Summary
Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Transkripsiyon-aktivatör benzeri efektör nükleazları (TALENler), çinko parmak nükleazları (ZFN'ler) ve homing endonucleases (HEs) gibi sistemlerin kurulmasıyla sivrisinek gen düzenlemesi çeşitli laboratuvarlarda rutin hale gelmiştir. Daha yakın zamanda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) teknolojisi hassas genom mühendisliği için daha kolay ve ucuz bir alternatif sunmuştır. Nükleaz eylemini takiben, DNA onarım yolları kırık DNA uçlarını düzeltecek ve genellikle indelleri tanıtacaktır. Bu çerçeve dışı mutasyonlar daha sonra hedef organizmalardaki gen fonksiyonunu anlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bir dezavantajı, mutant bireylerin baskın bir işaret taşıması, mutant alellerinin tanımlanması ve izlenmesini, özellikle birçok deney için gerekli ölçeklerde zor hale getirmeleridir.
Yüksek çözünürlüklü eriyik analizi (HRMA), nükleik asit dizilerindeki varyasyonları tanımlamak için basit bir yöntemdir ve bu varyasyonları tespit etmek için PCR erime eğrilerini kullanır. Bu PCR sonrası analiz yöntemi, sıcaklık rampası kontrol veri yakalama özelliğine sahip ve kolayca 96 kuyu plaka formatlarına ölçeklendirilen enstrümantasyonlu floresan çift iplikli DNA bağlayıcı boyalar kullanır. Burada, CRISPR/ Cas9 kaynaklı indellerin hızlı tespiti ve sivrisinek Ae. aegypti'de mutant hatlarının kurulması için HRMA kullanan basit bir iş akışı açıklanmıştır. Kritik olarak, tüm adımlar az miktarda bacak dokusu ile yapılabilir ve organizmadan ödün vermeyi gerektirmez, genotiplemeden sonra genetik haçların veya fenotipleme testlerinin yapılmasına izin verir.
Introduction
Dang1, Zika2 ve chikungunya3 virüsleri gibi patojenlerin vektörleri ve sıtma parazitleri4 olarak, sivrisinekler insanlar için önemli bir halk sağlığı tehdidini temsil eder. Tüm bu hastalıklar için, sivrisinek vektörlerinin kontrolüne önemli bir bulaşma müdahalesi odağı vardır. Örneğin, patojenlere izin verme, sivrisinek zindeliği, hayatta kalma, üreme ve insektisitlere karşı dirençte önemli genlerin incelenmesi, yeni sivrisinek kontrol stratejileri geliştirmek için anahtardır. Bu amaçlar için, sivrisineklerde genom düzenleme, özellikle HE'ler, ZFN'ler, TALEN'ler ve en son CAS9 ile CRISPR gibi teknolojilerin geliştirilmesiyle yaygın bir uygulama haline gelmektedir. Gen düzenlemeli suşların kurulması tipik olarak hedef dışı ve kurucu (darboğaz) etkileri en aza indirmek için birkaç nesil boyunca istenen mutasyonları taşıyan bireylerin geriye doğru geriye doğru dönmesini ve ardından homoziöz veya trans-heterozipöz çizgiler oluşturmak için heterozipöz bireyleri geçmeyi içerir. Baskın bir belirtecin yokluğunda, moleküler genotipleme bu süreçte gereklidir, çünkü çoğu durumda heterozipöz mutantlar için net fenotipik özellikler tespit edilemez.
Sıralama genotipik karakterizasyon için altın standart olmasına rağmen, bunu yüzlerce veya muhtemelen binlerce bireyde gerçekleştirmek, özellikle sivrisinekler gibi kısa ömürlü organizmalar için kritik olan sonuç elde etmek için gereken önemli maliyetler, emek ve zaman oluşturur. Surveyor nükleaz tahlil5 (SNA), T7E1 tahlil6 ve yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA, in7) yaygın olarak kullanılan alternatiflerdir. Hem SNA hem de T7E1, yalnızca eşleşmeyen tabanları ayıran endonucleases kullanır. Heterozygous mutant genomunun mutasyona uğramış bir bölgesi yükseltildiğinde, mutant ve vahşi tip alellerden dna parçaları, eşleşmeyen çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için tavlanır. SNA, uyumsuzlığa özgü bir endonokleaz ve basit agarose jel elektroforezi ile sindirim yoluyla uyuşmazlıkların varlığını tespit eder. Alternatif olarak, HRMA, dsDNA bağlayıcı floresan boyalar tarafından tespit edilen dsDNA'nın termodinamik özelliklerini kullanır ve boyanın ilişkiden çıkarma sıcaklığı mutasyonun varlığına ve türüne bağlı olarak değişir. HRMA, tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP'ler)8, zebra balıklarının mutant genotiplemesinin, mikrobiyolojik uygulamaların10 ve bitki genetik araştırmalarının tespiti için kullanılmıştır11.
