Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Indel Detection efter CRISPR/Cas9 Mutagenese ved hjælp af høj opløsning Smelte Analyse i Mosquito Aedes aegypti

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63008
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

Summary

Denne artikel beskriver en protokol til hurtig identifikation af indels induceret af CRISPR / Cas9 og udvælgelse af mutant linjer i myg Aedes aegypti ved hjælp af høj opløsning smelte analyse.

Abstract

Myggegenredigering er blevet rutine i flere laboratorier med etablering af systemer som transskription-aktivator-lignende effektornukleaser (TALEN'er), zink-fingernukleaser (ZFN'er) og homing endonucleaser (HEs). For nylig har klynget regelmæssigt interspaced korte palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) teknologi tilbudt et lettere og billigere alternativ til præcision genom engineering. Efter nuklease handling, DNA reparation veje vil fastsætte de brudte DNA-ender, ofte indføre indels. Disse out-of-frame mutationer bruges derefter til at forstå genfunktion i målorganismerne. En ulempe er imidlertid, at mutant individer bærer ingen dominerende markør, hvilket gør identifikation og sporing af mutant alleler udfordrende, især i skalaer, der er nødvendige for mange eksperimenter.

Høj opløsning smelteanalyse (HRMA) er en enkel metode til at identificere variationer i nukleinsyre sekvenser og udnytter PCR smeltekurver til at opdage sådanne variationer. Denne post-PCR analysemetode bruger fluorescerende dobbeltstrengede DNA-bindende farvestoffer med instrumentering, der har temperaturrampe kontrol datafangst kapacitet og er let skaleres til 96-brønd pladeformater. Beskrevet her er en simpel arbejdsgang ved hjælp af HRMA til hurtig påvisning af CRISPR / Cas9-inducerede indels og etablering af mutantlinjer i myggen Ae. aegypti. Kritisk, alle trin kan udføres med en lille mængde benvæv og kræver ikke at ofre organismen, så genetiske kors eller phenotyping assays, der skal udføres efter genotyping.

Introduction

Som vektorer af patogener som dengue1, Zika2 og chikungunya3-vira samt malariaparasitter4 udgør myg en betydelig trussel mod folkesundheden mod mennesker. For alle disse sygdomme er der et betydeligt fokus på transmissionsintervention på kontrol af mygvektorer. Undersøgelse af de gener, der er vigtige i for eksempel eftergivenhed over for patogener, mygfitfitness, overlevelse, reproduktion og resistens over for insekticider, er nøglen til udvikling af nye mygkontrolstrategier. Til sådanne formål er genomredigering i myg ved at blive en almindelig praksis, især med udviklingen af teknologier som HEs, ZFN'er, TALEN'er og senest CRISPR med Cas9. Etableringen af gen-redigerede stammer involverer typisk backcrossing personer, der bærer de ønskede mutationer i et par generationer for at minimere off-target og grundlægger (flaskehals) effekter, efterfulgt af at krydse heterozygote individer til at generere homozygot eller trans-heterozygot linjer. I mangel af en dominerende markør er molekylær genotyping nødvendig i denne proces, fordi der i mange tilfælde ikke kan påvises klare fænotypiske træk for heterozygote mutanter.

Selvom sekventering er guldstandarden for genotypisk karakterisering, udgør dette på tværs af hundreder, eller muligvis tusindvis af individer, betydelige omkostninger, arbejdskraft og tid, der kræves for at opnå resultater, hvilket er særligt kritisk for organismer med kort levetid som myg. Almindeligt anvendte alternativer er Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6, og høj opløsning smelte analyse (HRMA, gennemgået in7). Både SNA og T7E1 bruger endonucleaser, der kun spalter uoverensstemmende baser. Når en muteret region af det heterozygode mutantgenom forstærkes, forstærkes DNA-fragmenter fra mutante og vilde alleler for at lave uoverensstemmende dobbeltstrenget DNA (dsDNA). SNA registrerer tilstedeværelsen af uoverensstemmelser via fordøjelsen med en mismatch-specifik endonuclease og simpel agarose gel elektroforese. Alternativt bruger HRMA de termodynamiske egenskaber af dsDNA opdaget af dsDNA-bindende fluorescerende farvestoffer, med disassociation temperaturen af farvestoffet varierende baseret på tilstedeværelsen og typen af mutation. HRMA er blevet brugt til påvisning af enkelt-nukleotidpolymorfier (SNPs)8, mutant genotyping af zebrafisk9, mikrobiologiske anvendelser10 og plantegenetisk forskning11, blandt andre.

