweisen. Keine dieser Einschränkungen gilt für HRMA. Letztendlich ist die Sequenzierung notwendig, um die mutierte DNA-Sequenz zu identifizieren. Sobald jedoch eine fragliche Mutation bekannt ist, ist HRMA, die zur Identifizierung von mutierten Individuen verwendet wird, viel schneller als die direkte Sequenzierung. Diese Methode bewahrt wertvolle Proben (je mehr Moskitos überleben, desto weniger müssen sie auf ihre Genotypergebnisse warten) und reduziert die Notwendigkeit der Sequenzierung einer großen Anzahl von Proben, wodurch die Gesamtkosten des Experiments gesenkt werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Alle Figuren wurden mit Biorender.com unter einer Lizenz der Texas A&M University erstellt. Diese Arbeit wurde durch Mittel des National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 und AI115138 bis Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research im Rahmen des Insect Vectored Disease Grant Program und des USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1018401 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Tags

Genetik Heft 175
Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der <em>Mücke Aedes aegypti</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes,… More

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O'Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter