Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.
Abstract
Muggengenbewerking is routine geworden in verschillende laboratoria met de oprichting van systemen zoals transcriptie-activator-achtige effectornucleasen (TALENs), zinkvingernucleasen (ZFN's) en homing-endonucleasen (HE's). Meer recent heeft geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) -technologie een eenvoudiger en goedkoper alternatief geboden voor precisiegenoomtechnologie. Na nuclease-actie zullen DNA-reparatieroutes de gebroken DNA-uiteinden repareren, vaak met indels. Deze out-of-frame mutaties worden vervolgens gebruikt voor het begrijpen van de genfunctie in de doelorganismen. Een nadeel is echter dat mutante individuen geen dominante marker dragen, waardoor identificatie en tracking van mutante allelen een uitdaging is, vooral op schalen die nodig zijn voor veel experimenten.
Hoge resolutie smeltanalyse (HRMA) is een eenvoudige methode om variaties in nucleïnezuursequenties te identificeren en maakt gebruik van PCR-smeltcurven om dergelijke variaties te detecteren. Deze post-PCR-analysemethode maakt gebruik van fluorescerende dubbelstrengs DNA-bindende kleurstoffen met instrumentatie die de mogelijkheid heeft om gegevens vast te leggen op temperatuurstijgingen en eenvoudig kan worden geschaald naar 96-well plaatformaten. Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven met behulp van HRMA voor de snelle detectie van CRISPR / Cas9-geïnduceerde indels en het opzetten van mutantenlijnen in de mug Ae. aegypti. Kritisch is dat alle stappen kunnen worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid beenweefsel en niet vereisen dat het organisme wordt opgeofferd, waardoor genetische kruisingen of fenotyperingstests kunnen worden uitgevoerd na genotypering.
Introduction
Als vectoren van pathogenen zoals dengue1, Zika2 en chikungunya3 virussen, evenals malariaparasieten4, vormen muggen een aanzienlijke bedreiging voor de volksgezondheid voor de mens. Voor al deze ziekten is er een aanzienlijke focus van transmissie-interventie op de bestrijding van muggenvectoren. Studie van de genen die belangrijk zijn in bijvoorbeeld toegeeflijkheid voor pathogenen, muggenconditie, overleving, voortplanting en resistentie tegen insecticiden is de sleutel tot het ontwikkelen van nieuwe muggenbestrijdingsstrategieën. Voor dergelijke doeleinden wordt genoombewerking bij muggen een gangbare praktijk, vooral met de ontwikkeling van technologieën zoals HEs, ZFN's, TALENs en meest recent CRISPR met Cas9. De vestiging van gen-bewerkte stammen omvat meestal het terugkruisen van individuen die de gewenste mutaties gedurende een paar generaties dragen om off-target en founder (bottleneck) effecten te minimaliseren, gevolgd door het kruisen van heterozygote individuen om homozygote of trans-heterozygote lijnen te genereren. Bij afwezigheid van een dominante marker is moleculaire genotypering noodzakelijk in dit proces omdat in veel gevallen geen duidelijke fenotypische eigenschappen kunnen worden gedetecteerd voor heterozygote mutanten.
Hoewel sequencing de gouden standaard is voor genotypische karakterisering, brengt het uitvoeren van dit over honderden of mogelijk duizenden individuen aanzienlijke kosten, arbeid en tijd met zich mee die nodig zijn om resultaten te verkrijgen, wat vooral van cruciaal belang is voor organismen met een korte levensduur zoals muggen. Veelgebruikte alternatieven zijn Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 en hoge resolutie smeltanalyse (HRMA, beoordeeld in 7). Zowel SNA als T7E1 gebruiken endonucleases die alleen niet-overeenkomende bases splitsen. Wanneer een gemuteerd gebied van het heterozygote mutante genoom wordt versterkt, worden DNA-fragmenten van mutante en wild-type allelen gegloeid om niet-overeenkomend dubbelstrengs DNA (dsDNA) te maken. SNA detecteert de aanwezigheid van mismatches via de spijsvertering met een mismatch-specifieke endonuclease en eenvoudige agarose gel elektroforese. Als alternatief gebruikt HRMA de thermodynamische eigenschappen van dsDNA gedetecteerd door dsDNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, waarbij de disassociatietemperatuur van de kleurstof varieert op basis van de aanwezigheid en het type mutatie. HRMA is onder andere gebruikt voor de detectie van single-nucleotide polymorfismen (SNP's)8, mutante genotypering van zebravissen9, microbiologische toepassingen10 en plantengenetisch onderzoek11.