Dette papir beskriver HRMA, en simpel metode til molekylær genotyping for mutant myg genereret af CRISPR / Cas9 teknologi. Fordelene ved HRMA frem for alternative teknikker omfatter 1) fleksibilitet, da det har vist sig nyttigt for forskellige gener, en bred vifte af indel størrelser, samt sondringen mellem forskellige indel størrelser og heterozygot, homozygot, og trans-heterozygot differentiering12,13,14, 2) omkostninger, da det er baseret på almindeligt anvendte PCR reagenser, og 3) tidsbesparende, som det kan udføres på blot et par timer. Derudover bruger protokollen en lille kropsdel (et ben) som en kilde til DNA, så myggen kan overleve genotypingprocessen, hvilket tillader etablering og vedligeholdelse af mutantlinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Scanning efter enkelt nukleotidpolymorfier (SNPs), HRMA primer design og primer validering

  1. SNP identifikation i vilde-type laboratorium koloni myg
    1. Vælg mål exon at forstyrre korrekt polypeptid oversættelse.
      BEMÆRK: Målet skal være tæt på startkodon eller blandt de vigtigste rester, der kræves til proteinfunktion. Jo kortere exon (f.eks. ≤200 baser), jo vanskeligere er det at målrette og analysere. Undgå at redigere tæt på grænserne for en exon, da dette tvinger en af HRMA-primerne til enten at krydse en intron eller være i en intron. Dette er uønsket, fordi SNP satser tendens til at være meget større i disse regioner.
    2. Primer design
      1. Gå til NCBI Blast - Primer Blast hjemmeside15, kopiere og indsætte den valgte exon i boksen øverst på siden | vælge PCR-produktstørrelsen (sørg for, at den omfatter det meste af exonen) | vælge organismen.
      2. Klik på Avancerede parametre | Vælg (pcr produkt Tm) og tilsæt 60 (for en optimal temperatur på 60 °C) | Hent primere. Hold de andre parametre som standard.
    3. Opnå genomisk DNA (gDNA) fra den vilde laboratoriekoloni. Sæt 10 myg til side, bedøve dem med CO2, og læg dem i en petriskål på is for at holde dem inaktive. Opsætning af 10 rør indeholdende 0,5 μL af reagenset til frigivelse af DNA fra væv og 20 μL fortyndingsbuffer, som begge findes i dna-frigivelsessættet, der er foreslået i materialetabellen.
    4. Fjern det ene ben fra en enkelt myg ved hjælp af sammenkr og læg det i et tilsvarende rør af en fortyndet opløsning af DNA-frigivelsesreagenset (fra trin 1.1.3), der helt nedsænker benet i opløsningen. Gentag dette trin med de resterende myg, tørrer sammentene med 70% ethanol, før du fortsætter til den næste.
    5. Inkuber den benholdige opløsning ved stuetemperatur i 2-5 min, derefter ved 98 °C i 2 min, og lad den køle af, mens pcr-reaktionen indstilles.
      BEMÆRK: Plader, der indeholder det frigivne gDNA, kan opbevares ved -20 °C, og protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt.
    6. 10 rør indeholdende 10 μL 2x PCR Master Mix, primere til en 0,5 μM endelig koncentration og molekylær vand til et endeligt volumen på 20 μL, og overfør 1 μL af den fortyndede prøve til hvert rør. Udfør PCR efter disse cykelparametre: 98 °C 5 min, 40 cyklusser på 98 °C for 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s pr. kb endelig forlængelse på 72 °C i 1 min.
    7. Rense PCR-produkterne med et enzym for at nedbryde de resterende PCR-primere og afphosphorylat overskydende dNTPs eller ethvert kolonneoprydningssæt. Fortsæt med at sekventere prøverne.
    8. Analyser hvert elektroferogram for tilstedeværelsen af dobbelte toppe /tvetydige baser, og juster basisopkald manuelt i hver sekvens ved hjælp af den relevante degenererede basiskode.
      BEMÆRK: Dette trin skal udføres før flere sekvensjusteringer, da det er almindeligt, at basisopkaldssoftwaren vælger den mere fremtrædende top som det "sande" basisopkald, hvilket giver det falske indtryk af fravær af SNPs.
    9. Udfør en justering med flere sekvenser ved hjælp af justeringssoftwaren SeqMan Pro, der er angivet i materialetabellen eller anden open source-justeringssoftware, f.eks.
      1. Åbn justeringssoftwaren | Klik på Tilføj sekvenser | vælg de ønskede sekvenser, og klik på Tilføj | Når alle sekvenser er valgt, skal du klikke på Udført.
      2. Klik på Saml for at udføre justeringen. Hvis du vil åbne justeringen, skal du klikke på Contig 1 og analysere justeringen og identificere SNP'erne (figur 1).
        BEMÆRK: Som et alternativ til trin 1.1.3-1.1.6 kan PCR udføres fra isoleret genomisk DNA fra bulkprøver (afledt af >10 individer). Sekvenserede amplikoner kan analyseres direkte for tilstedeværelsen af SNPs vises som dobbelt toppe i elektrosfærenogram, selvom sjældne SNPs vil være vanskeligere at opdage.
    10. Design 3-5 enkelt guide RNA'er (sgRNAs), undgå regioner, der indeholder SNP identificeret ovenfor, efter den protokol, der er beskrevet i18.
  2. HRMA primer design
    1. Test exonsekvensen for mulig dannelse af sekundære strukturer under PCR ved hjælp af mFold19.
      1. Gå til UNAFold-webserveren | Klik på mFold | klik på Programmer | DNA foldeform.
      2. Skriv sekvensnavnet i feltet , og indsæt exonen.
      3. Skift foldetemperaturen til 60 °C på de ioniske forhold ændres [Mg++] til 1,5 , og på enheder skifte til mM Klik på Fold DNA.
      4. På Output, under struktur 1, skal du klikke på pdf for at åbne den cirkulære struktur plots.
    2. Gå til NCBI Blast - Primer Blast15 for primer design.
    3. Kopier og indsæt den valgte exonsekvens, der bestemmes ved sekventering i trin 1.1 (den sekvens, der indeholder det laveste antal SNP'er eller ingen SNPs) i boksen øverst på siden.
    4. Brug symbolet < > til at markere og udelade sekvenser, der indeholder SNP'er, målwebstedet og områder med mulig dannelse af sekundær struktur.
    5. Vælg PCR-produktstørrelsen for at være mellem 80 og 150 bp og vælg organismen.
      BEMÆRK: Større fragmentstørrelser kan bruges med succes (~300 bp). Men, længere amplicons kan mindske følsomheden mellem sekvenser forskellig i en eller blot et par base par.
    6. Klik på Hent primere. Vælg 2-3 par primere, der skal testes (ideelt set er primer-websteder ≥20-50 bp væk fra eventuelle CRISPR-målsteder).
  3. Validering af primer
    1. Udfør en gradient PCR ved hjælp af gDNA fra en enkelt person.
      1. Forbered en masterblanding, og fjern et eksempel til NTC (non-template control) i et separat rør. Tilføj skabelonen til den resterende master mix og aliquot i en 96-brønd plade.
      2. Følg cykelparametrene: 98 °C 30 s, 34 cyklusser på 98 °C i 10 s, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; endelig forlængelse på 72 °C i 10 min.
      3. Generer termiske smelteprofiler efter parametrene: denatureringstrin 95 °C i 1 min, udglødning 60 °C i 1 min, smeltekurvedetektion mellem 75 °C og 95 °C i intervaller på 0,2 °C med en holdtid på 10 s ved hver temperatur.
        BEMÆRK: Der må kun anvendes udglødningstemperaturer med en enkelt termisk smelteprofil.
  4. Fortsæt med at generere mutant linjer med embryo injektioner som beskrevet i12.