Bu makalede, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen mutant sivrisinekler için basit bir moleküler genotipleme yöntemi olan HRMA açıklanmaktadır. HRMA'nın alternatif tekniklere göre avantajları arasında 1) esneklik, çeşitli genler, çok çeşitli indel boyutlarının yanı sıra farklı indel boyutları ile heterozipöz, homozigot ve trans-heterozygöz farklılaşma arasındaki ayrım için yararlı olduğu kanıtlanmıştır12,13,14, 2) maliyet, yaygın olarak kullanılan PCR reaktiflerine dayandığı için ve 3) zaman kazandıran, sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebileceği için. Ek olarak, protokol DNA kaynağı olarak küçük bir vücut parçası (bacak) kullanır, sivrisineklerin genotipleme işleminden kurtulmasını sağlar, mutant hatlarının kurulmasına ve bakımına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), HRMA astar tasarımı ve astar doğrulaması için tarama
- Vahşi tip laboratuvar koloni sivrisineklerinde SNP tanımlaması
- Uygun polipeptid çevirisini bozmak için hedef eksonunu seçin.
NOT: Hedef başlangıç kodonuna yakın veya protein fonksiyonu için gerekli anahtar kalıntılar arasında olmalıdır. Ekson ne kadar kısa olursa (örneğin, ≤200 baz), hedeflemek ve analiz etmek o kadar zordur. Bir eksonun sınırlarına yakın düzenleme yapmaktan kaçının, çünkü bu, HRMA astarlarından birini bir intron'dan geçmeye veya bir intronda olmaya zorlar. Bu istenmeyen bir durumdur, çünkü SNP oranları bu bölgelerde çok daha büyük olma eğilimindedir. - Astar tasarımı
- NCBI Blast - Primer Blast web sitesine gidin15, seçilen ekson kopyalayıp sayfanın üst kısmındaki kutuya yapıştırın | PCR ürün boyutunu seçin (dış denetimin çoğunu kapsadığından emin olun) | organizmayı seçin.
- Gelişmiş parametreler | tıklayın Tercih edin (PCR Ürün Tm için) ve 60 ekleyin (60 °C optimum sıcaklık için) | Primers'ı getir. Diğer parametreleri varsayılan olarak saklayın.
- Vahşi tip laboratuvar kolonisinden genomik DNA (gDNA) elde edin. 10 sivrisinek ayır, CO2 ile uyuşturun ve hareketsiz tutmak için buz üzerinde bir Petri kabına yerleştirin. Dokudan DNA salınımı için reaktifin 0,5 μL'si ve 20 μL seyreltme tamponu içeren 10 tüp kurun, her ikisi de Malzeme Tablosunda önerilen DNA serbest bırakma kitinde sağlanmıştır.
- Forseps kullanarak tek bir sivrisinekten bir bacağı çıkarın ve DNA salınımlı reaktifin seyreltilmiş bir çözeltisinin ilgili tüpüne yerleştirin (adım 1.1.3'ten itibaren), bacağı çözeltiye tamamen batırın. Bu adımı kalan sivrisineklerle tekrarlayın, bir sonrakine geçmeden öncepsleri% 70 etanol ile silin.
- Bacak içeren çözeltiyi oda sıcaklığında 2-5 dakika, daha sonra 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya bırakın ve PCR reaksiyonlarını ayarlarken soğumasını bekleyin.