Dit artikel beschrijft HRMA, een eenvoudige methode van moleculaire genotypering voor gemuteerde muggen gegenereerd door CRISPR / Cas9-technologie. De voordelen van HRMA ten opzichte van alternatieve technieken omvatten 1) flexibiliteit, omdat het nuttig is gebleken voor verschillende genen, een breed scala aan indelgroottes, evenals het onderscheid tussen verschillende indelgroottes en heterozygote, homozygote en trans-heterozygote differentiatie12,13,14, 2) kosten, omdat het is gebaseerd op veelgebruikte PCR-reagentia, en 3) tijdbesparend, omdat het in slechts een paar uur kan worden uitgevoerd. Bovendien gebruikt het protocol een klein lichaamsdeel (een poot) als bron van DNA, waardoor de mug het genotyperingsproces kan overleven, waardoor mutantenlijnen kunnen worden opgezet en onderhouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Scannen op single nucleotide polymorfismen (SNP's), HRMA primer ontwerp en primer validatie
- SNP-identificatie bij wilde laboratoriumkoloniemuggen
- Selecteer het doelexon om de juiste polypeptidevertaling te verstoren.
OPMERKING: Het doel moet dicht bij het startcodon liggen of tussen de belangrijkste residuen die nodig zijn voor de eiwitfunctie. Hoe korter het exon (bijvoorbeeld ≤200 basen), hoe moeilijker het is om te richten en te analyseren. Vermijd bewerken dicht bij de grenzen van een exon, omdat dit een van de HRMA-primers dwingt om een intron te passeren of in een intron te zitten. Dit is onwenselijk omdat de SNP-tarieven in die regio's meestal veel hoger zijn. - Primer ontwerp
- Ga naar de NCBI Blast - Primer Blast website15, kopieer en plak de gekozen exon in het vak bovenaan de pagina | kies de PCR-productgrootte (zorg ervoor dat deze het grootste deel van de exon omvat) | kies het organisme.
- Klik op Geavanceerde parameters | Kies (voor PCR Product Tm) en voeg 60 (voor een optimale temperatuur van 60 °C) toe | Koop Primers. Houd de andere parameters als standaard aan.
- Verkrijg genomisch DNA (gDNA) uit de wild-type laboratoriumkolonie. Zet 10 muggen opzij, verdoof ze met CO2 en leg ze in een petrischaaltje op ijs om ze inactief te houden. Stel 10 buisjes in met 0,5 μL van het reagens voor het vrijkomen van DNA uit weefsel en 20 μL verdunningsbuffer, beide voorzien in de DNA-afgiftekit die wordt voorgesteld in de materiaaltabel.
- Verwijder één poot van een enkele mug met een tang en plaats deze in een overeenkomstige buis van een verdunde oplossing van het DNA-afgiftereagens (vanaf stap 1.1.3), waarbij het been volledig in de oplossing wordt ondergedompeld. Herhaal deze stap met de resterende muggen en veeg de tang af met 70% ethanol voordat je doorgaat naar de volgende.
- Incubeer de beenbevattende oplossing bij kamertemperatuur gedurende 2-5 minuten, vervolgens bij 98 °C gedurende 2 minuten en laat deze afkoelen tijdens het instellen van de PCR-reactie.
OPMERKING: Platen met het vrijgekomen gDNA kunnen worden opgeslagen bij -20 °C en het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd. - Bereid 10 buisjes met 10 μL 2x PCR Master Mix, primers tot een eindconcentratie van 0,5 μM en water van moleculaire kwaliteit tot een eindvolume van 20 μL, en breng 1 μL van het verdunde monster over naar elke buis. Voer PCR uit volgens deze cyclusparameters: 98 °C 5 min, 40 cycli van 98 °C gedurende 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s per kb; eindverlenging van 72 °C gedurende 1 min.
- Zuiver de PCR-producten met een enzym om de resterende PCR-primers af te breken en overtollige dNTPs of een kolomreinigingskit te defosfororyleren. Ga verder met het sequencen van de monsters.
- Analyseer elk elektroferogram op de aanwezigheid van dubbele pieken /dubbelzinnige basen en pas basisaanroepen handmatig aan in elke reeks met behulp van de juiste gedegenereerde basiscode.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd voordat meerdere sequenties worden uitgelijnd, omdat het gebruikelijk is dat de basisaanroepsoftware de meer prominente piek selecteert als de "echte" basisaanroep, waardoor de valse indruk wordt gewekt van een afwezigheid van SNP's. - Voer een uitlijning van meerdere sequenties uit met behulp van de uitlijningssoftware SeqMan Pro, die wordt vermeld in de Materiaaltabel of andere open-source uitlijningssoftware, zoals ClustalW16 of T-Coffee17.
- Open de uitlijnsoftware | klik op Reeksen toevoegen | selecteer de gewenste sequenties en klik op Toevoegen | zodra alle sequenties zijn gekozen, klikt u op Gereed.
- Klik op Monteren om de uitlijning uit te voeren. Om de uitlijning te openen, klikt u op Contig 1 en analyseert u de uitlijning en identificeert u de SNP's (figuur 1).
OPMERKING: Als alternatief voor stap 1.1.3-1.1.6 kan PCR worden uitgevoerd op basis van geïsoleerd genomisch DNA dat is verkregen uit bulkmonsters (afgeleid van >10 personen). Gesequentieerde ampliconen kunnen direct worden geanalyseerd op de aanwezigheid van SNP's die verschijnen als dubbele pieken in het elektroferogram, hoewel zeldzame SNP's moeilijker te detecteren zullen zijn.
- Ontwerp 3-5 single guide RNA's (sgRNA's), waarbij regio's met een SNP die hierboven zijn geïdentificeerd, worden vermeden, volgens het protocol beschreven in18.
- Selecteer het doelexon om de juiste polypeptidevertaling te verstoren.
- HRMA primer ontwerp
- Test de exonsequentie op de mogelijke vorming van secundaire structuren tijdens PCR met behulp van mFold19.
- Ga naar de UNAFold Web Server | klik op mFold | klik in het vervolgkeuzemenu op Toepassingen | DNA-vouwvorm.
- Voer de naam van de reeks in het vak in en plak de exon.
- Verander de vouwtemperatuur naar 60 °C; op de Ionische omstandigheden, verander [Mg++] in 1,5 en op Eenheden overschakelen naar mM; klik op Fold DNA.
- Klik op Output, onder Structuur 1, op pdf om de Circular Structure Plots te openen.
- Ga naar NCBI Blast - Primer Blast15 voor primerontwerp.
- Kopieer en plak de geselecteerde exonvolgorde die is bepaald door sequencing in stap 1.1 (de reeks met het laagste aantal SNP's of geen SNP's) in het vak boven aan de pagina.
- Gebruik het symbool < > om reeksen te markeren en uit te sluiten die SNP's, de doellocatie en regio's bevatten met mogelijke vorming van secundaire structuur.
- Selecteer de PCR-productgrootte tussen 80 en 150 bp en kies het organisme.
OPMERKING: Grotere fragmentgroottes kunnen met succes worden gebruikt (~ 300 bp). Langere ampliconen kunnen echter de gevoeligheid verminderen tussen sequenties die verschillen in één of slechts enkele basenparen. - Klik op Get Primers. Selecteer 2-3 paar primers die moeten worden getest (idealiter zijn primerlocaties ≥20-50 bp verwijderd van CRISPR-doellocaties).
- Test de exonsequentie op de mogelijke vorming van secundaire structuren tijdens PCR met behulp van mFold19.
- Primer validatie
- Voer een gradiënt-PCR uit met gDNA van één persoon.
- Bereid een hoofdmix voor en verwijder één monster voor het niet-sjabloonbesturingselement (NTC) in een aparte buis. Voeg de sjabloon toe aan de resterende mastermix en aliquot in een 96-well plaat.
- Volg de fietsparameters: 98 °C 30 s, 34 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; eindverlenging van 72 °C gedurende 10 min.
- Genereer thermische smeltprofielen volgens de parameters: denaturatiestap 95 °C gedurende 1 minuut, gloeien bij 60 °C gedurende 1 minuut, smeltcurvedetectie tussen 75 °C en 95 °C in stappen van 0,2 °C, met een houdtijd van 10 s bij elke temperatuur.
OPMERKING: Alleen gloeitemperaturen met een enkel thermisch smeltprofiel mogen worden gebruikt.
- Voer een gradiënt-PCR uit met gDNA van één persoon.
- Ga verder met het genereren van de mutantenlijnen met embryo-injecties zoals beschreven in12.
2. Bereiding van genomisch DNA van muggenpoten
- Scheid de G1-muggen op geslacht in het popstadium, zodat ze niet paren voordat ze worden gegenotypeerd, en zorg ervoor dat leeftijdsgematchte, wild-type controlemuggen beschikbaar zijn om te worden gebruikt voor referenties en backcrosses. Seks-scheid ze ook.
- Verzamel de benodigde materialen (figuur 2A) en bereid een 96 well PCR-plaat met 0,5 μL van het DNA-afgiftereagens en 20 μL verdunningsbuffer (uit de gDNA-afgiftekit) per persoon om te worden gegenotypeerd (figuur 2B) en laat het op ijs liggen. Reserveer twee reacties voor NTC.
- Label een tray voor muggenflacons (Drosophila-injectieflacons ) zodat elk putje op de 96-plaat overeenkomt met de respectieve muggenflacon in de tray.
- Verdoof de G1-muggen met CO2 en plaats ze in een glazen petrischaal om ze verdoofd te houden (figuur 2C, D). Verdoof en plaats 8 wilde muggen in een tweede petrischaaltje.
- Veeg een pincet af met 70% ethanol en verwijder een van de achterpoten van de mug (figuur 2E,F).
- Dompel het been onder in de DNA-afgifte-reagensoplossing, plaats de mug in de bijbehorende injectieflacon en sluit deze met een spons (figuur 2G, H).
- Veeg het pincet opnieuw af met 70% ethanol en ga verder met het verwijderen van het been van de volgende mug. Herhaal stap 2.5-2.7 totdat de 96-putplaat is voltooid.
OPMERKING: Het is belangrijk om het pincet af te vegen met 70% ethanol. Dit minimaliseert DNA-kruisbesmetting. - Sluit de plaat af met een optische PCR-plaatafdichting (figuur 2I) en incubeer de 96-putplaat met de poten bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2-5 minuten en vervolgens bij 98 °C gedurende 2 minuten. Laat de plaat afkoelen tot RT tijdens het bereiden van de PCR-mix.
OPMERKING: Het hele proces duurt meestal 3-4 uur. Als de muggen langer dan de verwachte duur (vooral ≥1 dag) in de injectieflacons moeten worden gehouden, plaats dan een klein stukje rozijn (of bron van suiker en water) bij elke mug om de overleving van de muggen tijdens langdurige incubaties te garanderen.
3. Hrma
- Voer PCR uit.
- Bereid een mastermix voor met de volgende componenten per reactie: 10 μL 2x buffer (uit de gDNA-afgiftekit), 0,5 μM van elke primer, 1 μL EvaGreen-kleurstof, 0,4 μL polymerase (uit gDNA-afgiftekit) en compleet tot 19 μL met water van moleculaire kwaliteit.