2. Forberedelse af genomisk DNA fra myggeben

  1. Adskil G1 myg efter køn på pupalstadiet, så de ikke parrer sig før genotyping, og sørg for, at aldersmatchede, vilde kontrol myg vil være tilgængelige til brug for referencer og backcrosses. Sex-adskille dem på samme måde.
  2. Saml de nødvendige materialer (figur 2A), og klargør en 96 brønd PCR-plade med 0,5 μL af DNA-frigivelsesreagenset og 20 μL fortyndingsbuffer (fra gDNA-frigivelsessættet) pr. person, der skal genotypes (figur 2B) og lade det være på is. Reserver to reaktioner til NTC.
  3. Mærk en bakke til myggeglas (Drosophila hætteglas), så hver brønd på 96-pladen svarer til det respektive myggeglas i bakken.
  4. Bedøve G1 myg med CO2 og placere dem i et glas Petriskål for at holde dem bedøvet (Figur 2C, D). Bedøve og placere 8 vilde myg i en anden Petri skål.
  5. Tør et par pincet med 70% ethanol og fjern et af myggens bagben (Figur 2E,F).
  6. Dyk benet ned i DNA-frigivelsesreagenopløsningen, læg myggen i det tilsvarende hætteglas, og luk den med en svamp (Figur 2G,H).
  7. Tør pincet igen med 70% ethanol og fortsæt med at fjerne benet fra den næste myg. Gentag trin 2.5-2.7, indtil 96-brøndspladen er afsluttet.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at tørre pincet med 70% ethanol. Dette minimerer DNA krydskontaminering.
  8. Forsegl pladen med en optisk PCR-pladetætning (figur 2I), og inkuber den 96 brøndplade, der indeholder benene ved stuetemperatur (RT) i 2-5 min og derefter ved 98 °C i 2 min. Lad pladen køle ned til RT, mens pcr-blandingen forberedes.
    BEMÆRK: Hele processen tager typisk 3-4 timer. Hvis myggene skal opbevares i hætteglassene i længere tid end den forventede varighed (især ≥1 dag), skal du placere et lille stykke rosin (eller kilde til sukker og vand) med hver myg for at sikre myggenes overlevelse under udvidede inkubationer.

3. HRMA

  1. Udfør PCR.
    1. Der fremstilles en masterblanding, der indeholder følgende komponenter pr. hver reaktion: 10 μL 2x buffer (fra gDNA-frigivelsessættet), 0,5 μM af hver primer, 1 μL EvaGreen-farvestof, 0,4 μL polymerase (fra gDNA-frigivelsessæt) og komplet til 19 μL med molekylært vand.
    2. Ved hjælp af en multikanalpipet overføres 19 μL af masterblandingen til hver brønd. Overfør 1 μL af DNA-frigivelsesopløsningen, der indeholder mygge-DNA, der er fremstillet i afsnit 2, til pladen (figur 3A). Forsegl pladen med en optisk PCR pladeforsegling.
    3. Pcr'en udføres efter cykelparametrene: 98 °C i 5 min, 39 cyklusser på 98 °C i 10 s, den valgte udglødningstemperatur (72 °C) i 30 s; endelig forlængelse 72 °C i 2 min.
  2. Generer termiske smelteprofiler efter parametrene: denatureringstrin 95 °C i 1 min, udglødning 60 °C i 1 min, smeltekurvedetektion mellem 75 °C og 95 °C i intervaller på 0,2 °C med en holdtid på 10 s ved hver temperatur. Se den supplerende materiale og supplerende figur S1-S5 for en detaljeret beskrivelse af softwareopsætningen for HRMA-kørsel ved hjælp af CFX96 Real-Time System.
  3. Undersøg smelteprofilerne (figur 3B). Tildel kontrolelement af typen joker til referenceklyngen.
    BEMÆRK: Softwaren (se Materialetabellen) normaliserer automatisk dataene og udpeger klynger med farver til forskellige smeltekurver.
  4. Markér de forskellige klynger med tilsvarende farver på 96-brøndsskabelonen (Figur 3C).
  5. Vælg de personer med interessekurver, fjern dem fra rørene og backcross (Figur 3D). Blod-feed de parrede kvinder og indsamle G2 æg.

