Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Brug af 2-fotonmikroskopi til at kvantificere virkningerne af kronisk ensidig ureteral obstruktion på glomerulære processer

Published: March 4, 2022 doi: 10.3791/63329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Nephrology, Indiana University School of Medicine

Summary

Her præsenterer vi en protokol ved hjælp af 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter rotter med overfladeglomeruli for at kvantificere virkningerne af langvarig ureteral obstruktion på glomerulær dynamik og funktion.

Abstract

Anvendelse af nye mikroskopimetoder til egnede dyresygdomsmodeller for at udforske nyrernes dynamiske fysiologi er fortsat en udfordring. Rotter med overfladeglomeruli giver en unik mulighed for at undersøge fysiologiske og patofysiologiske processer ved hjælp af intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantificering af glomerulær kapillær blodgennemstrømning og vasokonstriktion og dilatation som reaktion på lægemidler, permeabilitet og betændelse er blot nogle af de processer, der kan studeres. Derudover giver transgene rotter, dvs. podocytter mærket med fluorescerende farvestoffer og andre molekylære biomarkørmetoder, øget opløsning til direkte overvågning og kvantificering af protein-proteininteraktioner og virkningerne af specifikke molekylære ændringer.

Hos mus, der mangler overfladeglomeruli efter fire uger, er ensidig ureteral obstruktion (UUO) i flere uger blevet brugt til at inducere overfladeglomeruli. Da denne induktionsmodel ikke tillader baselinestudier, kvantificerede vi virkningerne af UUO på glomerulære processer i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) rotter, som har overfladeglomeruli under fysiologiske forhold. UUO-modellen i fem uger eller mere inducerede signifikante ændringer i brutto nyremorfologi, den peritubulære og glomerulære mikrovaskulatur samt strukturen og funktionen af rørformet epitel. Glomerulær og peritubulær rød blodlegeme (RBC) flow faldt signifikant (p < 0,01), sandsynligvis på grund af den signifikante stigning i overholdelsen af hvide blodlegemer (WBC'er) inden for glomerulære og peritubulære kapillærer. Den glomerulære sigtningskoefficient for albumin steg fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWF'er til 0,045 ± 0,05 i 5 uger gamle UUO MWF-rotter. Tolv ugers UUO resulterede i yderligere stigninger i overfladeglomerulær densitet og glomerulær sigtningskoefficient (GSC) for albumin. Fluorescerende albumin filtreret over glomeruli blev ikke reabsorberet af de proksimale tubuli. Disse data tyder på, at brug af UUO til at inducere overfladeglomeruli begrænser evnen til at studere og fortolke normale glomerulære processer og sygdomsændringer.

Introduction

Forståelse af glomerulære processer, især podocytbiologi, har været et mål i over 50 år. München Wistar rotter med overfladeglomeruli har spillet en central rolle i disse undersøgelser, herunder mikropunkturundersøgelser, for at forstå mange aspekter af fysiologiske og patologiske processer 1,2,3. Udnyttelsen af mikroskopi til at studere glomerulære komponenter intravitalt var begrænset på grund af virkningerne af fototoksicitet indtil fremkomsten af 2-fotonmikroskopi, der minimerede denne toksiske eksponering og øgede penetrationsdybden 1,2. Sammen med hurtige fremskridt inden for computerhardware og -software har dette givet mulighed for tredimensionelle (3D) og firedimensionelle (tids)studier i timevis i en enkelt indstilling 1,4,5.

Kvantificeringen af glomerulær kapillær blodgennemstrømning, vasokonstriktion og dilatation som reaktion på lægemidler, permeabilitet og virkningerne af ladning på permeabilitet og inflammation er blot nogle af de glomerulære processer, der er blevet undersøgt. Derudover kan S1-segmentet af det proksimale rør identificeres, og forskellene i opførsel af S1 og S2 rørformet epitel kan kvantificeres 1,4. Undersøgelser på mus, især med den universelle tilgængelighed af musetransgene faciliteter, har ført til hurtige fremskridt i forståelsen af molekylærbiologien af glomerulære sygdomsprocesser. Individuelle proteiner er ansvarlige for glomerulær dysfunktion i knockout-undersøgelser, især med hensyn til proteinuri 6,7,8. Anvendelsen af musemodeller til glomerulære billeddannelsesundersøgelser har imidlertid været begrænset, da glomeruli er mere end 100 μm under overfladen i de mange undersøgte stammer9.

Dette har fået efterforskere til at udvikle og bruge musemodeller, hvilket resulterer i overfladeglomeruli, der kan studeres. Den mest almindelige model er brugen af komplet UUO10,11,12. I slutningen af den forlængede UUO-periode er der talrige overfladeglomeruli i musenyrer, der kan og er blevet undersøgt13,14. Der har ikke været nogen baseline- eller kontrolundersøgelse i disse musestudier for at bestemme virkningerne af langvarig UUO på glomerulær biologi. Da dette er en alvorlig og langvarig skadesmodel, der resulterer i hurtig fibrose og kortikal ødelæggelse10,11,12, antog vi, at der ville være virkninger på glomerulære processer og funktion. For at besvare dette spørgsmål blev München Wistar Fromter (MWF) rotter med overfladeglomeruli brugt til at studere kontrol/baseline parametre, og baseline fundet blev sammenlignet med glomerulære undersøgelser i MWF rotter efter fem ugers UUO. Vi undersøgte også Sprague Dawley (SD) rotter, der ikke har overfladeglomeruli efter UUO. Resultaterne indikerer, at 5 ugers UUO i MWF- og SD-rotter faktisk øger antallet af overfladeglomeruli. Disse var imidlertid unormale glomeruli med markante ændringer i glomerulær blodgennemstrømning, inflammation og makromolekylepermeabilitet og størrelse.

Protocol

Alle eksperimenter fulgte vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved Indiana University School of Medicine.

1. Forberedelse af München Wistar Frömter eller SD rotte til UUO kirurgi

  1. Anæstetiser rotten ved hjælp af isofluoran (5% induktion, 1,5-2,5% vedligeholdelse), barber, vask og desinficer derefter det kirurgiske område flere gange i en cirkulær bevægelse med både en jodbaseret eller chlorhexidinbaseret skrubbe og alkohol. Anvend langtidsvirkende / langsom frigivelse smertestillende middel til smertebehandling i henhold til de institutionelle IACUC-retningslinjer.
  2. Lav et snit langs midterlinjen ved hjælp af en skalpel; Find den venstre nyre og frigør den fra de omgivende peritoneale organer.
  3. Find omhyggeligt nyrepediklen, som omfatter nyrearterien, nyrevenen og urinlederen. Adskil urinlederen fra de andre strukturer, og tag forholdsregler for ikke at beskadige den sarte struktur.
  4. Brug fine tang til forsigtigt at løkke en 3-0 sutur rundt om urinlederen og binde den af, og pas på ikke at rive den. Gentag denne procedure et par millimeter på hver side af den første knude for at binde en anden knude og sikre fuldstændig obstruktion.
  5. Når proceduren er afsluttet, skal du forsigtigt lukke de successive muskellag. Før du lukker det sidste lag, tilsættes 2 ml varmt, sterilt 0,9% saltvand i maven, før du lukker det helt. Luk den ydre hud med kirurgiske hæfteklammer.
  6. Anvend langtidsvirkende / langsom frigivelse smertestillende middel til smertebehandling og observer genopretning nøje i henhold til de institutionelle IACUC-retningslinjer. Overvåg regelmæssigt derefter og forbered dig på billeddannelse i slutningen af den femte uge.

2. Syntese af Texas Red rotte serumalbumin (TR-RSA)

  1. Der afvejes 100 mg rotteserumalbumin, og det opløses i 6,67 ml 0,1 M natriumbicarbonatbuffer ved pH 8,4 i et konisk rør på 50 ml.
  2. Til et hætteglas med 5 mg Texas Red-X-succinimidylester tilsættes 100 μL dimethylformamid (DMF, høj kvalitet) og hvirvel, indtil alt farvestof er opløst.
  3. Placer rotteserumalbuminopløsningen på en hvirvel ved en lav/medium indstilling, så opløsningsvolumenet roterer et godt stykke under toppen af det åbne rør.
  4. Tilsæt det opløste farvestof, mens røret hvirvles.
  5. Tag det 50 ml koniske rør, pakk det ind i folie, læg røret på enhver vippe eller rulle, og omrør langsomt i 1 time ved stuetemperatur (RT).
  6. I en 5 L spand på 0,9% NaCl med en omrøringsstang under blid omrøring vådes membranerne i en passende 50 kDa molekylvægtsafskåret dialysator (en membran med klip, lukkede membranrør eller dialysekassetter er alle egnede).
  7. Læg TR-RSA-opløsningen i membransystemet, og fastgør den til de flotationstilbehør, der typisk følger med systemet. Anbring 5 L beholderen med 0,9% saltopløsning/TR-RSA natten over ved 4 °C (i et kølerum) med skånsom omrøring på en omrøringsplade. Skift dialyseopløsningen mindst tre gange i løbet af de næste 36 timer.
  8. Hævelse af membranen vil øge volumenet af den nu klare TR-RSA-opløsning. Del de oprindelige 100 mg med volumenet for at opnå en omtrentlig koncentration: farvestof:proteinforholdet vil være 1:1. Aliquot i passende mængder og fryser til langtidsopbevaring.

3. Forberedelse til 2-foton intravital billeddannelse på et omvendt mikroskop

  1. Fjern dækslet på en 50 mm dækslipbundplade (med 40 mm dækslipdiameter) og læg 8 stykker autoklavetape på den indvendige bund langs kanten. Lav et pyramideformet, tomt vindue ved hjælp af 4 stykker pr. side for at give den udvendige nyre mulighed for at passe tæt i dette rum, samtidig med at kontakten perifert med autoklavebåndet opretholdes, hvilket hjælper med at minimere bevægelse. Juster afstanden i henhold til rottens størrelse for at sikre den bedste kontakt med nyrerne.
  2. Placer 1 termisk pude på hver side af 50 mm dækslip-bundskålen. Sørg for, at varmepuden dækker scenen.
  3. Brug et 40x vandfordybelsesmål ved 0,75x zoom og 1,5x zoom til at generere henholdsvis 30x og 60x billeder, hvilket giver mulighed for billeder med lavere og højere forstørrelse. Tilsæt om nødvendigt vand til målet ved hjælp af en 1 ml sprøjte med et langt stykke PE-200-slange, der kan nå toppen af målet i en nedadgående vinkel for at forhindre svejning af vanddråben ned i slangen.
  4. Brug 2% lasertransmissivitet med blå, grønne og røde detektorer indstillet til forudbestemte niveauer for at sikre konsistens i billederne mellem undersøgelser. Indstil excitationsbølgelængden til 800 nm på den refererede laser (se materialetabellen), som effektivt vil begejstre alle de fluorophorer, der anvendes i denne undersøgelse.
    1. Brug eksterne (ikke-descannede) detektorer til at indsamle blå emissioner ved hjælp af et fotomultiplierrør (PMT) (420-490 nm, forstærkning 950).
    2. Brug en Hyd-detektor til at fange grønne emissioner (500-550 nm, få 100).
    3. Brug en Hyd-detektor til at fange røde emissioner (590-660 nm, forstærkning 200).
    4. Juster forskydningen i PMT (blå emissioner), så kun få pixels i de tomme vævsområder har en værdi på nul.
      BEMÆRK: HyD-detektorerne til de grønne og røde emissioner har automatisk offsetjustering; kun gevinsten kan indstilles.
    5. Indstil bitdybden til 12-bit for at give billederne en intensitetsskala på 4.096 mellem sort og hvid.
      BEMÆRK: Det er nødvendigt at indstille de nedre grænser for detektorerne (forskudt i PMT) for ikke at udelukke disse værdier for at sikre indsamling af lavintensitetsemissioner inden for Bowmans rum. Hvis følsomhedsindstillingen er for lav, vil de visuelle advarselsmarkører indikere dette; Disse værdier får en intensitetsværdi på nul.
  5. Der fortyndes ca. 6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albumin til et samlet volumen på 1 ml, opløsningen lægges i en 1 ml sprøjte, og der anbringes på det indbyggede kateter i trin 4.1 efter infusion af Hoechst 33342 i trin 9.1.

4. Kirurgisk forberedelse til intravital 2-fotonbilleddannelse

  1. Placer den præbedøvede rotte med en indbygget venøs adgangslinje (lårben eller jugular) på sin side med den barberede venstre flanke opad fladt og lige på bordet. Sørg for, at de forreste poter rører hinanden, ligesom de bageste poter.
  2. Palperer forsigtigt venstre flanke lige under ribbenene for at føle for nyrerne for at bestemme den naturlige position i maven. Tegn om nødvendigt en linje ved hjælp af en permanent markør langs det barberede område, der skærer nyrecentret i en næse-til-hale orientering.
  3. Brug et par tandpincet til at gribe fat i huden og løfte den opad for at lette klemning af den permanente markørlinje med et par hæmostater for at knuse den underliggende vaskulatur og forhindre blødning, når du laver snittet med et par kirurgisk saks. Gentag dette for det tynde ydre muskellag for at minimere blødning.
  4. For at gøre det endelige snit af det tynde indre abdominale muskellag skal du genpalpere nyrerne for at estimere størrelse og position. Løft forsigtigt det indre muskellag med et par tang og knus en linje, der skærer huden over nyrerne med hæmostaterne, der er ca. 1/3af nyrernes anslåede størrelse.
  5. Vedligeholdelse af grebet om muskellaget med tangen, lav det endelige snit.
    BEMÆRK: Det er bedre at lave et mindre snit og udvide efter behov end at gøre det for stort, hvilket kræver delvis lukning med en sutur.
  6. Tag forsigtigt fat i nyrerne ved det omgivende fedt. Brug begge hænder med tang i hver hånd til at gribe fat i fedtet ved nyrernes nederste pol ved hjælp af en hånd-over-hånd-teknik til at gribe og holde nyrefedtet og arbejde nedad.
  7. At have et fast greb om fedtet ved nyrernes nederste pol med den ene hånd, træk forsigtigt fedtet og om nødvendigt meget forsigtigt klemme nyren gennem snittet. Hvis nyren ikke passerer let igennem, skal du udvide snittet.

5. Placering af rotten til billeddannelse

  1. Placer forsigtigt den udsatte nyre mod kanten af skålen med en let rotation, så mavesiden af nyren kommer i kontakt med dækslippet, og dorsalsiden vender væk fra kanten.
  2. For yderligere at minimere bevægelse skal du tage to sterile 2 x 2 gasbind, fugte dem med saltvand og pakke dem mod dorsalsiden af nyrerne, hvilket forstærker kontakten mellem nyrens maveside til kanten.
  3. Se gennem mikroskopet okularet under epifluorescensbelysning ved hjælp af en dual-pass Rhodamin / FITC-terning. Hvis der registreres bevægelse, skal du foretage mindre justeringer af positionen og justere gasbindet omhyggeligt, og sørg for, at det ikke skubber under nyrerne. For yderligere at reducere bevægelsen skal du rulle rotten lidt over, så brystkassen er længere væk fra fadet.

6. Billedoptagelse til kvantitativ analyse

  1. Scan overfladen af nyrerne ved hjælp af epifluorescensbelysning (trin 5.3) og marker glomeruli position (er) ved hjælp af den software, der er forbundet med den motoriserede trinstyring (et træk ved moderne systemer).
  2. For hver farvekanal under 2-fotonbelysning skal du tage et lavt 3D-volumen af den øverste del af hver markeret glomerulus, som vil tjene som baggrundsbilleder. Brug en pseudofarvepalet i visningsfunktionen i billedbehandlingssoftwaren for bedre at visualisere de svage intensiteter af baggrundsfluorescensen af de glomerulære kapillærsløjfer.
  3. Brug et overfladisk blodkar som fokuspunkt og tilfør langsomt det fluorescerende albumin, hvilket giver tid til at observere fluorescensens stigning og fald på grund af systemisk fordeling. Tilsæt nok TR-RSA til at opnå en intensitet i de peritubulære vaskulatur- og kapillærsløjfer, der er lige under mætning.
    BEMÆRK: Der er typisk en forsinkelse på 5 s mellem infusionen af materiale og dets udseende i blodbanen, når nyreperfusion er normal.
  4. Vent ca. 10 minutter, før du henter 3D-diskenheder (1 μm intervaller) for alle markerede og afbildede glomeruli fra trin 6.2.
    BEMÆRK: Simonsens München Wistar-rotter har færre overfladeglomeruli. Men da Frömter-stammen af MW-rotter har et større antal overfladeglomeruli, kan op til 10 glomeruli ofte afbildes.
  5. Aflive rotten via en overdosis isofluran ved undersøgelsens afslutning. Udfør en dobbelt pneumothoracotamy for at sikre eutanasi.

7. Beregning af glomerulær permeabilitet

  1. Brug billedvisningssoftwaren, der er forbundet med mikroskopsystemet, til at eksportere billederne til 12-bit rå billeder til behandling og analyse.
  2. Indlæs baggrunds 3D-volumener og det rå 3D-volumen, der indeholder det cirkulerende fluorescerende albumin. Find brændplanet i 3D-volumenet med den klareste overfladiske kapillærsløjfe i glomeruli med plads nok til kanten af den omgivende Bowmans kapsel.
  3. Brug visuelle landemærker til at finde det samme fokusplan, der findes i baggrundsvolumenet. Vælg et område i kapillærsløjfen og et inden for Bowmans rum, der noterer gennemsnitsintensitetsværdierne for hver enkelt. Brug disse intensitetsværdier som baggrundsværdier.
  4. Skitser et område (mindst 20 x 20 pixels i areal) inden for Bowmans rum i det albuminholdige billede, og noter intensitetslæsningen (vælg et område, der ikke støder op til en kapillærsløjfe eller Bowmans kapsel for at sikre den reneste måling af Bowmans rumintensiteter). Flyt det tegnede område over to andre regioner for at tage en gennemsnitsværdi for den gennemsnitlige intensitet i Bowman's Space.
  5. Vælg den lyseste plasmafluorescerende intensitet inden for kapillærsløjfesektionen, og cirkel denne region. Brug tærskelfunktionen til at fremhæve de lyse værdier (normalt placeret ved kanterne af kapillærsløjfevæggene), undgå cirkulerende RBC-skygger og registrere værdien.
    BEMÆRK: Da faktorer i blodet vil forårsage en undervurdering af plasmafluorescensniveauer, er det vigtigt at vælge de lyseste områder.
  6. Indtast værdierne i et regneark for at beregne GSR ved hjælp af Eq (1):
    GSR = Equation 1 (1)

8. Beregning af røde blodlegemer i overfladeglomerulære kapillærsløjfer og nyrevaskulatur ved hjælp af en linescan funktion

  1. Find en passende beholder (enten en kapillærsløjfe eller en peritubulær beholder). Da linecan-funktionen i den refererede billedoptagelsessoftware (se materialetabellen) kræver, at fartøjet er vinkelret, skal du dreje billedet ved hjælp af rotationsfunktionen .
  2. Når fartøjet er roteret og ligger fladt, skal du vælge XT-funktionen i anskaffelsesmenuen . Konfigureret til at scanne 4.000 linjer. Linjen på tværs af det fartøj, der skal undersøges Sørg for, at brændplanet har den maksimale diameter af det segment, der skal afbildes.
  3. Venstreklik på det farvekompositte billede, og vælg Tag snapshot for at generere et referencebillede af det område, hvor linecan blev taget. Klik straks på Start-knappen for at fange skibets linjer.
  4. For at bestemme RBC-strømningshastigheden skal du importere linescans til billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen). Åbn dialogboksen Vis områdestatistik under rullemenuen Måling . Vælg værktøjet til tegning af en enkelt linje, og tegn en linje, der matcher hældningen af RBC-skyggerne. Bemærk bredde- og højdeværdierne.
    BEMÆRK: De pixelværdier, der opnås for bredden, svarer til afstanden; Pixels for højde svarer til tiden.
  5. Brug følgende formel (Eq (2)) til at beregne hastighed.
    RBC strømningshastighed i μm/s = Equation 2 (2)
    BEMÆRK: Dette svarer til anskaffelsesparametre ved 60x forstørrelse og en 400 Hz scanningshastighed med det refererede mikroskop (se materialetabellen).
    1. Lav mindst fem beregninger og gennemsnit dem for at rapportere hastigheden for hver linjekan.
      BEMÆRK: Disse parametre afhænger af mikroskopsystemets pixeldimension og anskaffelseshastighed.