NOT: Serbest bırakılan gDNA'yı içeren plakalar -20 °C'de saklanabilir ve protokol bu noktada duraklatılabilir. - 10 μL 2x PCR Master Mix içeren 10 tüp, 0,5 μM son konsantrasyona astarlar ve 20 μL'lik son hacme moleküler dereceli su hazırlayın ve seyreltilmiş numunenin 1 μL'sini her tüpe aktarın. Bu döngü parametrelerini izleyerek PCR gerçekleştirin: 98 °C 5 dk, 5 s için 98 °C 40 döngü, 60 °C 30 s, kb başına 72 °C 20 s; 1 dakika boyunca 72 °C'nin son uzantısı.
- Artık PCR astarlarını bozmak ve fazla dNTP'leri veya herhangi bir kolon temizleme kitini defosforilasyona düşürmek için PCR ürünlerini bir enzimle arındırın. Örnekleri sıralamaya devam edin.
- Çift tepe/belirsiz bazların varlığı için her elektroferogramı analiz edin ve uygun dejenere baz kodunu kullanarak her sırada temel çağrıları manuel olarak ayarlayın.
NOT: Bu adım, temel çağıran yazılımın SNP'lerin yokluğunun yanlış izlenimini veren "gerçek" temel çağrı olarak daha belirgin tepeyi seçmesi yaygın olduğundan, birden çok sıra hizalamadan önce gerçekleştirilmelidir. - Malzeme Tablosunda listelenen SeqMan Pro hizalama yazılımını veya ClustalW16 veya T-Coffee17 gibi diğer açık kaynaklı hizalama yazılımlarını kullanarak birden çok sıra hizalama gerçekleştirin.
- Hizalama yazılımı | Sıra Ekle | tıklayın istediğiniz sıraları seçin ve Ekle'ye tıklayın| tüm diziler seçildikten sonra Bitti'ye tıklayın.
- Hizalamayı gerçekleştirmek için Birleştir'i tıklatın. Hizalamayı açmak için Contig 1'e tıklayın ve hizalamayı analiz edin ve SNP'leri tanımlayın (Şekil 1).
NOT: 1.1.3-1.1.6 adımlarına alternatif olarak, PCR toplu örneklerden elde edilen izole genomik DNA'dan yapılabilir (>10 kişiden türetilir). Sıralı ampliconlar doğrudan elektroferogramda çift tepe noktası olarak görünen SNP'lerin varlığı için analiz edilebilir, ancak nadir SNP'lerin tespit edilmesi daha zor olacaktır.
- Yukarıda tanımlanan herhangi bir SNP içeren bölgeleri, 18'de açıklanan protokolü izleyerek önleyen 3-5 tek kılavuz RNA'sı (sgRNA) tasarlayın.
- Uygun polipeptid çevirisini bozmak için hedef eksonunu seçin.
- HRMA astar tasarımı
- mFold19 kullanarak PCR sırasında ikincil yapıların olası oluşumu için ekson sırasını test edin.
- UNAFold Web Sunucusu | gitme mFold | tıklayın açılır menüsünde Uygulamalar | DNA Katlama Formu.
- Sıra adını kutuya girin ve dış işlemi yapıştırın.
- Katlama sıcaklığını 60 °C'ye değiştirin; Ionic koşullarında[ Mg++] öğesini 1,5 olarak değiştirin ve Birimler mM'ye geçin; Fold DNA'ya tıklayın.
- Çıktı'da, Yapı 1'in altında, Dairesel Yapı Çizimlerini açmak için pdf'ye tıklayın.
- Astar tasarımı için NCBI Blast - Primer Blast15'e gidin.
- Sayfanın üst kısmındaki kutuya, 1.1 adımında (en düşük sayıda SNP içeren veya SNP içermeyen sıra) sıralanarak belirlenen seçili ekson sırasını kopyalayıp yapıştırın.
- SNP'leri, hedef siteyi ve olası ikincil yapı oluşumuna sahip bölgeleri içeren dizileri işaretlemek ve dışlamak için sembol < > kullanın.
- PCR ürün boyutunu 80 ila 150 bp arasında olacak şekilde seçin ve organizmayı seçin.
NOT: Daha büyük parça boyutları başarıyla kullanılabilir (~300 bp). Ancak, daha uzun ampliconlar bir veya sadece birkaç baz çiftte farklı diziler arasındaki duyarlılığı azaltabilir. - Primer Al'a tıklayın. Test edilecek 2-3 astar çifti seçin (ideal olarak, astar siteleri ≥20-50 bp uzaklıktadır.