4. Sekvens verifikation af Sanger sekventering

  1. Rense PCR-produktet fra brøndene med udvalgte myg (fra pladen fremstillet i afsnit 3.1) ved hjælp af et enzym til at nedbryde de resterende PCR-primere og dephosphorylat overskydende dNTPs. Alternativt kan du bruge et kolonneoprydningssæt og fortsætte med at sekventere prøverne.
    BEMÆRK: Direkte sekventering kan være mere udfordrende, når PCR-produktstørrelsen er lille (≤200 bp). I sådanne tilfælde skal grundgrundere designes til at forstærke større fragmenter, der omfatter målstedet (≥250 bp) og forstærkes af PCR ved hjælp af DNA'et i 96-brøndspladen (trin 2.2).
  2. Analysere og identificere indels ved hjælp af spor viewer software (Figur 4). Alternativt kan Poly Peak Parser software20 hjælpe med at opdage mutationen hos heterozygote individer.
    1. Gå til Poly Peak Parser hjemmeside, skal du vælge sekvensen fra mutant individer i menuen Gennemse , og kopiere og indsætte referencesekvensen på boksen.
      BEMÆRK: Justeringen mellem den alternative alleel og referencen vises automatisk i højre side af skærmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Myg, der indeholder mutationer i generne AaeZIP11 (putativ jerntransporter21) og myo-fem (et kvindeligt partisk myosin-gen relateret til flyvemuskler13) blev opnået ved hjælp af CRISPR/Cas9-teknologi, genotyped ved hjælp af HRMA og sekvensver verificeret (Figur 5). Figur 5A og figur 5C viser den normaliserede fluorescensintensitet fra HRM-kurverne fra henholdsvis AaeZIP11 og myo-fem mutantprøver sammen med vilde kontrolelementer. Figur 4B og figur 4D viser forstørrelsen af differencekurverne (fra henholdsvis AaeZIP11 og myo-fem mutantprøverne) mellem smelteprofilerne for de forskellige klynger, som softwaren tildeler efter at have trukket hver kurve fra referencen af vildtypen. Heterozygot og homozygot mutant AaeZIP11 individer blev placeret i forskellige klynger og adskiller sig let fra de vilde kontrolelementer (Figur 5B). Heterozygo mutant myo-fem individer adskiller sig også fra kontrollerne (Figur 5D). Bemærk, at der i begge tilfælde var to klynger inden for vildtlignende kontroller, sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af SNPs i målområdet (figur 5), hvilket understreger behovet for at bruge flere kontrolprøver for at undgå kategorisering af kontroller som mutanter, når SNPs ikke kan undgås.

Figur 4A viser sekvensanalysen af AaeZIP11-mutanten . Elektropherogrammet fra AaeZIP11 heterozygo mutanter angiver nukleotidpositionen, hvor indel opstod. Dette er repræsenteret ved et skift fra enkelt til dobbelt toppe som polymorfe positioner vil vise begge nukleotider samtidig (Figur 4A). Antallet af basispar, der blev slettet eller indsat, blev beregnet ved at tælle de enkelte toppe i slutningen af kørslen (figur 4B), da en af DNA-strengene vil være kortere eller længere end den anden af antallet af basispar, der henholdsvis slettes eller indsættes. Det anbefales at bruge sekvensverierede gDNA fra mutanterne som reference til identifikation af heterozygoterne til at hjælpe med HRMA-analyser for efterfølgende generationer. Manuel tildeling af kurverne kan være nødvendig, når lignende kurver automatisk tildeles til forskellige klynger. Dette kan gøres ved at sammenligne de temperaturforskydede kurver og forskelskurver. Manuel justering af softwaren kan være nødvendig for korrekt at tildele prøver til klynger. HRMA resultater fra AaeZIP11 og en mutant kaldet Aeflightin viser, at individuelle prøveanalyser var nødvendige for at kunne kategorisere heterozygoter, homozygoter og trans-heterozygoter. I første omgang kunne den automatiske klyngetildeling fra softwaren ikke skelne ordentligt mellem grupperne (figur 6A, figur 6C, figur 6E og figur 6G). Hver prøve blev derefter analyseret individuelt og tildelt de korrekte grupper baseret på lighed med referenceprøver af heterozygoter, homozygoter og trans heterozygoter (tidligere verificeret ved sekventering) (Figur 6B, Figur 6D, Figur 6F og Figur 6H).

