Summary
Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.
Abstract
L'editing genetico delle zanzare è diventato di routine in diversi laboratori con la creazione di sistemi come le nucleasi effettori simili a stimolatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le endonucleasi di homing (HE). Più recentemente, la tecnologia CRISPR (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) aggregolate regolarmente intervallate ha offerto un'alternativa più semplice ed economica per l'ingegneria del genoma di precisione. Seguendo l'azione della nucleasi, i percorsi di riparazione del DNA risolveranno le estremità del DNA rotte, spesso introducendo indel. Queste mutazioni fuori dal quadro vengono quindi utilizzate per comprendere la funzione genica negli organismi bersaglio. Uno svantaggio, tuttavia, è che gli individui mutanti non portano marcatori dominanti, rendendo difficile l'identificazione e il tracciamento degli alleli mutanti, specialmente alle scale necessarie per molti esperimenti.
L'analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA) è un metodo semplice per identificare le variazioni nelle sequenze di acidi nucleici e utilizza le curve di fusione pcr per rilevare tali variazioni. Questo metodo di analisi post-PCR utilizza coloranti fluorescenti a doppio filamento che legano il DNA con strumentazione che ha capacità di acquisizione dei dati di controllo della rampa di temperatura ed è facilmente scalabile a formati di piastre a 96 pozzetti. Qui è descritto un semplice flusso di lavoro che utilizza HRMA per il rilevamento rapido di indel indotti da CRISPR / Cas9 e la creazione di linee mutanti nella zanzara Ae. aegypti. Criticamente, tutti i passaggi possono essere eseguiti con una piccola quantità di tessuto delle gambe e non richiedono il sacrificio dell'organismo, consentendo l'esecuzione di incroci genetici o saggi di fenotipizzazione dopo la genotipizzazione.
Introduction
Come vettori di agenti patogeni come i virus dengue1, Zika2 e chikungunya3, nonché i parassiti malarici4, le zanzare rappresentano una significativa minaccia per la salute pubblica umana. Per tutte queste malattie, c'è un focus sostanziale dell'intervento di trasmissione sul controllo dei vettori di zanzare. Lo studio dei geni importanti, ad esempio, per il permissivismo nei confronti degli agenti patogeni, la forma fisica delle zanzare, la sopravvivenza, la riproduzione e la resistenza agli insetticidi è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie di controllo delle zanzare. Per tali scopi, l'editing del genoma nelle zanzare sta diventando una pratica comune, specialmente con lo sviluppo di tecnologie come HEs, ZFN, TALEN e, più recentemente, CRISPR con Cas9. La creazione di ceppi geneticamente modificati comporta tipicamente il backcrossing di individui portatori delle mutazioni desiderate per alcune generazioni per ridurre al minimo gli effetti off-target e founder (collo di bottiglia), seguiti dall'incrocio di individui eterozigoti per generare linee omozigoti o trans-eterozigoti. In assenza di un marcatore dominante, la genotipizzazione molecolare è necessaria in questo processo perché, in molti casi, non è possibile rilevare tratti fenotipici chiari per i mutanti eterozigoti.
Sebbene il sequenziamento sia il gold standard per la caratterizzazione genotipica, l'esecuzione di questo su centinaia, o forse migliaia di individui, pone costi significativi, manodopera e tempo necessari per ottenere risultati, il che è particolarmente critico per gli organismi con una vita breve come le zanzare. Le alternative comunemente utilizzate sono surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 e analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA, recensito in7). Sia SNA che T7E1 utilizzano endonucleasi che scindere solo basi non corrispondenti. Quando una regione mutata del genoma mutante eterozigote viene amplificata, i frammenti di DNA di alleli mutanti e wild-type vengono ricotti per produrre DNA a doppio filamento (dsDNA) non corrispondente. SNA rileva la presenza di disallineamenti attraverso la digestione con un'endonucleasi specifica per la mancata corrispondenza e una semplice elettroforesi su gel di agarosio. In alternativa, HRMA utilizza le proprietà termodinamiche del dsDNA rilevate dai coloranti fluorescenti leganti il dsDNA, con la temperatura di dissociazione del colorante che varia in base alla presenza e al tipo di mutazione. HRMA è stato utilizzato per il rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)8, genotipizzazione mutante di pesci zebra9, applicazioni microbiologiche10 e ricerca genetica vegetale11, tra gli altri.
Questo articolo descrive l'HRMA, un semplice metodo di genotipizzazione molecolare per le zanzare mutanti generato dalla tecnologia CRISPR/Cas9. I vantaggi dell'HRMA rispetto alle tecniche alternative includono 1) flessibilità, in quanto si è dimostrato utile per vari geni, una vasta gamma di dimensioni indel, nonché la distinzione tra diverse dimensioni indel e differenziazione eterozigote, omozigote e trans-eterozigote12,13,14, 2) costo, in quanto si basa su reagenti PCR comunemente usati e 3) risparmio di tempo, in quanto può essere eseguito in poche ore. Inoltre, il protocollo utilizza una piccola parte del corpo (una gamba) come fonte di DNA, consentendo alla zanzara di sopravvivere al processo di genotipizzazione, consentendo la creazione e il mantenimento di linee mutanti.
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Protocol
1. Scansione per polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), progettazione di primer HRMA e convalida del primer
- Identificazione SNP nelle zanzare selvatiche delle colonie di laboratorio
- Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione polipeptidica.
NOTA: il bersaglio deve essere vicino al codone iniziale o tra i residui chiave necessari per la funzione proteica. Più corto è l'esone (ad esempio, ≤200 basi), più difficile è il target e l'analisi. Evita di modificare vicino ai confini di un esone, poiché ciò costringe uno dei primer HRMA ad attraversare un introne o a trovarsi in un introne. Ciò è indesiderabile perché i tassi SNP tendono ad essere molto maggiori in quelle regioni. - Design del primer
- Vai al sito web NCBI Blast - Primer Blast15, copia e incolla l'esone scelto nella casella nella parte superiore della pagina | scegliere la dimensione del prodotto PCR (assicurarsi che comprenda la maggior parte dell'esone) | scegli l'organismo.
- Fare clic su Parametri avanzati | Optare (per PCR Product Tm) e aggiungere 60 (per una temperatura ottimale di 60 °C) | Ottieni primer. Mantenere gli altri parametri come predefiniti.
- Ottenere DNA genomico (gDNA) dalla colonia di laboratorio wild-type. Metti da parte 10 zanzare, anestetizzale con CO2 e mettile in una capsula di Petri sul ghiaccio per tenerle inattive. Impostare 10 provette contenenti 0,5 μL del reagente per il rilascio di DNA dai tessuti e 20 μL di tampone di diluizione, entrambe fornite nel kit di rilascio del DNA suggerito nella Tabella dei materiali.
- Rimuovere una gamba da una singola zanzara usando una pinza e posizionarla in un tubo corrispondente di una soluzione diluita del reagente di rilascio del DNA (dal passaggio 1.1.3), immergendo completamente la gamba nella soluzione. Ripeti questo passaggio con le zanzare rimanenti, pulendo la pinza con il 70% di etanolo prima di procedere a quello successivo.
- Incubare la soluzione contenente la gamba a temperatura ambiente per 2-5 minuti, quindi a 98 °C per 2 minuti e lasciarla raffreddare durante l'impostazione della reazione PCR.
NOTA: le piastre contenenti il gDNA rilasciato possono essere conservate a -20 °C e il protocollo può essere messo in pausa a questo punto. - Preparare 10 provette contenenti 10 μL di 2x PCR Master Mix, primer a una concentrazione finale di 0,5 μM e acqua di grado molecolare a un volume finale di 20 μL e trasferire 1 μL del campione diluito a ciascun tubo. Eseguire la PCR seguendo questi parametri ciclici: 98 °C 5 min, 40 cicli di 98 °C per 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s per kb; estensione finale di 72 °C per 1 min.
- Purificare i prodotti PCR con un enzima per degradare i primer PCR residui e defosforilare i dNTP in eccesso o qualsiasi kit di pulizia della colonna. Procedere con il sequenziamento dei campioni.
- Analizzare ogni elettroferogramma per la presenza di doppi picchi / basi ambigue e regolare manualmente le chiamate di base in ogni sequenza utilizzando il codice di base degenerato appropriato.
NOTA: questo passaggio deve essere eseguito prima dell'allineamento di più sequenze in quanto è comune per il software di chiamata di base selezionare il picco più prominente come chiamata di base "vera", dando la falsa impressione di un'assenza di SNP. - Eseguire un allineamento di sequenze multiple utilizzando il software di allineamento, SeqMan Pro, elencato nella Tabella dei materiali o altri software di allineamento open source, come ClustalW16 o T-Coffee17.
- Aprire il software di allineamento | clicca su Aggiungi sequenze | selezionare le sequenze desiderate e cliccare su Aggiungi | una volta scelte tutte le sequenze, clicca su Fine.
- Fate clic su Assembla (Assemble) per eseguire l'allineamento. Per aprire l'allineamento, fare clic su Contig 1 e analizzare l'allineamento e identificare gli SNP (Figura 1).
NOTA: In alternativa ai passaggi 1.1.3-1.1.6, la PCR può essere eseguita da DNA genomico isolato ottenuto da campioni di massa (derivati da >10 individui). Gli ampliconi sequenziati possono essere analizzati direttamente per la presenza di SNP che appaiono come doppi picchi nell'elettroferogramma, anche se gli SNP rari saranno più difficili da rilevare.
- Progettare 3-5 RNA a guida singola (sgRNA), evitando regioni contenenti qualsiasi SNP sopra identificato, seguendo il protocollo descritto in18.
- Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione polipeptidica.
- Progettazione del primer HRMA
- Testare la sequenza esonica per la possibile formazione di strutture secondarie durante la PCR utilizzando mFold19.
- Passare al | server Web UNAFold clicca su mFold | nel menu a discesa, fai clic su Applicazioni | Forma pieghevole del DNA.
- Immettere il nome della sequenza nella casella e incollare l'esone.
- Modificare la temperatura di piegatura a 60 °C; sulle condizioni ioniche, cambiare [Mg++] in 1,5 e su Unità passare a mM; clicca su Fold DNA.
- In Output, sotto la Struttura 1, fare clic su pdf per aprire i Grafici a struttura circolare.
- Vai a NCBI Blast - Primer Blast15 per la progettazione del primer.
- Copiare e incollare la sequenza di esoni selezionata determinata mediante sequenziamento nel passaggio 1.1 (la sequenza che contiene il numero più basso di SNP o nessun SNP) nella casella nella parte superiore della pagina.
- Utilizzare il simbolo < > per contrassegnare ed escludere sequenze che contengono SNP, il sito di destinazione e le regioni con possibile formazione di struttura secondaria.
- Selezionare la dimensione del prodotto PCR tra 80 e 150 bp e scegliere l'organismo.
NOTA: è possibile utilizzare correttamente frammenti di dimensioni maggiori (~300 bp). Tuttavia, gli ampliconi più lunghi possono ridurre la sensibilità tra le sequenze che differiscono in una o solo poche coppie di basi. - Fai clic su Ottieni primer. Selezionare 2-3 coppie di primer da testare (idealmente, i siti di primer sono ≥20-50 bp di distanza da qualsiasi sito target CRISPR).
- Testare la sequenza esonica per la possibile formazione di strutture secondarie durante la PCR utilizzando mFold19.
- Convalida del primer
- Eseguire una PCR sfumata utilizzando il gDNA di un singolo individuo.
- Preparare una miscela master e rimuovere un campione per il controllo non modello (NTC) in un tubo separato. Aggiungere il modello al mix master rimanente e aliquota in una piastra a 96 pozzetti.
- Seguire i parametri ciclici: 98 °C 30 s, 34 cicli di 98 °C per 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; estensione finale di 72 °C per 10 min.
- Generare profili di fusione termica seguendo i parametri: fase di denaturazione 95 °C per 1 min, ricottura 60 °C per 1 min, rilevamento della curva di fusione tra 75 °C e 95 °C con incrementi di 0,2 °C, con un tempo di attesa di 10 s a ciascuna temperatura.
NOTA: devono essere utilizzate solo temperature di ricottura con un singolo profilo termico di fusione.
- Eseguire una PCR sfumata utilizzando il gDNA di un singolo individuo.
- Procedere alla generazione delle linee mutanti con iniezioni di embrioni come descritto al punto 12.
2. Preparazione del DNA genomico dalle zampe di zanzara
- Separa le zanzare G1 per sesso nella fase pupale in modo che non si accoppiano prima della genotipizzazione e assicurati che le zanzare di controllo selvatiche abbinate all'età siano disponibili per essere utilizzate per riferimenti e backcross. Il sesso li separa allo stesso modo.
- Raccogliere i materiali necessari (Figura 2A) e preparare una piastra PCR a 96 pozzetti con 0,5 μL del reagente di rilascio del DNA e 20 μL di tampone di diluizione (dal kit di rilascio del gDNA) per individuo da genotipizzare (Figura 2B) e lasciarlo sul ghiaccio. Riserva due reazioni per NTC.
- Etichettare un vassoio per le fiale di zanzara (fiale di Drosophila ) in modo che ogni pozzetto sulla piastra da 96 corrisponda alla rispettiva fiala di zanzara nel vassoio.
- Anestetizzare le zanzare G1 con CO2 e metterle in una capsula di Vetro di Petri per tenerle sedate (Figura 2C,D). Anestetizzare e posizionare 8 zanzare selvatiche in una seconda capsula di Petri.
- Pulire un paio di pinzette con etanolo al 70% e rimuovere una delle zampe posteriori della zanzara (Figura 2E, F).
- Immergere la gamba nella soluzione di reagente per il rilascio del DNA, posizionare la zanzara nella fiala corrispondente e chiuderla con una spugna (Figura 2G,H).
- Pulire nuovamente le pinzette con etanolo al 70% e procedere con la rimozione della gamba dalla zanzara successiva. Ripetere i passaggi 2.5-2.7 fino al completamento della piastra a 96 pozzetti.
NOTA: È importante pulire le pinzette con etanolo al 70%. Ciò riduce al minimo la contaminazione incrociata del DNA. - Sigillare la piastra con un sigillo ottico a piastra PCR (Figura 2I) e incubare la piastra a 96 pozzetti contenente le gambe a temperatura ambiente (RT) per 2-5 minuti e poi a 98 °C per 2 minuti. Lasciare raffreddare la piastra a RT mentre si prepara la miscela PCR.
NOTA: l'intero processo richiede in genere 3-4 ore. Se le zanzare devono essere tenute nelle fiale per più tempo della durata prevista (soprattutto ≥1 giorno), posizionare un piccolo pezzo di uvetta (o fonte di zucchero e acqua) con ogni zanzara per garantire la sopravvivenza delle zanzare durante le incubazioni prolungate.
3. HRMA
- Eseguire la PCR.
- Preparare una miscela master contenente i seguenti componenti per ogni reazione: 10 μL di 2x tampone (dal kit di rilascio gDNA), 0,5 μM di ciascun primer, 1 μL di colorante EvaGreen, 0,4 μL di polimerasi (dal kit di rilascio gDNA) e completare a 19 μL con acqua di grado molecolare.
- Utilizzando un pipetto multicanale, trasferire 19 μL della miscela master in ciascun pozzetto. Trasferire 1 μL della soluzione di rilascio di DNA contenente DNA di zanzara preparata nella sezione 2 alla piastra (Figura 3A). Sigillare la piastra con una guarnizione ottica della piastra PCR.