9. Beregning af WBC-okklusion i glomerulære kapillærsløjfer

  1. Hoechst 33342 nuklear plet (ved ~8 μg/kg rottevægt) administreres via en indbygget venøs adgangslinje for at identificere WBC'er, der er anbragt i kapillærsløjferne.
    BEMÆRK: Den anvendelige dybde vil være begrænset på grund af fotonspredning og absorption af hæmoglobin, især for blå emissioner med kortere bølgelængde.
  2. Centrer en glomerulus i billeddannelsesfeltet, og tag et 3D-datasæt, der starter ved den glomerulære overflade, og afslut dataene mindst 30 til 35 μm. Brug en trinstørrelse på 1 μm i Z-retningen.
  3. Identificer WBC'er ved at sammenligne den blå Hoechst-kanal med Texas Red albumin-kanalen; se efter udelukkelse af rødt farvestof i kapillærsløjfen og en tilsvarende nuklear plet for positivt at identificere WBC'erne. Rapporter værdierne som forekomst/10 optiske sektioner fra toppen af glomerulus, taget med 1 μm intervaller.

10. Scoring af tilstedeværelsen af Rouleaux-formationer i overfladeglomeruli

  1. Følg de samme anvisninger for trin 9.3, og anskaf et 3D-datasæt. Se efter Rouleaux-formationer, der vises som RBC'er stablet i pakker, der modstår dissociation, når de bevæger sig langs kapillærsløjferne. Brug en rød fluorophore til bedre visualisering af struktur på større dybder på grund af mindre fotonspredning for de længere bølgelængde røde emissioner. Rapporter værdierne som forekomst/25 optiske sektioner fra toppen af glomerulus, taget med 1 μm intervaller.

11. Isolering af glomeruli

  1. Isoler tre grupper af glomeruli fra friske nyrer ved hjælp af en standard sigtningsteknik, der resulterer i tæt på 90% renhed af rotte glomeruli15.
    1. Placer nyrebarken i koldfosfatbufferet saltvand (PBS) og hak den ved hjælp af flere fine sakse eller barberblade.
    2. Tilsæt hakket væv til en 100 μm sterilcellesi og skub det forsigtigt igennem ved hjælp af et 5 ml sprøjtestempel og 50-100 ml koldt PBS.
      BEMÆRK: De fleste af rørene bevares, mens glomeruli passerer igennem.
    3. Anbring den berigede glomerulifraktion på et 70 μm filter og vask dem grundigt med kold PBS. Vask filteret med 100-200 ml kold PBS for at fjerne de fleste af de resterende rør.
    4. Glomeruli opsamles fra filteret ved hjælp af 1-2 ml kold PBS, centrifuge (10.000 × g, 2 min, 4 °C) og snap-frys dem i flydende nitrogen indtil RNA-isolering.
      BEMÆRK: Glomerulær renhed bestemt ved fasekontrastmikroskopi er >90%, og udbyttet er ca. 10 mg fra 2 nyrer.

12. Glomerulær RNA-isolering

  1. Homogeniser den frosne glomeruli-pellet ved hjælp af RNA-isolationsreagenset ved at tilsætte 400 μL af reagenset og bryde pelleten op ved hjælp af en 200 μL pipetspids efterfulgt af kort hvirvel og 5 minutters inkubation ved RT16.
  2. Tilsæt 40 μL 1-brom-3-chlorpropan (BCP), hvirvel i 15 s, og hold ved RT i 15 min.
  3. Centrifuge ved 12.000 × g, 15 min, 4 °C. Fjern det vandige lag, fortynd det nederste lag med et tilsvarende volumen på 70% ethanol, og læg det direkte på en centrifugeringskolonne (se materialetabellen).
  4. Efter vasken, der hver består af tilsætning af den respektive opløsning til kolonnen efterfulgt af centrifugering ved 12.000 x g, 15 s, 26 °C [3 i alt, første 2 med 500 μL RPE (proprietær mild vaskebuffer med ethanol for at fjerne spor af salte, 3. vask med 500 μL 80% EtOH], elueres RNA'et ved tilsætning af 15 μLH2 O og centrifuge, hvad angår vaskene. Kontroller koncentrationen og renheden af RNA'et, og transporter RNA-prøverne til kernefaciliteten til nanostringanalyse17,18.
    BEMÆRK: Det samlede RNA-udbytte er ca. 1-2 μg. Her indeholdt de 24 prøver 200 ng RNA ved 30 ng/μL.

13. Nanostring analyse

BEMÆRK: Nanostring-teknologi er baseret på digital detektion og direkte molekylær stregkodning af målmolekyler, der bruger farvekodede sondepar. Capture-sonden bærer en biotindel i 3'-enden, og Reporter-sonden bærer signalet i sin 5'-ende.