Figure 1
Figur 1: SNP-identifikation. Skematisk repræsentation af flere sekvensjusteringer af AaeZIP11-fragment fra wild-type. I rødt er SNPs, og i grønt er fragmenter fri for SNPs; denne SNP-fri region er foreslået til sgRNA og primer design. Forkortelser: SNP = enkelt nukleotidpolymorfi; sgRNA = enkelt guide RNA; LVP = Liverpool stamme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel procedure for opnåelse af genomisk DNA fra myggeben til HRMA. (A) Materialer til opnåelse af genomisk DNA, herunder pipetter, spidser, PCR-plade, optisk forsegling, reservoir, fortyndingsbufferen og DNA-frigivelsesopløsningen. B) PCR-pladepræparat, der indeholder DNA-frigivelsesreagens og fortyndingsbuffer. (C) Myggebedøvelse med CO2. D) Aftørring af pincet med 70 % ethanol for at forhindre kontaminering mellem prøverne. (E) Eksperimentel opsætning, herunder pincet, rack til myggeglas, petriskål oven på en isbeholder med bedøvede myg og den tidligere forberedte PCR-plade. (F) Fjernelse af myggebenet. (G) Zoomvisning af myggebenet, der nedsænkes i DNA-frigivelsesreagensopløsningen. (H) Enkelt myg placeret i hætteglasset. (I) Forsegling af PCR-pladen, der indeholder myggebenene. Forkortelse: HRMA = smelteanalyse med høj opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentel procedure for HRM-analyser. (A) Overførsel af den frigivne gDNA til en 96-brønds plade, der indeholder PCR-blandingen. (B) Visuel inspektion af differencekurverne. (C) Markering af hver prøve på 96-brønd skabelonen med samme farve som dens respektive forskel kurve farve. (D) Tilbagekrydsning af individerne fra samme klynge. Forkortelser: HRM = smelte i høj opløsning; gDNA = genomisk DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sekvensanalyse af en AaeZIP11 mutant. (A) Nukleotidjustering af AaeZIP11Δ56-mutanten. Tankestreger fremhævet med gul er de slettede baser. I boksen skifter elektropherogrammet fra enkelte toppe til dobbelte toppe, der viser den position, hvor sletningen fandt sted (pil). (B) Elektropherogram i slutningen af sekventeringskørslen og overgangen fra dobbelte toppe til enkelte toppe. Bemærk, at antallet af enkelte toppe repræsenterer antallet af slettede baser (gråt rektangel). Primersekvenser findes i supplerende tabel S1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: HRMA af DNA udvundet af myggeben. DNA blev udvundet fra et enkelt ben fra AaeZIP11 (A og B) og myo-fem (C og D) knockout Ae. aegypti myg og analyseret af HRMA. A og C angiver prøvernes normaliserede fluorescenssignaler til relative værdier på 1,0 til 0. B og D angiver forstørrelsen af kurveforskellene ved at trække hver kurve fra referencen af vildtypen (Liverpool-stammen). Forkortelser: HRMA = smelteanalyse i høj opløsning; LVP = Liverpool stamme; RFU = relative fluorescensenheder. Primersekvenser findes i supplerende tabel S1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksempler på manuelle gruppetildelinger. (A-D) HRMA for Aeflightin mutanter. (A og C) Smeltekurver (henholdsvis normaliserede lineære skalakurver og forskelskurver) grupperes automatisk efter Precision Melt Analysis Software. (B) Normalisering af differentialkurver ændret manuelt. (D) Efter at have ændret normaliseringen af differentialkurverne blev hver prøve tildelt individuelt af spidstemperaturerne i forskelskurverne for tilsvarende positive kontroller (tidligere sekventeret prøver identificeret af Δ4 og Δ5 heterozygoter og Δ4Δ5 trans-heterozygoter), hvilket muliggør en klar identifikation af de 3 grupper. Røde og brune pile tilføjes for at fremhæve toppe ved forskellige temperaturer. (E-H) HRMA for AaeZIP11 mutanter. (E og G) Smeltekurver tildeles automatisk af softwaren. (F og H) Mutanter i det andet heterozygode selvkors blev passende tildelt de korrekte grupper ved ligheden mellem de normaliserede og forskellige kurver til tidligere fastlagte referencer (farvekodet i kurver). Heterozygotes asg, Homozygotes asg, og Trans-heterozygotes asg: tildelt smelte kurver af Precision Melt Analysis Software. Forkortelser: HRMA = smelteanalyse i høj opløsning; LVP = Liverpool stamme; RFU = relative fluorescensenheder. Primer sekvenser er fastsat i supplerende tabel S1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende materiale: Detaljeret protokol til opsætning af HRMA i CFX96 Real-Time System (f.eks Bio-rad). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S1: Trinvis vejledning i opsætning af cykelprotokollen om Bio-rad CFX Manager. Se supplerende materiale 2.1-2.3. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Trinvis vejledning til en pladeopsætning på Bio-rad CFX Manager. Se supplerende materiale 3.1-3.4. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Trinvis vejledning til en pladeopsætning på Bio-rad CFX Manager. Se supplerende materiale 3.5-3.6. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Trinvis vejledning til kørselsopsætningen på Bio-rad CFX Manager. Se supplerende materiale 4.1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S5: Trinvis vejledning til HRMA-analyse på Bio-rad CFX Manager. Se supplerende materiale 5.1-5.3. Forkortelse: HRMA = smelteanalyse med høj opløsning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Liste over primere. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Smelteanalyse med høj opløsning tilbyder en enkel og hurtig løsning til identifikation af indels genereret af CRISPR/Cas9-teknologi i vektormyggen Ae. aegypti. Det giver fleksibilitet, der muliggør genotyping af myg muteret for en bred vifte af gener fra flyvemuskel til jernmetabolisme og mere13,14. HRMA kan udføres på få timer fra prøvesamling til de endelige analyser. Ekstra tid er nødvendig for primer design og vil også afhænge af den tid til at modtage eventuelle nødvendige sekventering resultater (til identifikation af SNPs), sekvens analyser, og primer bestilling.