- Eseguire la PCR seguendo i parametri ciclici: 98 °C per 5 min, 39 cicli di 98 °C per 10 s, la temperatura di ricottura scelta (72 °C) per 30 s; estensione finale 72 °C per 2 min.
- Generare profili di fusione termica seguendo i parametri: fase di denaturazione 95 °C per 1 min, ricottura 60 °C per 1 min, rilevamento della curva di fusione tra 75 °C e 95 °C con incrementi di 0,2 °C, con un tempo di attesa di 10 s a ciascuna temperatura. Vedere il materiale supplementare e la figura supplementare S1-S5 per una descrizione dettagliata della configurazione del software per l'esecuzione di HRMA utilizzando il sistema in tempo reale CFX96.
- Esaminare i profili di fusione (Figura 3B). Assegnare il controllo wild-type al cluster di riferimento.
NOTA: il software (vedere la Tabella dei materiali) normalizza automaticamente i dati e designa cluster con colori per diverse curve di fusione. - Contrassegnare i diversi cluster con i colori corrispondenti sul modello a 96 pozzetti (Figura 3C).
- Selezionare gli individui con curve di interesse, rimuoverli dai tubi e retromarciarli (Figura 3D). Nutrire con il sangue le femmine accoppiate e raccogliere le uova G2 .
4. Verifica della sequenza mediante sequenziamento Sanger
- Purificare il prodotto PCR dai pozzetti con zanzare selezionate (dalla piastra preparata nella sezione 3.1), utilizzando un enzima per degradare i primer PCR residui e defosforilare i dNTP in eccesso. In alternativa, utilizzare qualsiasi kit di pulizia delle colonne e procedere con il sequenziamento dei campioni.
NOTA: il sequenziamento diretto può essere più impegnativo quando la dimensione del prodotto PCR è piccola (≤200 bp). In questi casi, progettare primer per amplificare frammenti più grandi che comprendono il sito bersaglio (≥250 bp) e amplificare mediante PCR utilizzando il DNA nella piastra a 96 pozzetti (fase 2.2). - Analizzare e identificare gli indel utilizzando il software del visualizzatore di tracce (Figura 4). In alternativa, il software Poly Peak Parser20 può aiutare a rilevare la mutazione in individui eterozigoti.
- Visitare il sito Web Poly Peak Parser, selezionare la sequenza dagli individui mutanti nel menu Sfoglia e copiare e incollare la sequenza di riferimento sulla casella.
NOTA: l'allineamento tra l'allele alternativo e il riferimento verrà visualizzato automaticamente sul lato destro dello schermo.
- Visitare il sito Web Poly Peak Parser, selezionare la sequenza dagli individui mutanti nel menu Sfoglia e copiare e incollare la sequenza di riferimento sulla casella.
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Representative Results
Le zanzare contenenti mutazioni nei geni AaeZIP11 (presunto trasportatore di ferro21) e myo-fem (un gene della miosina polarizzato femminile correlato ai muscoli di volo13) sono state ottenute utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, genotipizzate utilizzando HRMA e verificate in sequenza (Figura 5). La Figura 5A e la Figura 5C mostrano l'intensità di fluorescenza normalizzata dalle curve HRM da campioni mutanti AaeZIP11 e myo-fem , rispettivamente, insieme ai controlli wild-type. La Figura 4B e la Figura 4D mostrano l'ingrandimento delle curve di differenza (rispettivamente dai campioni mutanti AaeZIP11 e myo-fem ) tra i profili di fusione dei diversi cluster assegnati dal software dopo aver sottratto ogni curva dal riferimento wild-type. Gli individui mutanti eterozigoti e omozigoti AaeZIP11 sono stati collocati in cluster diversi e sono facilmente distinguibili dai controlli wild-type (Figura 5B). Anche gli individui mio-fem mutanti eterozigoti sono distinti dai controlli (Figura 5D). Si noti che in entrambi i casi erano presenti due cluster all'interno dei controlli wild-type, molto probabilmente a causa della presenza di SNP nella regione di destinazione (Figura 5), evidenziando la necessità di utilizzare più campioni di controllo per evitare di classificare i controlli come mutanti quando gli SNP non possono essere evitati.