- mFold19 kullanarak PCR sırasında ikincil yapıların olası oluşumu için ekson sırasını test edin.
- Astar doğrulaması
- Tek bir kişiden gDNA kullanarak degrade PCR gerçekleştirin.
- Ana karışım hazırlayın ve şablon olmayan denetim (NTC) için ayrı bir tüpte bir örneği çıkarın. Şablonu kalan ana karışıma ekleyin ve 96 kuyulu bir tabağa aliquot ekleyin.
- Bisiklet parametrelerini izleyin: 98 °C 30 s, 10 s için 98 °C 34 döngü, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; 10 dakika boyunca 72 °C'lik son uzatma.
- Parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturun: 1 dakika boyunca denatürasyon adımı 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C tavlama, 0,2 °C artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi algılama, her sıcaklıkta 10 s tutma süresi.
NOT: Sadece tek bir termal eriyik profiline sahip tavlama sıcaklıkları kullanılmalıdır.
- Tek bir kişiden gDNA kullanarak degrade PCR gerçekleştirin.
- 12'de açıklandığı gibi embriyo enjeksiyonları ile mutant çizgilerini üretmeye devam edin.
2. Sivrisinek bacaklarından genomik DNA hazırlanması
- G1 sivrisineklerini pupal aşamasında cinsiyete göre ayırın, böylece genotiplemeden önce çiftleşmezler ve yaşla eşleşen, vahşi tip kontrol sivrisineklerinin referanslar ve geri dönüşler için kullanılacağından emin olun. Aynı şekilde seks ayır.
- Gerekli malzemeleri toplayın (Şekil 2A) ve genotipli olmak için kişi başına 0,5 μL DNA salınım reaktifi ve 20 μL seyreltme tamponu (gDNA serbest bırakma kitinden) ile 96 kuyu PCR plakası hazırlayın ve buz üzerinde bırakın. NTC için iki reaksiyon ayır.
- Sivrisinek şişeleri (Drosophila şişeleri) için bir tepsi etiketleyin, böylece 96 plakadaki her kuyu tepsideki ilgili sivrisinek şişesine karşılık gelir.
- G1 sivrisineklerini CO2 ile uyuşturun ve yatıştırıcı tutmak için cam bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 2C, D). Anestezi edin ve 8 yabani tip sivrisinekleri ikinci bir Petri kabına yerleştirin.
- Bir çift cımbızı% 70 etanol ile silin ve sivrisinek arka ayaklarından birini çıkarın (Şekil 2E, F).
- Bacağı DNA salınımlı reaktif çözeltisine batırın, sivrisinekleri ilgili şişeye yerleştirin ve bir süngerle kapatın (Şekil 2G, H).
- Cımbızı tekrar% 70 etanol ile silin ve bacağı bir sonraki sivrisinekten çıkarmaya devam edin. 96 kuyu plakası tamamlanana kadar 2,5-2,7 arası adımları yineleyin.
NOT: Cımbızı% 70 etanol ile silmek önemlidir. Bu, DNA çapraz kontaminasyonlarını en aza indirir. - Plakayı optik pcr plaka contası (Şekil 2I) ile kapatın ve bacakları oda sıcaklığında (RT) içeren 96 kuyu plakasını 2-5 dakika ve ardından 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın. PCR karışımını hazırlarken plakanın RT'ye soğumasını bekleyin.
NOT: Tüm işlem genellikle 3-4 saat sürer. Sivrisineklerin beklenen süreden (özellikle ≥1 gün) daha fazla süre şişelerde tutulması gerekiyorsa, uzun kuluçkalar sırasında sivrisineklerin hayatta kalmasını sağlamak için her sivrisinekle küçük bir parça kuru üzüm (veya şeker ve su kaynağı) yerleştirin.
3. HRMA
- PCR gerçekleştirin.
- Her reaksiyon başına aşağıdaki bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın: 10 μL 2x tampon (gDNA serbest bırakma kitinden), her astarın 0,5 μM'si, EvaGreen boyasının 1 μL'si, 0,4 μL polimeraz (gDNA serbest bırakma kitinden) ve moleküler dereceli su ile 19 μL'ye kadar tamamlayın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, ana karışımın 19 μL'lik kısmını her kuyuya aktarın. Bölüm 2'de hazırlanan sivrisinek DNA'sını içeren DNA salınım çözeltisinin 1 μL'lik kısmını plakaya aktarın (Şekil 3A). Plakayı optik PCR plaka contası ile kapatın.