  1. Send nanostring-gensondeparrene og CodeSets til Michigan State's Genomic Core Facility og brug som anvist af NanoString.
    BEMÆRK: Der er seks positioner til farvekoderne, og hver position kan være en af fire farver, hvilket muliggør en stor mangfoldighed af tags, der hver især kan løses individuelt og identificeres under dataindsamling.
  2. Få de data, der er indsamlet af Genomic Core-facilitetspersonalet ved hjælp af den proprietære Nanostring nCounter Digital-analysator, som indsamler synsfelter ved hjælp af et mikroskopmål og CCD-kamera og tabulerer og viser stregkodetællingerne.
  3. Importer de rå data til Nanostrings nSolver-software til analyse. Normaliser dataene normaliseret ved hjælp af deres standardindstillinger, og sammenlign data mellem grupper som beskrevet i deres manual.
    BEMÆRK: Målet var at overvåge genændringer, der tidligere viste sig at være ændret i kortikalt væv fra en UUO model19, nyresygdom 17,20,21,22,23,24,25,26. I alt 126 gener, herunder de anbefalede positive og negative kontroller, blev analyseret i hver glomeruli-gruppe (CONT, SHAM og UUO).

Representative Results

Tre grupper af glomeruli blev isoleret ved hjælp af en standard sigtningsteknik, der resulterer i tæt på 90% renhed af rotte glomeruli15. Den første glomeruli-gruppe var fra venstre nyre af SD-rotter, der gennemgik en venstre nyreurinstofklemme i 5 uger, UUO (5 mænd, 3 kvinder). Den anden glomeruligruppe blev isoleret fra den kontralaterale kontrolnyre fra den samme rotte, CONT (5 hanner, 3 hunner). Den tredje gruppe af glomeruli blev isoleret fra SD-rotter, der gennemgik SHAM-operation, og venstre nyre blev brugt til glomeruli-isolering efter 5 uger, SHAM (4 mænd, 4 kvinder).

Morfologiske ændringer
Eksternalisering af den blokerede nyre til billeddannelse afslørede en groft forstørret nyre, cirka fire gange den normale størrelse, med tynde epitel synlige gennem det væskefyldte nyreinteriør. Gennem et 20x mål ved hjælp af epifluorescensbelysning og en FITC / Rhodamin dual-pass terning var den mest tydelige ændring udtyndingen af det rørformede epitel og den ensartede sammenbrud af rørformede lumen langs hele den rørformede længde. Histologien er velbeskrevet og er alvorlig med en uges UUO10,11,12. Antallet af glomeruli, der er synlige på overfladen i MWF- og SD-rotter, steg efter fem ugers ensidig ureterobstruktion. Figur 1A viser den metode, der blev brugt til at oprette UUO-modellen. Den højre nyre er uberørt og giver en tilstrækkelig glomerulær filtreringshastighed for rotten. Antallet af glomeruli pr. felt ved hjælp af et 20x mål (363 μm x 363 μm) blev talt og vist i en graf i figur 1B. Antallet af overfladeglomeruli hos MWF-rotter steg fra 1,08 ± 0,11/mark hos ubehandlede rotter til 2,97 ± 0,65/mark i den fem uger lange UUO-gruppe. SD-rotter gik fra ikke at have nogen overfladeglomeruli til 2,02 ± 0,37 / felt efter 5 ugers UUO.

Intravital 2-fotonbilleder blev taget af disse rotter efter injektion med TR-RSA (rød), en 10 kDa Cascade Blue dextran (10 kDa-CB) og Hoechst 33342 for at mærke kernerne (cyan). Disse er vist for normale MWF-rotter (figur 1C), MWF-rotter efter fem ugers UUO (figur 1D) og SD-rotter efter fem ugers UUO (figur 1E). Disse billeder fremhæver dramatiske ændringer, der forekommer i det rørformede epitel. Proksimale tubulilysosomer, som normalt er små punkterede orangefarvede akkumuleringer i ubehandlede MWF- og SD-rotter, bliver store enestående vakuolære strukturer, der fylder størstedelen af den krympede rørformede celle. Som skitseret af TR-RSA-albuminet syntes vaskulaturen rettet og i mange kar, blottet for flydende RBC'er, der kun viste streaming plasma. Fiksering af nyrerne afslørede, at cortex var tyndet ud i en fibrøs hud, der ikke var tykkere end en millimeter. Disse observationer stemmer overens med tidlig litteratur ved hjælp af denne model 3,10,11,12.

Ændringer i renal vaskulær dynamik og glomerulær permeabilitet
Renal blodgennemstrømning blev signifikant reduceret i både de fem ugers UUO MWF- og SD-grupper sammenlignet med ubehandlede rotter (figur 2). Sham-opererede MWF-rotter havde en peritubulær RBC-strømningshastighed på 885 ± 25 μm/s. Peritubulært RBC-flow i fem ugers UUO MWF- og SD-rotter faldt til henholdsvis 250 ± 100 μm/s og 200 ± 125 μm/s. Disse værdier blev beregnet ved at indsamle linjescanninger på tværs af peritubulære fartøjer for at beregne RBC-hastighed. Figur 2D viser en graf over disse data.