La Figura 4A mostra l'analisi di sequenza del mutante AaeZIP11 . L'elettroferogramma dei mutanti eterozigoti AaeZIP11 indica la posizione nucleotidica in cui si è verificato l'indel. Ciò è rappresentato da uno spostamento da picchi singoli a doppi poiché le posizioni polimorfiche mostreranno entrambi i nucleotidi contemporaneamente (Figura 4A). Il numero di coppie di basi cancellate o inserite è stato calcolato contando i singoli picchi alla fine della corsa (Figura 4B) poiché uno dei filamenti di DNA sarà più corto o più lungo dell'altro in base al numero di coppie di basi cancellate o inserite, rispettivamente. Si raccomanda di utilizzare il gDNA verificato in sequenza dai mutanti come riferimento per l'identificazione degli eterozigoti per aiutare con le analisi HRMA per le generazioni successive. L'assegnazione manuale per le curve può essere necessaria quando curve simili vengono assegnate automaticamente a cluster diversi. Questo può essere fatto confrontando le curve spostate di temperatura e le curve di differenza. Potrebbe essere necessaria la regolazione manuale del software per assegnare correttamente i campioni ai cluster. I risultati hrma di AaeZIP11 e di un mutante chiamato Aeflightin mostrano che erano necessarie analisi di singoli campioni per classificare con successo eterozigoti, omozigoti e trans-eterozigoti. Inizialmente, l'assegnazione automatica del cluster dal software non poteva fare una distinzione adeguata tra i gruppi (Figura 6A, Figura 6C, Figura 6E e Figura 6G). Ogni campione è stato quindi analizzato individualmente e assegnato ai gruppi corretti in base alla somiglianza con campioni di riferimento di eterozigoti, omozigoti e trans-eterozigoti (precedentemente verificati mediante sequenziamento) (Figura 6B, Figura 6D, Figura 6F e Figura 6H).
Figura 1: Identificazione SNP. Rappresentazione schematica dell'allineamento di sequenze multiple del frammento AaeZIP11 da wild-type. In rosso ci sono gli SNP, e in verde ci sono i frammenti privi di SNP; questa regione priva di SNP è suggerita per la progettazione di sgRNA e primer. Abbreviazioni: SNP = polimorfismo a singolo nucleotide; sgRNA = RNA a guida singola; LVP = ceppo di Liverpool. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura sperimentale per ottenere DNA genomico dalle zampe di zanzara per HRMA. (A) Materiali per ottenere DNA genomico tra cui pipette, punte, piastra PCR, sigillo ottico, serbatoio, tampone di diluizione e soluzione di rilascio del DNA. (B) Preparazione della piastra PCR contenente reagente di rilascio del DNA e tampone di diluizione. (C) Anestesia delle zanzare con CO2. (D) Pulire le pinzette con etanolo al 70% per evitare la contaminazione tra i campioni. (E) Configurazione sperimentale che include pinzette, rack per fiale di zanzare, piastra di Petri sopra un contenitore di ghiaccio con zanzare anestetizzate e la piastra PCR precedentemente preparata. (F) Rimozione della zampa della zanzara. (G) Vista zoom della zampa della zanzara immersa nella soluzione di reagente di rilascio del DNA. (H) Zanzara singola posta nel flaconcino. (I) Sigillare la piastra PCR contenente le zampe di zanzara. Abbreviazione: HRMA = analisi del fuso ad alta risoluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Procedura sperimentale per le analisi HRM. (A) Trasferimento del gDNA rilasciato su una piastra a 96 pozzetti contenente la miscela PCR. (B) Ispezione visiva delle curve di differenza. (C) Marcatura di ciascun campione sul modello a 96 pozzetti con lo stesso colore del rispettivo colore della curva di differenza. (D) Incrociare gli individui dello stesso cluster. Abbreviazioni: HRM = fusione ad alta risoluzione; gDNA = DNA genomico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sequenziamento di un mutante AaeZIP11 . (A) Allineamento nucleotidico del mutante AaeZIP11Δ56. I trattini evidenziati in giallo sono le basi eliminate. Nella casella, l'elettroferogramma passa da picchi singoli a picchi doppi, raffigurando la posizione in cui si è verificata la delezione (freccia). (B) Elettroferogramma della fine della sequenza e del passaggio da picchi doppi a picchi singoli. Si noti che il numero di singoli picchi rappresenta il numero di