- Breng met behulp van een meerkanaals pipet 19 μL van het mastermengsel over in elke put. Breng 1 μL van de DNA-afgifteoplossing met muggen-DNA bereid in sectie 2 over op de plaat (figuur 3A). Sluit de plaat af met een optische PCR-plaatafdichting.
- Voer de PCR uit volgens de cyclusparameters: 98 °C gedurende 5 minuten, 39 cycli van 98 °C gedurende 10 s, de gekozen gloeitemperatuur (72 °C) gedurende 30 s; eindverlenging 72 °C gedurende 2 min.
- Genereer thermische smeltprofielen volgens de parameters: denaturatiestap 95 °C gedurende 1 minuut, gloeien bij 60 °C gedurende 1 minuut, smeltcurvedetectie tussen 75 °C en 95 °C in stappen van 0,2 °C, met een houdtijd van 10 s bij elke temperatuur. Zie de aanvullende materiaal- en aanvullende figuur S1-S5 voor een gedetailleerde beschrijving van de software-instellingen voor HRMA-uitvoering met behulp van het CFX96 Real-Time System.
- Onderzoek de smeltprofielen (figuur 3B). Wijs wild-type besturingselement toe aan het referentiecluster.
OPMERKING: De software (zie de tabel met materialen) normaliseert automatisch de gegevens en wijst clusters aan met kleuren voor verschillende smeltcurven. - Markeer de verschillende clusters met overeenkomstige kleuren op de sjabloon met 96 bronnen (afbeelding 3C).
- Selecteer de personen met interessante curven, verwijder ze uit de buizen en ga terug (figuur 3D). Voer de gepaarde vrouwtjes met bloed en verzamel G2-eieren .
4. Sequentieverificatie door Sanger-sequencing
- Zuiver het PCR-product uit de putten met geselecteerde muggen (van de plaat bereid in sectie 3.1), gebruik een enzym om de resterende PCR-primers af te breken en defosfororylaat overtollige dNTPs. U kunt ook een kolomopruimingskit gebruiken en doorgaan met het sequentiëren van de monsters.
OPMERKING: Directe sequencing kan een grotere uitdaging zijn wanneer de PCR-productgrootte klein is (≤200 bp). Ontwerp in dergelijke gevallen primers om grotere fragmenten die de doellocatie omvatten te versterken (≥250 bp) en te versterken door PCR met behulp van het DNA in de 96-well plaat (stap 2.2). - Analyseer en identificeer de indels met behulp van trace viewer software (Figuur 4). Als alternatief kan Poly Peak Parser software20 helpen bij het detecteren van de mutatie bij heterozygote individuen.
- Ga naar de Poly Peak Parser-website, selecteer de volgorde van de mutanten in het menu Bladeren en kopieer en plak de referentiereeks in het vak.
OPMERKING: De uitlijning tussen het alternatieve allel en de referentie verschijnt automatisch aan de rechterkant van het scherm.
- Ga naar de Poly Peak Parser-website, selecteer de volgorde van de mutanten in het menu Bladeren en kopieer en plak de referentiereeks in het vak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muggen met mutaties in de genen AaeZIP11 (putative iron transporter21) en myo-fem (een female-biased myosine-gen gerelateerd aan vluchtspieren13) werden verkregen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie, gegenotypeerd met BEHULP VAN HRMA en sequentie-geverifieerd (figuur 5). Figuur 5A en figuur 5C tonen de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van de HRM-curven van respectievelijk AaeZIP11 en myo-fem mutantmonsters, samen met wild-type controles. Figuur 4B en figuur 4D tonen de vergroting van de verschilcurven (van respectievelijk de AaeZIP11 - en myo-fem mutantmonsters ) tussen de smeltprofielen van de verschillende clusters die door de software zijn toegewezen na aftrek van elke curve van de wild-type referentie. Heterozygote en homozygote mutant AaeZIP11-individuen werden in verschillende clusters geplaatst en zijn gemakkelijk te onderscheiden van de wildtype controles (figuur 5B). Heterozygote mutante myo-fem individuen onderscheiden zich ook van de controles (figuur 5D). Merk op dat er in beide gevallen twee clusters binnen de wildtypecontroles aanwezig waren, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van de aanwezigheid van SNP's in het doelgebied (figuur 5), wat de noodzaak benadrukt om meerdere controlemonsters te gebruiken om te voorkomen dat controles als mutanten worden gecategoriseerd wanneer SNP's niet kunnen worden vermeden.
Figuur 4A toont de sequentieanalyse van de AaeZIP11 mutant. Het elektroferogram van AaeZIP11 heterozygote mutanten geeft de nucleotidepositie aan waar de indel optrad. Dit wordt weergegeven door een verschuiving van enkele naar dubbele pieken, aangezien polymorfe posities beide nucleotiden gelijktijdig zullen laten zien (figuur 4A). Het aantal verwijderde of ingevoegde basenparen werd berekend door de enkele pieken aan het einde van de run te tellen (figuur 4B), aangezien een van de DNA-strengen korter of langer zal zijn dan de andere door het aantal respectievelijk verwijderde of ingevoegde basenparen. Het wordt aanbevolen om sequentie-geverifieerd gDNA van de mutanten te gebruiken als referentie voor de identificatie van de heterozygoten om te helpen bij HRMA-analyses voor volgende generaties. Handmatige toewijzing voor de curven kan nodig zijn wanneer vergelijkbare curven automatisch worden toegewezen aan verschillende clusters. Dit kan worden gedaan door de temperatuurverschoven curven en verschilcurven te vergelijken. Handmatige aanpassing van de software kan nodig zijn om monsters correct toe te wijzen aan clusters. HRMA-resultaten van AaeZIP11 en een mutant genaamd Aeflightin tonen aan dat individuele monsteranalyses nodig waren om heterozygoten, homozygoten en trans-heterozygoten met succes te categoriseren. Aanvankelijk kon de automatische clustertoewijzing van de software geen goed onderscheid maken tussen de groepen (figuur 6A, figuur 6C, figuur 6E en figuur 6G). Elk monster werd vervolgens individueel geanalyseerd en toegewezen aan de juiste groepen op basis van gelijkenis met referentiemonsters van heterozygoten, homozygoten en trans-heterozygoten (eerder geverifieerd door sequencing) (figuur 6B, figuur 6D, figuur 6F en figuur 6H).
Figuur 1: SNP-identificatie. Schematische weergave van meervoudige sequentie-uitlijning van AaeZIP11-fragment uit wild-type. In rood staan de SNP's en in groen zijn de fragmenten vrij van SNP's; dit SNP-vrije gebied wordt voorgesteld voor sgRNA- en primerontwerp. Afkortingen: SNP = single nucleotide polymorphism; sgRNA = single guide RNA; LVP = Liverpool stam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele procedure voor het verkrijgen van genomisch DNA uit muggenpoten voor HRMA. (A) Materialen voor het verkrijgen van genomisch DNA, waaronder pipetten, tips, PCR-plaat, optische afdichting, reservoir, de verdunningsbuffer en DNA-afgifteoplossing. B) PCR-plaatpreparaat dat DNA-afgiftereagens en verdunningsbuffer bevat. (C) Muggenanesthesie met CO2. D) Het pincet afvegen met 70% ethanol om verontreiniging tussen de monsters te voorkomen. (E) Experimentele opstelling inclusief pincet, rek voor muggenflacons, petrischaal bovenop een ijscontainer met verdoofde muggen en de eerder bereide PCR-plaat. (F) Verwijdering van de muggenpoot. (G) Zoomweergave van de muggenpoot die wordt ondergedompeld in de DNA-afgiftereagensoplossing. (H) Enkele mug in de injectieflacon geplaatst. (I) Afdichting van de PCR-plaat met de muggenpoten. Afkorting: HRMA = hoge resolutie smeltanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Experimentele procedure voor HRM-analyses. (A) Het vrijgekomen gDNA overbrengen naar een 96-wells plaat met het PCR-mengsel. (B) Visuele inspectie van de verschilcurven. (C) Markeer elk monster op de 96-well-sjabloon met dezelfde kleur als de respectieve verschilcurvekleur. (D) Het terugkruisen van de individuen uit hetzelfde cluster. Afkortingen: HRM = hoge resolutie smelt; gDNA = genomisch DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Sequentieanalyse van een AaeZIP11 mutant. (A) Nucleotide-uitlijning van de AaeZIP11Δ56-mutant. Geel gemarkeerde streepjes zijn de verwijderde bases. In het vak gaat het elektroferogram over van enkele pieken naar dubbele pieken, waarbij de positie wordt weergegeven waar de deletie plaatsvond (pijl). (B) Elektroferogram van het einde van de sequencingloop en de overgang van dubbele pieken naar enkele pieken. Merk op dat het aantal enkele pieken het aantal verwijderde basen vertegenwoordigt (grijze rechthoek). Primersequenties zijn opgenomen in de aanvullende tabel S1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: HRMA van DNA geëxtraheerd uit muggenpoten. DNA werd geëxtraheerd uit een enkel been van AaeZIP11 (A en B) en myo-fem (C en D) knock-out Ae. aegypti muggen en geanalyseerd door HRMA. A en C geven de genormaliseerde fluorescentiesignalen van de monsters aan tot relatieve waarden van 1,0 tot 0. B en D geven de vergroting van de krommeverschillen aan door elke curve af te trekken van de wild-type referentie (Liverpool-stam). Afkortingen: HRMA = hoge resolutie smeltanalyse; LVP = Liverpool stam; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Primersequenties zijn opgenomen in de aanvullende tabel S1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van handmatige groepsopdrachten. (A-D) HRMA voor Aeflightin-mutanten. (A en C) Smeltcurven (respectievelijk genormaliseerde lineaire schaalcurven en verschilcurven) worden automatisch gegroepeerd door de Precision Melt Analysis Software. (B) Normalisatie van differentiële krommen die handmatig worden gewijzigd. (D) Na de normalisatie van de differentiële curven te hebben gewijzigd, werd elk monster afzonderlijk toegewezen door de piektemperaturen in de verschilcurven voor overeenkomstige positieve controles (eerder gesequencede monsters geïdentificeerd door Δ4- en Δ5-heterozygoten en Δ4Δ5 trans-heterozygoten), waardoor de 3 groepen duidelijk konden worden geïdentificeerd. Rode en bruine pijlen worden toegevoegd om de pieken bij verschillende temperaturen te markeren. (E-H) HRMA voor AaeZIP11 mutanten. (E en G) Smeltcurven worden automatisch toegewezen door de software. (F en H) Mutanten in het tweede heterozygote zelfkruis werden op de juiste manier toegewezen aan de juiste groepen door de gelijkenis van de genormaliseerde en verschilcurven met eerder bepaalde referenties (kleurgecodeerd in krommen). Heterozygoten asg, Homozygotes asg en Trans-heterozygotes asg: toegewezen smeltcurven door Precision Melt Analysis Software. Afkortingen: HRMA = hoge resolutie smeltanalyse; LVP = Liverpool stam; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Primersequenties zijn opgenomen in aanvullende tabel S1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend materiaal: Gedetailleerd protocol voor het instellen van HRMA in het CFX96 Real-Time System (bijv. Bio-rad). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Stapsgewijze instructies voor het instellen van het fietsprotocol op Bio-rad CFX Manager. Zie aanvullend materiaal 2.1-2.3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Stapsgewijze instructies voor een plaatopstelling op Bio-rad CFX Manager. Zie aanvullend materiaal 3.1-3.4. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Stapsgewijze instructies voor een plaatopstelling op Bio-rad CFX Manager. Zie aanvullend materiaal 3.5-3.6. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Stapsgewijze instructies voor de installatie uitvoeren op Bio-rad CFX Manager. Zie aanvullend materiaal 4.1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S5: Stapsgewijze instructies voor HRMA-analyse op Bio-rad CFX Manager. Zie aanvullend materiaal 5.1-5.3. Afkorting: HRMA = hoge resolutie smeltanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Lijst van primers. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Smeltanalyse met hoge resolutie biedt een eenvoudige en snelle oplossing voor de identificatie van dedels die worden gegenereerd door CRISPR/Cas9-technologie in de vectormug Ae. aegypti. Het biedt flexibiliteit, waardoor de genotypering van muggen gemuteerd voor een breed scala aan genen mogelijk is, van vliegspier tot ijzermetabolisme en meer13,14. HRMA kan in slechts enkele uren worden uitgevoerd, van monsterverzameling tot de eindanalyses. Extra tijd is nodig voor primerontwerp en hangt ook af van de tijd om de benodigde sequencingresultaten (voor identificatie van de SNP's), sequentieanalyses en primerordening te ontvangen.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de stapsgewijze methoden voor succesvolle analyses. Een van de meest kritische stappen in dit proces is het juiste ontwerp van de primers. HRMA is gevoelig genoeg dat de aanwezigheid van zelfs een enkele SNP in het versterkte fragment kan resulteren in een sterke verschilcurve die verkeerd kan worden geïnterpreteerd als een mutatie. Sequencing laboratoriumkoloniemonsters voorafgaand aan CRISPR-mutagenese maakt het mogelijk om SNP-rijke regio's te detecteren en te vermijden bij het ontwerpen van het doelwit; de HRMA primers helpen dit probleem te voorkomen. Het ontwerpen van primers voor kleine ampliconen (70-100 bp) kan ook de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van het experiment verbeteren, omdat grotere fragmenten verschillende smeltdomeinen kunnen presenteren, waardoor de kans om varianten te onderscheiden afneemt22. Een beperking van de techniek is dat het volledig vermijden van SNP's mogelijk niet haalbaar is, afhankelijk van het gen; sequencing en verder gebruik van meerdere wildtype controlepersonen kunnen de analyses dus helpen.
Specifiek voor dit protocol is het belangrijk om gegenotypeerde muggen in leven te houden, zodat ze kunnen worden teruggekruist voor het opzetten van mutantenlijnen. Het verwijderen van een van de muggenpoten om gDNA te extraheren kan de minst invasieve manier zijn om dat te bereiken; de hoeveelheid gDNA die uit dit weefsel wordt teruggewonnen, is echter minimaal. De kit die in de Tabel van Materialen werd voorgesteld, was voldoende voor het verkrijgen van DNA van een muggenpoot en het uitvoeren van de PCR om HRMA te voltooien.
HRMA kan meer flexibiliteit bieden in termen van detectie van een breed scala aan indelgroottes, variërend van single-base mismatches tot meerdere baseparen (AaeZIP11 had een deletie van 56 bp) en het overtreffen van methoden zoals de SNA of T7E1 (beide enzyme mismatch cleavage assays) die beperkt zijn tot single-base mismatch of kleine deleties (~ 20 bp)5, 23. Bovendien detecteert SNA geen homozygote mutanten omdat de PCR-producten geen mismatches bevatten. Bovendien kunnen SNA-resultaten ook worden gemaskeerd door natuurlijk voorkomende allelische polymorfismen wanneer de met nuclease behandelde PCR-producten een vergelijkbare lengte hebben als de gemuteerde allelen. Geen van deze beperkingen is van toepassing op HRMA. Uiteindelijk is sequencing nodig om de gemuteerde DNA-sequentie te identificeren. Zodra een mutatie in kwestie bekend is, is HRMA die wordt gebruikt voor de identificatie van mutante individuen echter veel sneller dan directe sequencing. Deze methode behoudt waardevolle monsters (meer muggen zullen overleven, hoe minder ze hoeven te wachten op hun genotyperesultaten) en vermindert de noodzaak voor sequencing van grote aantallen monsters, waardoor de totale kosten van het experiment worden verlaagd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Alle figuren zijn gemaakt met Biorender.com onder een licentie aan de Texas A & M University. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 en AI115138 tot Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research onder het Insect Vectored Disease Grant Program en het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-project 1018401.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
- WHO.
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