RBC-hastigheden inden for de glomerulære kapillærsløjfer blev signifikant reduceret i de fem ugers UUO MWF- og SD-rotter sammenlignet med ubehandlet MWF (figur 3). I mange tilfælde viste glomeruli sig at have kapillærsløjfer helt blottet for flydende RBC'er. Kapillærsløjfe RBC-strømningshastigheder var henholdsvis 1.405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ± og 190 ± 200 μm / s eller ubehandlede MWF, fem ugers UUO MWF og fem ugers UUO SD-rotter (figur 3D). Inden for kapillærsløjferne i de fem ugers UUO-grupper afslørede den træge strøm af RBC'erne tilstedeværelsen af vedhængende WBC'er, der enten bremsede strømmen eller blokerede den, med kun plasmastrøm visualiseret nedstrøms fra den delvise eller totale obstruktion. For at kvantificere denne observation blev antallet af vedhæftede WBC'er, der blev fundet i et 3D-volumen, talt og derefter normaliseret til forekomst pr. 10 μm 3D-volumendybde. Strukturen af de klæbede hvide blodlegemer kunne skelnes ved hjælp af cyan nukleart farvestoffluorescens fra Hoechst 33342. Desværre begrænsede den større fotonspredning af blåemitterende lys pålidelig identifikation af WBC'er ved deres kerner til de øverste 10 optiske sektioner fra toppen, taget ved 1μm trin med glomerulært volumen. Ubehandlede MWF-rotter havde mindre end 0,125 ± 0,05 WBC'er / 10 optiske sektioner fra toppen, taget ved 1 μm trinvolumen, mens dette tal steg til 1,5 ± 0,5 og 3,25 ± 0,7 i henholdsvis 5-ugers UUO MWF og 5-ugers UUO SD-rotter (figur 3E).

En anden vaskulær ændring, der også kan forklare reduceret RBC-flow i de 5-ugers UUO-grupper, var det regelmæssige udseende af Rouleaux-formationer (grupperede RBC'er, der klæbes i en "stablet mønt" -konfiguration, se indsat i figur 3F). Rouleaux-formationer flyder langsommere og kan stoppes af en vedhæftet WBC. Ubehandlede WMF-rotter har næsten ingen Rouleaux-formationer i deres glomerulære kapillærer og har kun 0,05 ± 0,05 forekomster pr. 25 optiske sektioner fra toppen, taget ved 1 μm trin . De fem ugers UUO MWF- og SD-rotter havde en markant stigning i Rouleaux-formationer 2,27 ± 0,46 og 1,46 ± 0,73 pr. 25 optiske sektioner startende fra toppen, taget ved henholdsvis 1 μm trin (figur 3F).

Ud over reduktionen i glomerulære RBC-strømningshastigheder, der blev set med UUO, blev der set en stigning i albuminpermeabilitet. Der var større heterogenitet i albuminpermeabilitet mellem glomeruli. Lejlighedsvis var albuminakkumulering inden for Bowman's Space intens nok til at blive tydeligt set (figur 4B, stjerne). Den glomerulære sigtningskoefficient for albumin steg fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWF'er til 0,045 ± 0,05 i 5-ugers UUO MWF og 0,052 ± 0,075 i fem ugers UUO SD-rotter.

Ændret proximal tubulifunktion
Interessant nok kunne det filtrerede albumin ikke detekteres i proksimale tubuliceller efter UUO. S1-segmentet endocytoser normalt store mængder albumin27,28,29,30, som vist her under fysiologiske forhold hos ubehandlede MWF-rotter (figur 5A). Den samme optagelse kunne ikke ses i MWF eller SD PT efter 5 ugers UUO (figur 5B, C). Proksimale tubuli omkring glomeruli afbildet mellem 45 og 60 minutter efter TR-RSA-infusion blev scoret for enten tilstedeværelse (1) eller fravær (0) af albumin. Det er vigtigt at bemærke, at S1-segmentet under fysiologiske forhold ivrigt binder og internaliserer albumin med lidt eller intet albumin, der når de distale rør eller samler kanaler. Det er derfor indlysende, at sidstnævnte proksimale tubulisegmenter muligvis ikke indeholder albumin, hvilket resulterer i en fraktioneret positivitet for albuminoptagelse på mindre end 1,0. Figur 5D viser en graf med resultaterne fra scoring af proksimale tubulialbuminoptagelse. Ubehandlet MWF havde en proksimal tubulifraktionsoptagelsesværdi på 0,556 ± 0,126. Både fem ugers UUO MWF- og SD-rotter havde signifikant lavere værdier på henholdsvis 0,049 ± 0,126 og 0,00 ±0,00.

Der blev også gennemført undersøgelser af 12-ugers UUO MWF-rotter (tabel 1). Tolv ugers UUO er den standardtid, der bruges til museundersøgelser for at inducere overfladeglomeruli. Tre UUO-hanrotter blev afbildet, og den glomerulære tæthed steg yderligere til 6,16 ± 1,83 glomeruli pr. 20x mark hos disse rotter. RBC-strømningshastigheden var 293 ± 67 μm/s, WBC-adhæsion var 1,47 ± 1,12, begge svarende til 5-ugers UUO-data. GSC for albumin steg også sammenlignet med 5-ugers UUO-rotter til 0,109 ± 0,04.