basi eliminate (rettangolo grigio). Le sequenze di primer sono fornite nella tabella supplementare S1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: HRMA del DNA estratto dalle zampe di zanzara. Il DNA è stato estratto da una singola gamba dalle zanzare AaeZIP11 (A e B) e myo-fem (C e D) knockout Ae. aegypti e analizzato da HRMA. A e C denotano i segnali di fluorescenza normalizzati dei campioni a valori relativi da 1,0 a 0. B e D denotano l'ingrandimento delle differenze di curva sottraendo ogni curva dal riferimento wild-type (ceppo di Liverpool). Abbreviazioni: HRMA = analisi del fuso ad alta risoluzione; LVP = ceppo di Liverpool; RFU = unità di fluorescenza relative. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella supplementare S1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempi di assegnazioni manuali di gruppo. (A-D) HRMA per mutanti Aeflightin. (A e C) Le curve di fusione (rispettivamente curve di scala lineare normalizzate e curve di differenza) vengono raggruppate automaticamente dal software di analisi della fusione di precisione. (B) Normalizzazione delle curve differenziali modificata manualmente. (D) Dopo aver alterato la normalizzazione delle curve differenziali, ogni campione è stato assegnato individualmente dalle temperature di picco nelle curve di differenza per i corrispondenti controlli positivi (campioni precedentemente sequenziati identificati da eterozigoti Δ4 e Δ5 e trans-eterozigoti Δ4Δ5), consentendo la chiara identificazione dei 3 gruppi. Le frecce rosse e marroni vengono aggiunte per evidenziare i picchi a diverse temperature. (E-H) HRMA per mutanti AaeZIP11. (E e G) Le curve di fusione vengono assegnate automaticamente dal software. (F e H) I mutanti nel secondo auto-incrocio eterozigote sono stati opportunamente assegnati ai gruppi corretti dalla somiglianza delle curve normalizzate e di differenza a riferimenti precedentemente determinati (codificati a colori in curve). Heterozygotes asg, Homozygotes asg e Trans-heterozygotes asg: curve di fusione assegnate da Precision Melt Analysis Software. Abbreviazioni: HRMA = analisi del fuso ad alta risoluzione; LVP = ceppo di Liverpool; RFU = unità di fluorescenza relative. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella supplementare S1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Materiale supplementare: Protocollo dettagliato per la configurazione di HRMA nel sistema in tempo reale CFX96 (ad esempio, Bio-rad). Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S1: Istruzioni dettagliate per l'impostazione del protocollo di ciclismo su Bio-rad CFX Manager. Vedere Materiale supplementare 2.1-2.3. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Istruzioni dettagliate per la configurazione di una piastra su Bio-rad CFX Manager. Vedere Materiale supplementare 3.1-3.4. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Istruzioni dettagliate per la configurazione di una piastra su Bio-rad CFX Manager. Vedere Materiale supplementare 3.5-3.6. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Istruzioni dettagliate per l'installazione dell'esecuzione su Bio-rad CFX Manager. Vedere Materiale supplementare 4.1. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S5: Istruzioni dettagliate per l'analisi HRMA su Bio-rad CFX Manager. Vedere Materiale supplementare 5.1-5.3. Abbreviazione: HRMA = analisi del fuso ad alta risoluzione. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Elenco dei primer. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'analisi del fuso ad alta risoluzione offre una soluzione semplice e veloce per l'identificazione di indels generati dalla tecnologia CRISPR/Cas9 nella zanzara vettore Ae. aegypti. Fornisce flessibilità, consentendo la genotipizzazione delle zanzare mutate per una vasta gamma di geni dal muscolo di volo al metabolismo del ferro e altro ancora13,14. L'HRMA può essere eseguito in poche ore dalla raccolta dei campioni alle analisi finali. È necessario ulteriore tempo per la progettazione del primer e dipenderà anche dal tempo necessario per ricevere i risultati di sequenziamento necessari (per l'identificazione degli SNP), dalle analisi di sequenza e dall'ordinamento del primer.
Il protocollo qui presentato descrive in dettaglio i metodi passo-passo per analisi di successo. Uno dei passaggi più critici in questo processo è la corretta progettazione dei primer. L'HRMA è sufficientemente sensibile che la presenza anche di un singolo SNP all'interno del frammento amplificato può comportare una forte curva di differenza che potrebbe essere interpretata erroneamente come una mutazione. Il sequenziamento di campioni di colonie di laboratorio prima della mutagenesi CRISPR consente di rilevare ed evitare regioni ricche di SNP durante la progettazione del bersaglio; i primer HRMA aiuteranno a prevenire questo problema. La progettazione di primer per piccoli ampliconi (70-100 bp) può anche migliorare la sensibilità e la riproducibilità dell'esperimento in quanto frammenti più grandi possono presentare diversi domini di fusione, diminuendo la possibilità di distinguere le varianti22. Un limite della tecnica è che evitare completamente gli SNP potrebbe non essere fattibile a seconda del gene; pertanto, il sequenziamento e l'ulteriore utilizzo di più individui di controllo wild-type possono aiutare le analisi.
In particolare per questo protocollo, è importante mantenere in vita le zanzare genotipizzate in modo che possano essere incrociate per la creazione di linee mutanti. Rimuovere una delle zampe di zanzara per estrarre il gDNA può essere il modo meno invasivo per raggiungere questo obiettivo; tuttavia, la quantità di gDNA recuperata da questo tessuto è minima. Il kit suggerito nella Tabella dei materiali era sufficiente per ottenere il DNA da una zampa di zanzara ed eseguire la PCR per completare l'HRMA.
HRMA può offrire una maggiore flessibilità in termini di rilevamento di un'ampia gamma di dimensioni indel, che variano da disallineamenti a base singola a coppie di basi multiple (AaeZIP11 ha avuto una delezione di 56 bp) e superando metodi come SNA o T7E1 (entrambi i saggi di scissione del mismatch enzimatico) che sono limitati a disallineamento a base singola o piccole delezioni (~ 20 bp)5, 23. Inoltre, SNA non rileva mutanti omozigoti in quanto i prodotti PCR non contengono disallineamenti. Inoltre, i risultati dell'SNA possono anche essere mascherati da polimorfismi allelici presenti in natura quando i prodotti PCR trattati con nucleasi hanno una lunghezza simile agli alleli mutanti. Nessuna di queste limitazioni è applicabile a HRMA. In definitiva, il sequenziamento è necessario per identificare la sequenza di DNA mutante. Tuttavia, una volta che una mutazione in questione è nota, l'HRMA utilizzato per l'identificazione di individui mutanti è molto più veloce del sequenziamento diretto. Questo metodo conserva campioni preziosi (più zanzare sopravviveranno, meno devono aspettare i risultati del loro genotipo) e riduce la necessità di sequenziamento di un gran numero di campioni, abbassando il costo totale dell'esperimento.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Tutte le figure sono state create con Biorender.com sotto licenza alla Texas A & M University. Questo lavoro è stato supportato da fondi del National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research nell'ambito del programma Insect Vectored Disease Grant e USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1018401.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
- WHO.
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