- PCR'yi bisiklet parametrelerini izleyerek gerçekleştirin: 5 dakika için 98 °C, 10 s için 98 °C'nin 39 döngüsü, 30 s için seçilen tavlama sıcaklığı (72 °C); 2 dakika boyunca son uzatma 72 °C.
- Parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturun: 1 dakika boyunca denatürasyon adımı 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C tavlama, 0,2 °C artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi algılama, her sıcaklıkta 10 s tutma süresi. CFX96 Gerçek Zamanlı Sistemi kullanılarak yürütülen HRMA için yazılım kurulumunun ayrıntılı açıklaması için Ek Malzeme ve Ek Şekil S1-S5'e bakın.
- Eriyik profillerini inceleyin (Şekil 3B). Başvuru kümesine vahşi tür denetimi atayın.
NOT: Yazılım ( bkz. Malzeme Tablosu) verileri otomatik olarak normalleştirir ve farklı erime eğrileri için renklerle kümeler belirler. - Farklı kümeleri 96 kuyulu şablonda karşılık gelen renklerle işaretleyin (Şekil 3C).
- İlgi kıvrımları olan bireyleri seçin, tüplerden çıkarın ve geriye dönün (Şekil 3D). Çiftmiş dişileri kanla besleyin ve G2 yumurtalarını toplayın.
4. Sanger dizileme ile sıra doğrulaması
- PCR ürününü, artık PCR astarlarını bozmak için bir enzim kullanarak ve fazla dNTP'leri defosforilasyon yaparak seçilen sivrisineklerle (bölüm 3.1'de hazırlanan plakadan) kuyulardan arındırın. Alternatif olarak, herhangi bir sütun temizleme kiti kullanın ve örnekleri sıralamaya devam edin.
NOT: PCR ürün boyutu küçük olduğunda (≤200 bp) doğrudan sıralama daha zor olabilir. Bu gibi durumlarda, hedef bölgeyi (≥250 bp) kapsayan daha büyük parçaları yükseltmek ve 96 kuyu plakasındaki DNA'yı kullanarak PCR ile yükseltmek için astarlar tasarlayın (adım 2.2). - İzleme görüntüleyici yazılımını kullanarak indelleri analiz edin ve tanımlayın (Şekil 4). Alternatif olarak, Poly Peak Parser software20 heterozygöz bireylerdeki mutasyonu tespit etmenize yardımcı olabilir.
- Poly Peak Parser web sitesine gidin, Gözat menüsündeki mutant bireylerden sırayı seçin ve referans sırasını kopyalayıp kutuya yapıştırın.
NOT: Alternatif alel ve referans arasındaki hizalama otomatik olarak ekranın sağ tarafında görünecektir.
- Poly Peak Parser web sitesine gidin, Gözat menüsündeki mutant bireylerden sırayı seçin ve referans sırasını kopyalayıp kutuya yapıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AaeZIP11 (putatif demir taşıyıcı21) ve miyo-fem (uçuş kaslarıyla ilgili kadın taraflı bir miyosin geni13) genlerinde mutasyon içeren sivrisinekler CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak, HRMA kullanılarak genotiplenmiş ve sırayla doğrulanmış olarak elde edilmiştir (Şekil 5). Şekil 5A ve Şekil 5C, sırasıyla AaeZIP11 ve myo-fem mutant örneklerinden hrm eğrilerinden normalleştirilmiş floresan yoğunluğunu ve vahşi tip kontrolleri göstermektedir. Şekil 4B ve Şekil 4D, her eğriyi vahşi tip referansından çıkardıktan sonra yazılım tarafından atanan farklı kümelerin eriyik profilleri arasındaki fark eğrilerinin (sırasıyla AaeZIP11 ve myo-fem mutant örneklerinden) büyütmesini göstermektedir. Heterozipöz ve homozigöz mutant AaeZIP11 bireyleri farklı kümelere yerleştirildi ve vahşi tip kontrollerden kolayca ayırt edildi (Şekil 5B). Heterozygöz mutant myo-fem bireyleri de kontrollerden farklıdır (Şekil 5D). Her iki durumda da, büyük olasılıkla hedef bölgede SNP'lerin varlığı nedeniyle vahşi tür denetimleri içinde iki küme bulunduğunu unutmayın (Şekil 5), SNP'ler önlenemediğinde denetimleri mutant olarak kategorize etmekten kaçınmak için birden çok denetim örneği kullanma gereğini vurgulamaktadır.