Den protokol, der præsenteres her, beskriver de trinvise metoder til vellykkede analyser. Et af de mest kritiske trin i denne proces er det korrekte design af primerne. HRMA er tilstrækkeligt følsom, at tilstedeværelsen af selv en enkelt SNP i fragmentet forstærket kan resultere i en stærk forskel kurve, der kan misforstås som en mutation. Sekventering af laboratoriekoloniprøver forud for CRISPR-mutagenese giver mulighed for påvisning og undgåelse af SNP-rige områder, når målet udformes. HRMA-primerne vil bidrage til at forhindre dette problem. Design primere til små ampliconer (70-100 bp) kan også forbedre følsomheden og reproducerbarheden af eksperimentet som større fragmenter kan præsentere flere smelte domæner, mindske chancen for at skelne varianter22. En begrænsning af teknikken er, at det måske ikke er muligt helt at undgå SNPs afhængigt af genet; sekventering og yderligere brug af flere vilde kontrolpersoner kan således støtte analyserne.

Specielt til denne protokol er det vigtigt at holde genotyped myg i live, så de kan vendes tilbage til etablering af mutantlinjer. Fjernelse af en af mygbenene for at udtrække gDNA kan være den mindst invasive måde at opnå det på; mængden af gDNA, der genvindes fra dette væv, er dog minimal. Sættet foreslået i tabellen af materialer var tilstrækkelig til at opnå DNA fra en myg ben og udfører PCR at fuldføre HRMA.

HRMA kan tilbyde mere fleksibilitet med hensyn til påvisning af en bred vifte af indel størrelser, varierende fra single-base uoverensstemmelser til flere base par (AaeZIP11 havde en 56 bp sletning) og overgår metoder såsom SNA eller T7E1 (begge enzyme mismatch kavalergang assays), der er begrænset til single-base mismatch eller små sletninger (~ 20 bp)5, 23. Derudover registrerer SNA ikke homozygo mutanter, da PCR-produkterne ikke indeholder uoverensstemmelser. Desuden kan SNA-resultater også maskeres af naturligt forekommende allelic polymorphisms, når de nukleasebehandlede PCR-produkter har samme længde som de mutante alleler. Ingen af disse begrænsninger gælder for HRMA. I sidste ende er sekventering nødvendig for at identificere den mutante DNA-sekvens. Men når en mutation pågældende er kendt, HRMA anvendes til identifikation af mutant individer er meget hurtigere end direkte sekventering. Denne metode bevarer værdifulde prøver (flere myg vil overleve, jo mindre de skal vente på deres genotype resultater) og reducerer behovet for sekventering af et stort antal prøver, hvilket sænker de samlede omkostninger ved eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Alle tal blev skabt med Biorender.com under en licens til Texas A &M University. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 og AI115138 til Z.N.A.), Texas A &M AgriLife Research under Insect Vectored Disease Grant Program og USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-projektet 1018401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Tags

Genetik udgave 175
Indel Detection efter CRISPR/Cas9 Mutagenese ved hjælp af høj opløsning Smelte Analyse i Mosquito <em>Aedes aegypti</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes,… More

Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O'Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter