Summary
Denna artikel beskriver ett protokoll för snabb identifiering av indels inducerad av CRISPR/Cas9 och urval av mutant linjer i myggan Aedes aegypti med hjälp av högupplöst smältanalys.
Abstract
Mygggenredigering har blivit rutin i flera laboratorier med etablering av system som transkription-activator-liknande effektor nukleaser (TALENs), zinkfinger nukleaser (ZFNs) och homing endonucleases (HEs). På senare tid har grupperad regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerad protein 9 (Cas9) teknik erbjudit ett enklare och billigare alternativ för precisionsgenomteknik. Efter nukleasverkan kommer DNA-reparationsvägar att fixa de trasiga DNA-ändarna, vilket ofta introducerar indels. Dessa out-of-frame mutationer används sedan för att förstå genfunktionen i målorganismerna. En nackdel är dock att mutanta individer inte bär någon dominerande markör, vilket gör identifiering och spårning av mutanta alleler utmanande, särskilt i skalor som behövs för många experiment.
Högupplöst smältanalys (HRMA) är en enkel metod för att identifiera variationer i nukleinsyrasekvenser och använder PCR-smältkurvor för att upptäcka sådana variationer. Denna post-PCR-analysmetod använder fluorescerande dubbelsträngade DNA-bindande färgämnen med instrumentering som har kapacitet för temperaturrampkontrolldata och enkelt skalas till 96-brunnsplåtformat. Beskrivs här är ett enkelt arbetsflöde med HRMA för snabb detektion av CRISPR/Cas9-inducerade indels och upprättandet av mutanta linjer i myggan Ae. aegypti. Kritiskt kan alla steg utföras med en liten mängd benvävnad och kräver inte att man offrar organismen, vilket gör att genetiska kors eller fenotypningsanalyser kan utföras efter genotypning.
Introduction
Som vektorer av patogener som dengue1, Zika2 och chikungunya3 virus, liksom malarial parasiter4, utgör myggor ett betydande hot mot folkhälsan mot människor. För alla dessa sjukdomar finns det ett betydande fokus på överföringsingripande på kontroll av myggvektorer. Studier av de gener som är viktiga för till exempel tillåtande för patogener, mygg fitness, överlevnad, reproduktion och resistens mot insekticider är nyckeln till att utveckla nya myggbekämpningsstrategier. För sådana ändamål blir genomredigering i myggor en vanlig praxis, särskilt med utvecklingen av tekniker som HEs, ZFNs, TALEN och nu senast CRISPR med Cas9. Upprättandet av genredigerade stammar innebär vanligtvis att man korsar individer som bär på önskade mutationer i några generationer för att minimera off-target och founder (flaskhals) effekter, följt av att korsa heterozygous individer för att generera homozygous eller trans-heterozygous linjer. I avsaknad av en dominerande markör är molekylär genotypning nödvändig i denna process eftersom i många fall inga tydliga fenotypiska egenskaper kan detekteras för heterozygous mutanter.
Även om sekvensering är guldstandarden för genotypisk karakterisering, innebär utförandet av detta över hundratals, eller möjligen tusentals individer, betydande kostnader, arbete och tid som krävs för att få resultat, vilket är särskilt viktigt för organismer med kort livslängd som myggor. Vanliga alternativ är Surveyor nukleasanalys5 (SNA), T7E1-analys6 och högupplöst smältanalys (HRMA, granskad i7). Både SNA och T7E1 använder endonucleases som bara klyver omaka baser. När en muterad region av heterozygous mutantgenom förstärks, DNA fragment från mutanta och vilda-typ alleler glödgas för att göra omaka dubbelsträngat DNA (dsDNA). SNA upptäcker förekomsten av missmatchningar via matsmältningen med en missmatchningsspecifik endonukleas och enkel agarose gel elektrofores. Alternativt använder HRMA de termodynamiska egenskaperna hos dsDNA som detekteras av dsDNA-bindande fluorescerande färgämnen, med disassociationstemperaturen för färgämnet varierar baserat på närvaron och typen av mutation. HRMA har använts för påvisande av enstaka nukleotidpolymorfismer (SNPs)8, mutant genotypning av zebrafisk9, mikrobiologiska tillämpningar10 och växtgenetisk forskning11, bland andra.
Detta dokument beskriver HRMA, en enkel metod för molekylär genotypning för mutant myggor genereras av CRISPR/Cas9 teknik. Fördelarna med HRMA jämfört med alternativa tekniker inkluderar 1) flexibilitet, eftersom det har visat sig användbart för olika gener, ett brett spektrum av indelstorlekar, liksom skillnaden mellan olika indelstorlekar och heterozygous, homozygous och trans-heterozygous differentiering12,13,14, 2) kostnad, eftersom den är baserad på vanliga PCR-reagenser, och 3) tidsbesparande, eftersom det kan utföras på bara några timmar. Dessutom använder protokollet en liten kroppsdel (ett ben) som en källa till DNA, vilket gör det möjligt för myggan att överleva genotypningsprocessen, vilket gör det möjligt att etablera och underhålla mutanta linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Skanning efter enstaka nukleotidpolymorfismer (SNPs), HRMA primer design och primer validering
- SNP-identifiering i laboratoriemyggor av vild typ
- Välj målexon för att störa korrekt polypeptidöversättning.
OBS: Målet ska vara nära startkodonet eller bland viktiga rester som krävs för proteinfunktionen. Ju kortare exon (t.ex. ≤200 baser), desto svårare är det att rikta in sig på och analysera. Undvik att redigera nära gränserna för en exon, eftersom detta tvingar en av HRMA-primers att antingen korsa en intron eller vara i en intron. Detta är inte önskvärt eftersom SNP-räntorna tenderar att vara mycket högre i dessa regioner. - Primer design
- Gå till NCBI Blast - Primer Blast webbplats15, kopiera och klistra in den valda exon i rutan högst upp på sidan | välja PCR-produktstorlek (se till att den omfattar det mesta av exon) | välj organismen.
- Klicka på Avancerade parametrar | Välj (för PCR Product Tm) och tillsätt 60 (för en optimal temperatur på 60 °C) | Hämta Primers. Behåll de andra parametrarna som standard.
- Få genomiskt DNA (gDNA) från laboratoriekolonin av vild typ. Lägg åt sidan 10 myggor, bedöva dem med CO2 och placera dem i en Petri-maträtt på is för att hålla dem inaktiva. Sätt upp 10 rör som innehåller 0,5 μL reagens för frisättning av DNA från vävnad och 20 μL utspädningsbuffert, båda i det DNA-frigöringskit som föreslås i tabellen över material.
- Ta bort ett ben från en enda mygga med tång och placera den i ett motsvarande rör av en utspädd lösning av DNA-frisättningsreagenset (från steg 1.1.3), helt nedsänkt benet i lösningen. Upprepa detta steg med de återstående myggorna, torka tången med 70% etanol innan du fortsätter till nästa.
- Inkubera den beninnehållande lösningen vid rumstemperatur i 2-5 min, sedan vid 98 °C i 2 minuter, och låt den svalna medan PCR-reaktionen sätts in.
OBS: Plattor som innehåller det frisläppta gDNA kan förvaras vid -20 °C, och protokollet kan pausas vid denna tidpunkt. - Förbered 10 rör som innehåller 10 μL 2x PCR Master Mix, primers till en slutlig koncentration på 0,5 μM och vatten av molekylär kvalitet till en slutlig volym på 20 μL och överför 1 μL av det utspädda provet till varje rör. Utför PCR enligt dessa cykelparametrar: 98 °C 5 min, 40 cykler på 98 °C för 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s per kb; slutlig förlängning av 72 °C i 1 min.
- Rena PCR-produkterna med ett enzym för att bryta ned de återstående PCR-primersna och defrosforylat överflödiga dNTPs eller någon kolumnrensningssats. Fortsätt med sekvensering av proverna.
- Analysera varje elektrosfärogram för förekomst av dubbla toppar/tvetydiga baser och justera bas anrop manuellt i varje sekvens med lämplig degenererad baskod.
OBS: Det här steget måste utföras före justering av flera sekvenser eftersom det är vanligt att bassamtalsprogramvaran väljer den mer framträdande toppen som det "sanna" basanropet, vilket ger det falska intrycket av frånvaro av SNPs. - Utför en justering av flera sekvenser med hjälp av justeringsprogramvaran SeqMan Pro, som listas i tabellen över material eller annan programvara för justering med öppen källkod, till exempel ClustalW16 eller T-Coffee17.
- Öppna justeringsprogramvaran | Klicka på Lägg till sekvenser | välj önskade sekvenser och klicka på Lägg till | När alla sekvenser har valts klickar du på Klar.
- Klicka på Montera för att utföra justeringen. För att öppna justeringen, klicka på Contig 1 och analysera justeringen och identifiera SNPs (bild 1).
OBS: Som ett alternativ till steg 1.1.3-1.1.6 kan PCR utföras från isolerat genomiskt DNA som erhållits från bulkprover (härledda från >10 individer). Sekvenserade ampliconer kan analyseras direkt för förekomsten av SNPs visas som dubbla toppar i elektropherogrammet, även om sällsynta SNPs kommer att vara svårare att upptäcka.
- Design 3-5 enkelguide RNAs (sgRNAs), undvika regioner som innehåller någon SNP som identifieras ovan, enligt protokollet som beskrivs i18.
- Välj målexon för att störa korrekt polypeptidöversättning.
- HRMA primer design
- Testa exonsekvensen för eventuell bildning av sekundära strukturer under PCR med mFold19.
- Gå till UNAFolds webbserver | klicka på mFold | på rullgardinsmenyn klickar du på Program | DNA-vikningsform.
- Ange sekvensnamnet i rutan och klistra in exon.
- Ändra viktemperaturen till 60 °C; På joniska förhållanden, ändra [Mg++] till 1,5 och på enheter växla till mM; klicka på Fold DNA.
- På Utdata, under struktur 1, klicka på pdf för att öppna cirkulära strukturdiagram.
- Gå till NCBI Blast - Primer Blast15 för primer design.
- Kopiera och klistra in den valda exonsekvensen som bestäms genom sekvensering i steg 1.1 (den sekvens som innehåller det lägsta antalet SNPs eller inga SNPs) i rutan högst upp på sidan.
- Använd symbolen < > för att markera och utesluta sekvenser som innehåller SNPs, målplatsen och regioner med möjlig bildning av sekundär struktur.
- Välj PCR-produktstorleken som ska vara mellan 80 och 150 bp och välj organismen.
OBS: Större fragmentstorlekar kan användas (~ 300 bp). Längre ampliconer kan dock minska känsligheten mellan sekvenser som skiljer sig åt i ett eller bara några baspar. - Klicka på Hämta Primers. Välj 2–3 par primers som ska testas (helst är primer-platser ≥ 20–50 bp från alla CRISPR-målplatser).
- Testa exonsekvensen för eventuell bildning av sekundära strukturer under PCR med mFold19.
- Validering av primer
- Utför en övertonad PCR med gDNA från en enskild individ.
- Förbered en huvudmix och ta bort ett prov för icke-mallkontrollen (NTC) i ett separat rör. Lägg till mallen till den återstående huvudblandningen och aliquot i en 96-brunnsplatta.
- Följ cykelparametrarna: 98 °C 30 s, 34 cykler på 98 °C för 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; slutlig förlängning av 72 °C i 10 min.
- Generera termiska smältprofiler enligt parametrarna: denatureringssteg 95 °C i 1 min, glödgning 60 °C i 1 min, smältkurvadetektering mellan 75 °C och 95 °C i steg om 0,2 °C, med en hålltid på 10 s vid varje temperatur.
OBS: Endast glödgningstemperaturer med en enda termisk smältprofil får användas.
- Utför en övertonad PCR med gDNA från en enskild individ.
- Fortsätt att generera mutantlinjerna med embryoinjektioner enligt beskrivningen i12.
2. Beredning av genomiskt DNA från myggben
- Separera G1-myggorna efter kön i pupalstadiet så att de inte parar sig före genotypning och se till att åldersmatchade, vilda kontrollmyggor kommer att vara tillgängliga för att användas för referenser och backcrosses. Könsseegressa dem på samma sätt.
- Samla ihop de material som behövs (figur 2A) och förbered en 96-brunns PCR-platta med 0,5 μL av DNA-frisättningsreagenset och 20 μL utspädningsbuffert (från gDNA-frigöringssatsen) per individ som ska genotypas (figur 2B) och lämna den på is. Reservera två reaktioner för NTC.
- Märk en bricka för myggflaska (Drosophila injektionsflaska) så att varje brunn på 96-plattan motsvarar respektive myggflaska i brickan.
- Bedöva G1-myggorna med CO2 och placera dem i en petriskål i glas för att hålla dem nedsövda (figur 2C, D). Bedöva och placera 8 vilda myggor i en andra Petri-maträtt.
- Torka av ett par pincett med 70% etanol och ta bort ett av myggbenen (figur 2E, F).
- Sänk ner benet i DNA-frisättningsreagenslösningen, placera myggan i motsvarande injektionsflaska och stäng den med en svamp (figur 2G,H).
- Torka pincetterna igen med 70% etanol och fortsätt med att ta bort benet från nästa mygga. Upprepa steg 2.5-2.7 tills 96-brunnsplattan är klar.
OBS: Det är viktigt att torka pincetterna med 70% etanol. Detta minimerar DNA-korskontaminering. - Försegla plattan med en optisk PCR-plåttätning (figur 2I) och inkubera 96-brunnsplattan som innehåller benen vid rumstemperatur (RT) i 2-5 min och sedan vid 98 °C i 2 min. Låt plattan svalna till RT medan du förbereder PCR-blandningen.
OBS: Hela processen tar vanligtvis 3-4 timmar. Om myggorna måste hållas i injektionsflaskan under mer tid än den förväntade varaktigheten (särskilt ≥1 dag), placera en liten bit russin (eller källa till socker och vatten) med varje mygga för att säkerställa myggens överlevnad under förlängda inkubationer.
3. HRMA
- Utför PCR.
- Förbered en huvudblandning som innehåller följande komponenter per varje reaktion: 10 μL 2x buffert (från gDNA-frisättningssatsen), 0,5 μM av varje primer, 1 μL EvaGreen-färgämne, 0,4 μL polymeras (från gDNA-utlösningssats) och komplett till 19 μL med molekylärt vatten.
- Överför 19 μL av huvudblandningen till varje brunn med hjälp av en flerkanalsrör. Överför 1 μL av DNA-frisättningslösningen som innehåller mygg-DNA som framställts i avsnitt 2 till plattan (figur 3A). Försegla plattan med en optisk PCR-plåttätning.
- Utför PCR enligt cykelparametrarna: 98 °C i 5 min, 39 cykler på 98 °C i 10 s, vald glödgningstemperatur (72 °C) i 30 s; slutlig förlängning 72 °C i 2 min.
- Generera termiska smältprofiler enligt parametrarna: denatureringssteg 95 °C i 1 min, glödgning 60 °C i 1 min, smältkurvadetektering mellan 75 °C och 95 °C i steg om 0,2 °C, med en hålltid på 10 s vid varje temperatur. Se kompletterande material och kompletterande figur S1-S5 för en detaljerad beskrivning av programvaruinställningen för HRMA-körning med CFX96 Real-Time System.
- Undersök smältprofilerna (bild 3B). Tilldela kontroll av vildtyp till referensklustret.
OBS: Programvaran (se tabellen över material) normaliserar automatiskt data och betecknar kluster med färger för olika smältkurvor. - Markera de olika klustren med motsvarande färger på 96-brunnsmallen (bild 3C).
- Välj personer med kurvor av intresse, ta bort dem från rören och backcross (figur 3D). Blodmata de parade honorna och samla G2-ägg .
4. Sekvensverifiering av Sanger-sekvensering
- Rena PCR-produkten från brunnarna med utvalda myggor (från plattan som bereds i avsnitt 3.1), med hjälp av ett enzym för att bryta ner de återstående PCR-primersna och defrosforera överskott av dNTPs. Alternativt kan du använda valfri kolumnrensningssats och fortsätta med sekvensering av proverna.
OBS: Direkt sekvensering kan vara mer utmanande när PCR-produktstorleken är liten (≤200 bp). I sådana fall, designa primers för att förstärka större fragment som omfattar målplatsen (≥ 250 bp) och förstärka genom PCR med hjälp av DNA i 96-brunnsplattan (steg 2.2). - Analysera och identifiera indels med hjälp av spårningsvisare (bild 4). Alternativt kan Poly Peak Parser programvara20 hjälpa till att upptäcka mutationen hos heterozygous individer.
- Gå till Webbplatsen Poly Peak Parser, välj sekvensen från mutanta individer på Bläddra-menyn och kopiera och klistra in referenssekvensen i rutan.
Justeringen mellan den alternativa allelen och referensen visas automatiskt till höger på skärmen.
- Gå till Webbplatsen Poly Peak Parser, välj sekvensen från mutanta individer på Bläddra-menyn och kopiera och klistra in referenssekvensen i rutan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myggor som innehåller mutationer i generna AaeZIP11 (förmodat järntransportör21) och myo-fem (en kvinnlig partisk myosingen relaterad till flygmuskler13) erhölls med CRISPR/Cas9-teknik, genotypad med HRMA och sekvensverifierad (figur 5). Figur 5A och figur 5C visar den normaliserade fluorescensintensiteten från HRM-kurvorna från AaeZIP11 respektive myo-fem mutantprover, tillsammans med kontroller av vild typ. Figur 4B och figur 4D visar förstoringen av differenskurvorna (från AaeZIP11 respektive myo-fem mutantproverna) mellan smältprofilerna för de olika kluster som tilldelats av programvaran efter att ha subtraherat varje kurva från referensen av vildtyp. Heterozygous och homozygous mutant AaeZIP11 individer placerades i olika kluster och skiljer sig lätt från vilda kontroller (figur 5B). Heterozygous mutant myo-fem individer skiljer sig också från kontrollerna (figur 5D). Observera att två kluster inom kontrollerna av vild typ fanns i båda fallen, troligen på grund av förekomsten av SNPs i målregionen (figur 5), vilket belyser behovet av att använda flera kontrollprover för att undvika att kategorisera kontroller som mutanter när SNPs inte kan undvikas.
Figur 4A visar sekvensanalysen av AaeZIP11 mutanten. Elektropherogrammet från AaeZIP11 heterozygous mutanter anger nukleotidpositionen där indeln inträffade. Detta representeras av en övergång från enkla till dubbla toppar eftersom polymorfa positioner kommer att visa båda nukleotiderna samtidigt (figur 4A). Antalet baspar som togs bort eller infogades beräknades genom att räkna de enskilda topparna i slutet av körningen (figur 4B) eftersom en av DNA-strängarna blir kortare eller längre än den andra med antalet baspar som raderas respektive infogas. Det rekommenderas att använda sekvensverifierad gDNA från mutanterna som referens för identifiering av heterozygoterna för att hjälpa till med HRMA-analyser för efterföljande generationer. Manuell tilldelning för kurvorna kan behövas när liknande kurvor automatiskt tilldelas olika kluster. Detta kan göras genom att jämföra de temperaturförskjutna kurvorna och differenskurvorna. Manuell justering av programvaran kan behövas för att korrekt tilldela exempel till kluster. HRMA resultat från AaeZIP11 och en mutant som kallas Aeflightin visar att enskilda prov analyser behövdes för att framgångsrikt kategorisera heterozygotes, homozygotes och trans-heterozygotes. Inledningsvis kunde den automatiska klustertilldelningen från programvaran inte göra någon lämplig åtskillnad mellan grupperna (figur 6A, figur 6C, figur 6E och figur 6G). Varje prov analyserades sedan individuellt och tilldelades rätt grupper baserat på likhet med referensprover av heterozygoter, homozygoter och trans heterozygoter (tidigare verifierade genom sekvensering) (figur 6B, figur 6D, figur 6F och figur 6H).
Bild 1: SNP-identifiering. Schematisk representation av flera sekvensjusteringar av AaeZIP11-fragment från vildtyp. I rött är SNPs, och i grönt är fragmenten fria från SNPs; denna SNP-fria region föreslås för sgRNA och primer design. Förkortningar: SNP = single nucleotide polymorphism; sgRNA = enkelstyrning RNA; LVP = Liverpool stam. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Experimentellt förfarande för att erhålla genomiskt DNA från myggben för HRMA. A) Material för erhållande av genomiskt DNA, inklusive pipetter, spetsar, PCR-plattor, optisk tätning, behållare, utspädningsbuffert och DNA-frisättningslösning. B) PCR-plåtpreparat som innehåller reagens och utspädningsbuffert. C) Myggbedövning med CO2. D) Torka pincetterna med 70 % etanol för att förhindra kontaminering mellan proverna. (E) Experimentell installation inklusive pincett, rack för myggflaska, Petriskål ovanpå en isbehållare med sövda myggor och den tidigare beredda PCR-plattan. (F) Avlägsnande av myggbenet. (G) Zoomvy över myggbenet som är nedsänkt i REAGENSlösningen för DNA-frisättning. H) Enstaka mygga placerad i injektionsflaskan. i) Tätning av PCR-plattan som innehåller myggbenen. Förkortning: HRMA = högupplöst smältanalys. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Experimentellt förfarande för HRM-analyser. A) Överföring av den frisläppta gDNA till en 96-well plate som innehåller PCR-blandningen. B) Visuell inspektion av differenskurvorna. (C) Markera varje prov på 96-brunnsmallen med samma färg som dess respektive differenskurvafärg. (D) Backcrossing individer från samma kluster. Förkortningar: HRM = högupplöst smältning; gDNA = genomiskt DNA. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Sekvensanalys av en AaeZIP11-mutant . A) Nukleotidjustering av mutanten AaeZIP11Δ56. Streck markerade i gult är de borttagna baserna. I rutan övergår elektropherogrammet från enkla toppar till dubbla toppar, som visar den position där borttagningen inträffade (pil). B) Elektroferogram av slutet av sekvenseringskörningen och övergången från dubbla toppar till enstaka toppar. Observera att antalet enstaka toppar representerar antalet baser som tagits bort (grå rektangel). Primersekvenser finns i tilläggstabellen S1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: HRMA av DNA extraherat från myggben. DNA extraherades från ett enda ben från AaeZIP11 (A och B) och myo-fem (C och D) knockout Ae. aegypti myggor och analyseras av HRMA. A och C betecknar provernas normaliserade fluorescenssignaler till relativa värden på 1,0 till 0. B och D betecknar förstoringen av kurvskillnaderna genom att subtrahera varje kurva från referensen av vildtyp (Liverpool-stammen). Förkortningar: HRMA = högupplöst smältanalys; LVP = Liverpool stam; RFU = relativa fluorescensenheter. Primersekvenser finns i tilläggstabellen S1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Exempel på manuella grupptilldelningar. (A-D) HRMA för Aeflightin-mutanter. (A och C) Smältkurvor (normaliserade linjära skalkurvor respektive differenskurvor) grupperas automatiskt av Precision Melt Analysis Software. B) Normalisering av differentialkurvor ändras manuellt. D) Efter att normaliseringen av differentialkurvorna har ändrats tilldelades varje prov individuellt av topptemperaturerna i differenskurvorna för motsvarande positiva kontroller (tidigare sekvenserade prover som identifierats av heterozygoter Δ4 och Δ5 och Δ4Δ5 trans heterozygoter), vilket gjorde det möjligt att tydligt identifiera de tre grupperna. Röda och bruna pilar läggs till för att markera topparna vid olika temperaturer. (E-H) HRMA för AaeZIP11 mutanter. (E och G) Smältkurvor tilldelas automatiskt av programvaran. (F och H) Mutanter i det andra heterozygous självkorset tilldelades på lämpligt sätt till rätt grupper genom likheten mellan de normaliserade kurvorna och differenskurvorna till tidigare bestämda referenser (färgkodade i kurvor). Heterozygotes asg, Homozygotes asg och Trans-heterozygotes asg: tilldelade smältkurvor av Precision Melt Analysis Software. Förkortningar: HRMA = högupplöst smältanalys; LVP = Liverpool stam; RFU = relativa fluorescensenheter. Primersekvenser finns i kompletterande tabell S1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande material: Detaljerat protokoll för att ställa in HRMA i CFX96 Realtidssystem (t.ex. Bio-rad). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: Steg-för-steg-instruktioner för att ställa in cykelprotokollet på Bio-rad CFX Manager. Se Kompletterande material 2.1-2.3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Steg-för-steg-instruktioner för en plåtinställning på Bio-rad CFX Manager. Se Kompletterande material 3.1-3.4. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Steg-för-steg-instruktioner för en plåtinställning på Bio-rad CFX Manager. Se Kompletterande material 3.5-3.6. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Steg-för-steg-instruktioner för körningsinstallationen på Bio-rad CFX Manager. Se Kompletterande material 4.1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S5: Steg-för-steg-instruktioner för HRMA-analys på Bio-rad CFX Manager. Se Kompletterande material 5.1-5.3. Förkortning: HRMA = högupplöst smältanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Lista över primers. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Högupplöst smältanalys erbjuder en enkel och snabb lösning för identifiering av indels som genereras av CRISPR/Cas9-tekniken i vektormyggan Ae. aegypti. Det ger flexibilitet, vilket möjliggör genotypning av myggor muterade för ett brett spektrum av gener från flygmuskel till järnmetabolism och mer13,14. HRMA kan utföras på bara några timmar från provsamling till de slutliga analyserna. Ytterligare tid krävs för primer-design och beror också på tiden för att ta emot nödvändiga sekvenseringsresultat (för identifiering av SNPs), sekvensanalyser och primerbeställning.
Protokollet som presenteras här beskriver steg-för-steg-metoderna för framgångsrika analyser. Ett av de mest kritiska stegen i denna process är korrekt design av primers. HRMA är tillräckligt känsligt för att förekomsten av även en enda SNP i fragmentet förstärks kan resultera i en stark skillnadskurva som kan misstolkas som en mutation. Sekvensering av laboratoriekoloniprover före CRISPR-mutagenes gör det möjligt att upptäcka och undvika SNP-rika regioner vid utformningen av målet. HRMA-primers kommer att bidra till att förhindra denna fråga. Att designa primers för små ampliconer (70-100 bp) kan också förbättra experimentets känslighet och reproducerbarhet eftersom större fragment kan presentera flera smältdomäner, vilket minskar chansen att skilja varianter22. En begränsning av tekniken är att helt undvika SNPs kanske inte är genomförbart beroende på genen; Således kan sekvensering och vidare användning av flera personer av vild typ av kontroll underlätta analyserna.
Specifikt för detta protokoll är det viktigt att hålla genotypade myggor vid liv så att de kan backcrossed för etablering av mutantlinjer. Att ta bort ett av myggbenen för att extrahera gDNA kan vara det minst invasiva sättet att uppnå det; Mängden gDNA som återvinns från denna vävnad är dock minimal. Satsen som föreslogs i tabellen av material var tillräcklig för att erhålla DNA från ett myggben och utföra PCR för att slutföra HRMA.
HRMA kan erbjuda mer flexibilitet när det gäller detektion av ett brett utbud av indelstorlekar, allt från enkelbasmatchningar till flera baspar (AaeZIP11 hade en 56 bp-borttagning) och överträffande metoder som SNA eller T7E1 (båda enzymmatchningsmatchningsanalyser) som är begränsade till enbas missmatchning eller små borttagningar (~ 20 bp)5, 23. Dessutom upptäcker SNA inte homozygous mutanter eftersom PCR-produkterna inte innehåller missmatchningar. Dessutom kan SNA-resultaten också maskeras av naturligt förekommande alleliska polymorfismer när nukleasbehandlade PCR-produkter har en liknande längd som mutanta alleler. Ingen av dessa begränsningar är tillämplig på HRMA. I slutändan är sekvensering nödvändig för att identifiera mutant DNA-sekvensen. Men när en mutation i fråga är känd, HRMA används för identifiering av mutanta individer är mycket snabbare än direkt sekvensering. Denna metod bevarar värdefulla prover (fler myggor kommer att överleva, desto mindre måste de vänta på sina genotypresultat) och minskar behovet av sekvensering av ett stort antal prover, vilket sänker den totala kostnaden för experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Alla siffror skapades med Biorender.com under en licens till Texas A&M University. Detta arbete stöddes av medel från National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 och AI115138 till Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research under Insect Vectored Disease Grant Program och USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-projektet 1018401.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
- WHO.
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