Şekil 4A , AaeZIP11 mutantının sıra analizini göstermektedir. AaeZIP11 heterozid mutantlarından alınan elektroferogram, indelin meydana geldiği nükleotid konumunu gösterir. Polimorfik pozisyonlar her iki nükleotidleri de birlikte göstereceğinden, bu tekten çift tepeye bir kayma ile temsil edilir (Şekil 4A). Dna iplikçiklerinden biri sırasıyla silinen veya eklenen taban çiftlerinin sayısına göre diğerinden daha kısa veya daha uzun olacağından, koşunun sonundaki tek tepeler sayılarak (Şekil 4B) silinen veya eklenen temel çiftlerin sayısı hesaplanır. Sonraki nesiller için HRMA analizlerine yardımcı olmak için heterozygotların tanımlanması için mutantlardan sırayla doğrulanmış gDNA kullanılması önerilir. Benzer eğriler otomatik olarak farklı kümelere atandığında eğriler için el ile atama gerekebilir. Bu, sıcaklık kaydırılan eğriler ve fark eğrileri karşılaştırılarak yapılabilir. Örnekleri kümelere düzgün bir şekilde atamak için yazılımın el ile ayarlanmasında gerekebilir. AaeZIP11 ve Aeflightin adlı bir mutanttan elde edilen HRMA sonuçları, heterozygotları, homozigotları ve trans-heterozygotları başarılı bir şekilde kategorize etmek için bireysel örnek analizlerine ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Başlangıçta, yazılımdan otomatik küme ataması gruplar arasında uygun bir ayrım yapamadı (Şekil 6A, Şekil 6C, Şekil 6E ve Şekil 6G). Daha sonra her örnek ayrı ayrı analiz edildi ve heterozygotlar, homozigotlar ve trans-heterozygotların (daha önce sıralama ile doğrulanmış) referans örneklerine benzerlik esas alınarak doğru gruplara atandı (Şekil 6B, Şekil 6D, Şekil 6F ve Şekil 6H).
Şekil 1: SNP tanımlaması. Vahşi türden AaeZIP11 parçasının birden çok sıra hizalamasının şematik gösterimi. Kırmızıda SNP'ler ve yeşilde SNP'lerden arındırılmış parçalar vardır; bu SNP'suz bölge sgRNA ve astar tasarımı için önerilir. Kısaltmalar: SNP = tek nükleotid polimorfizmi; sgRNA = tek kılavuz RNA; LVP = Liverpool gerginliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HRMA için sivrisinek bacaklarından genomik DNA elde etmek için deneysel prosedür. (A) Pipetler, uçlar, PCR plakası, optik conta, rezervuar, seyreltme tamponu ve DNA salınım çözeltisi dahil olmak üzere genomik DNA elde etmek için malzemeler. (B) DNA salınım reaktifi ve seyreltme tamponu içeren PCR plaka hazırlığı. (C) CO2 ile sivrisinek anestezisi. (D) Numuneler arasındaki kirlenmeyi önlemek için cımbızın %70 etanol ile silinmesi. (E) Cımbız, sivrisinek şişeleri için raf, uyuşturulmış sivrisineklerin bulunduğu bir buz kabının üzerine Petri kabı ve daha önce hazırlanmış PCR plakasını içeren deneysel kurulum. (F) Sivrisinek bacağının çıkarılması. (G) DNA salınım reaktif çözeltisine batırılmakta olan sivrisinek bacağının yakınlaştırma görünümü. (H) Şişeye yerleştirilen tek sivrisinek. (I) Sivrisinek bacaklarını içeren PCR plakasını kapatmak. Kısaltma: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İkM analizleri için deneysel prosedür. (A) Serbest bırakılan gDNA'yı PCR karışımını içeren 96 kuyulu bir tabağa aktarın. (B) Fark eğrilerinin görsel incelemesi. (C) 96 kuyulu şablondaki her örneği ilgili fark eğrisi rengiyle aynı renkle işaretlemek. (D) Aynı kümedeki bireyleri ters acrossing. Kısaltmalar: HRM = yüksek çözünürlüklü erime; gDNA = genomik DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: AaeZIP11 mutantının sıra analizi. (A) AaeZIP11Δ56 mutantının nükleotid hizalaması. Sarı ile vurgulanan tireler silinen tabanlardır. Kutuda, elektroferogram tek tepelerden çift tepelere geçiş yaparak silmenin gerçekleştiği konumu (ok) tasvir eder. (B) Sıralama koşusunun sonunun elektroferogramı ve çift tepelerden tek tepelere geçiş. Tek tepe sayısının silinen taban sayısını (gri dikdörtgen) temsil ettiğini unutmayın. Astar dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sivrisinek bacaklarından çıkarılan DNA'nın HRMA'sı. DNA, AaeZIP11 (A ve B) ve myo-fem (C ve D) nakavt Ae. aegypti sivrisineklerinden tek bir bacaktan çıkarıldı ve HRMA tarafından analiz edildi. A ve C , örneklerin normalleştirilmiş floresan sinyallerini 1,0 ila 0 göreli değerlerine gösterir. B ve D , her eğriyi vahşi tip referansından (Liverpool suşu) çıkararak eğri farklılıklarının büyütülmüş olduğunu gösterir. Kısaltmalar: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi; LVP = Liverpool gerginliği; RFU = göreli floresan üniteleri. Astar dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: El ile grup atama örnekleri. (A-D) Aeflightin mutantları için HRMA. (A ve C) Eriyik eğrileri (sırasıyla normalleştirilmiş doğrusal ölçek eğrileri ve fark eğrileri) Hassas Eriyik Analiz Yazılımı tarafından otomatik olarak gruplandırılır. (B) Diferansiyel eğrilerin normalleştirilmesi manuel olarak değiştirilmiştir. (D) Diferansiyel eğrilerin normalleşmesini değiştirdikten sonra, her örnek, karşılık gelen pozitif kontroller için fark eğrilerindeki en yüksek sıcaklıklar tarafından ayrı ayrı atandı (daha önce Δ4 ve Δ5 heterozygotlar ve Δ4Δ5 trans-heterozygotlar tarafından tanımlanan sıralanmış numuneler), 3 grubun net tanımlanmasını sağladı. Farklı sıcaklıklarda zirveleri vurgulamak için kırmızı ve kahverengi oklar eklenir. (E-H) AaeZIP11 mutantları için HRMA. (E ve G) Eriyik eğrileri yazılım tarafından otomatik olarak atanır. (F ve H) İkinci heterozipöz kendinden çaprazdaki mutantlar, normalleştirilmiş ve fark eğrilerinin daha önce belirlenen referanslara benzerliği ile doğru gruplara uygun şekilde atanmıştır (eğrilerde renk kodlu). Heterozygotes asg, Homozygotes asg ve Trans-heterozygotes asg: Precision Melt Analysis Software tarafından atanan eriyik eğrileri. Kısaltmalar: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi; LVP = Liverpool gerginliği; RFU = göreli floresan üniteleri. Astar dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Materyal: CFX96 Gerçek Zamanlı Sistemde HRMA'yı kurmak için ayrıntılı protokol (örneğin, Bio-rad).
Ek Şekil S1: Bio-rad CFX Manager'da bisiklet protokolünü ayarlamak için adım adım talimatlar. Bkz. Ek Malzeme 2.1-2.3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Bio-rad CFX Manager'da plaka kurulumu için adım adım yönergeler. Bkz. Ek Malzeme 3.1-3.4. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: Bio-rad CFX Manager'da plaka kurulumu için adım adım talimatlar. Bkz. Ek Malzeme 3.5-3.6. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S4: Bio-rad CFX Manager'da çalıştırma kurulumu için adım adım yönergeler. Bkz. Ek Malzeme 4.1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S5: Bio-rad CFX Manager'da HRMA analizi için adım adım talimatlar. Bkz. Ek Malzeme 5.1-5.3. Kısaltma: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo S1: Astarların listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek çözünürlüklü eriyik analizi, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen indellerin vektör sivrisinek Ae. aegypti'de tanımlanması için basit ve hızlı bir çözüm sunar. Uçuş kasından demir metabolizmasına ve daha fazla 13,14'e kadar çok çeşitli genler için mutasyona uğramış sivrisineklerin genotiplemesini sağlayan esneklik sağlar. HRMA, numune toplamadan son analizlere kadar sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Astar tasarımı için ek süre gereklidir ve ayrıca gerekli sıralama sonuçlarını (SNP'lerin tanımlanması için), sıra analizlerini ve astar sıralamasını alma süresine de bağlı olacaktır.
Burada sunulan protokolde başarılı analizler için adım adım yöntemler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu süreçteki en kritik adımlardan biri astarların uygun tasarımıdır. HRMA, yükseltilen parçanın içindeki tek bir SNP'nin bile varlığının mutasyon olarak yanlış yorumlanabilecek güçlü bir fark eğrisiyle sonuçlanabileceği konusunda yeterince hassastır. CRISPR mutagenezi öncesinde laboratuvar koloni örneklerinin sıralanmasının, hedefi tasarlarken SNP bakımından zengin bölgelerin tespit edilmesine ve önlenmesine olanak tanır; HRMA astarları bu sorunu önlemeye yardımcı olacaktır. Küçük ampliconlar (70-100 bp) için astarlar tasarlamak, daha büyük parçalar birkaç erime etki alanı sunabildiğinden, varyantları ayırt etme şansını azaltabileceğinden deneyin hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini de artırabilir22. Tekniğin bir sınırlaması, SNP'lerden tamamen kaçınmanın gene bağlı olarak mümkün olmayabileceğidir; bu nedenle, birden fazla vahşi tip kontrol bireyinin dizilimi ve daha fazla kullanımı analizlere yardımcı olabilir.
Özellikle bu protokol için, genotipli sivrisinekleri canlı tutmak önemlidir, böylece mutant hatlarının kurulması için geriye doğru aşılabilirler. GDNA'yı çıkarmak için sivrisinek bacaklarından birini çıkarmak, bunu başarmanın en az istilacı yolu olabilir; ancak bu dokudan geri kazanılan gDNA miktarı minimumdur. Malzeme Tablosunda önerilen kit, bir sivrisinek bacağından DNA elde etmek ve HRMA'yı tamamlamak için PCR'yi gerçekleştirmek için yeterliydi.
HRMA, tek tabanlı uyuşmazlıklardan birden fazla taban çiftine (AaeZIP11'in 56 bp silmesi vardı) ve tek taban uyuşmazlığı veya küçük delesyonlarla (~20 bp) sınırlı olan SNA veya T7E1 (her ikisi de enzim uyuşmazlığı bölünme tahlilleri) gibi yöntemleri aşan çok çeşitli indel boyutlarının tespiti açısından daha fazla esneklik sunabilir. 23. Ek olarak, PCR ürünleri uyuşmazlık içermediği için SNA homozigot mutantları algılamaz. Ayrıca, nükleazla işlenmiş PCR ürünleri mutant alellerine benzer uzunluğa sahip olduğunda SNA sonuçları doğal olarak oluşan allelik polimorfizmler tarafından maskelenebilir. Bu sınırlamaların hiçbiri HRMA için geçerli değildir. Sonuçta, mutant DNA dizisini tanımlamak için sıralama gereklidir. Bununla birlikte, söz konusu mutasyon bilindiğinde, mutant bireylerin tanımlanması için kullanılan HRMA doğrudan sıralamadan çok daha hızlıdır. Bu yöntem değerli örnekleri korur (daha fazla sivrisinek hayatta kalır, genotip sonuçlarını beklemek zorunda kalırlar) ve çok sayıda numunenin dizilimi ihtiyacını azaltır ve deneyin toplam maliyetini düşürür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Tüm rakamlar Texas A&M Üniversitesi lisansı altında Biorender.com ile oluşturuldu. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalık Enstitüsü (AI137112 ve AI115138'den Z.N.A.'ya), Böcek Vektörlü Hastalık Hibe Programı kapsamında Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch proje 1018401 tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
- WHO.
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