Glomerulære mRNA-ændringer induceret af den kroniske UUO
Tabel 2 viser alle gener (sonder) med deres grupperede ekspression og standardafvigelsesværdier. Bemærk, at gener blev udvalgt til analyse baseret på tidligere dokumentation for ændring i nyresygdom, herunder UUO som beskrevet i protokolafsnit 13's notat. Figur 6 er et varmekort over dataene, der fremhæver de dramatiske ændringer i genekspression for de fleste gener i UUO glomeruli sammenlignet med enten kontrol eller sham glomeruli.

Figure 1
Figur 1: Stigning i antallet af overfladeglomeruli og induktion af overfladeglomeruli hos SD-rotter efter 5-ugers UUO hos MWF-rotter . (A) Et kirurgisk diagram over urinlederen på venstre nyre omhyggeligt befriet fra nyrearterien og venen, inden den blev okkluderet med to bånd ved hjælp af kirurgisk sutur. (B) En graf, der angiver stigningen i antallet af overfladeglomeruli, der er til stede hos MWF-rotter før og fem uger efter UUO, sammen med antallet af overfladeglomeruli hos SD-rotter, som normalt ikke har nogen overfladeglomeruli. Antallet af overfladeglomeruli i MWF-rotter steg fra 1,08 ± 0,11/mark hos ubehandlede rotter til 2,97 ± 0,65/mark i 5-ugers UUO-gruppen. SD-rotter gik fra ikke at have nogen overfladeglomeruli til 2,02 ± 0,37 / felt. Tredimensionelle rekonstruerede billeder viser nyreoverfladen for ubehandlet MWF (C), MWF efter 5 ugers UUO (D) og SD efter fem ugers UUO (E). Bemærk udseendet af store, orange vakuolære strukturer, der er samlet fra små individuelle lysosomer til store unormale kroppe. 5-ugers UUO hos SD-rotter resulterede ikke i områder, der lignede normal rørformet epitelia set i C og delvist i D. Vaskulaturen syntes rettet i nogle regioner og havde i mange delvise okklusioner, der tillod plasma, men ikke RBC'er at strømme. (n = 3 hanrotter pr. gruppe) Skala søjler = 40 μm. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; G = glomerulus; RBC'er = røde blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Reduktion i RBC-flow inden for den overfladiske peritubulære vaskulatur efter 5-ugers UUO. Linescans blev indsamlet i peritubulære blodkar for at bestemme RBC strømningshastighed i μm / s. Kort fortalt repræsenterer de røde referencelinjer, der vises i A, B og C , et lille område, hvor det samme pixelbrede område blev scannet gentagne gange, og billederne stables i en kolonne for at visualisere forvrængningen forårsaget af de flydende RBC'er, som bevæger sig hurtigere end mikroskopet kan erhverve dem. Kolonnen ved siden af referencefiguren er linecan, hvor hældningen af RBC-forvrængningen bruges til at beregne hastighed (x-akse = afstand og y-akse = tid). Her svarer gradvist stejlere skråninger til langsommere RBC-hastigheder, da de forbliver længere i linjerne. Bemærk forskellen i forekomsten af RBC'erne i ubehandlede MWF-rotter (A) sammenlignet med de fem ugers UUO-billeder for MWF (B) og SD (C) rotter. RBC-strømningshastighederne for de tre rottegrupper er vist i D. Peritubulært RBC-flow i ubehandlede MWF'er var i gennemsnit 885 ± μm/s. Disse værdier faldt betydeligt fem uger efter UUO i MWF- og SD-rotter til henholdsvis 250 ± 100 μm/s og 200 ± 125 μm/s. Skalabar = 20 μm, n = 3 hanrotter pr. gruppe. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvide blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Signifikant reduktion i glomerulær kapillærsløjfe RBC-flow og induceret aktivering af WBC-adhæsion ved 5-ugers UUO. Den samme linescan tilgang, der blev brugt til at bestemme peritubulær RBC-strømning, blev brugt til at undersøge ændringer i glomerulær kapillær blodgennemstrømning. Panelerne A, B og C viser et lignende layout som figur 2 og fokuserer på en glomerulus i henholdsvis sham-opereret MWF, fem-ugers UUO MWF og fem-ugers UUO SD'er. (D) En graf, der viser den fysiologisk høje RBC-strømningshastighed i kapillærsløjferne fra fupdrevne MWF-rotter med et gennemsnit på 1.405 ± 425 μm/s ± 425, faldt til 250 ± 220 μm/s og 190 ± 200 μm/s for henholdsvis 5-ugers UUO MWF og 5-ugers UUO SD-rotter. Ved undersøgelse af de glomerulære kapillærsløjfer var vedhæftede WBC'er let synlige, mens de fokuserede gennem glomerulus. Tredimensionelle optiske sektioner af individuelle glomeruli blev taget, og de første 10 optiske sektioner, 1 μm fra hinanden, blev brugt til at måle antallet af vedhæftede WBC'er. Ubehandlede MWF-rotter havde stort set ingen synlige WBC'er i deres volumener, i gennemsnit mindre end 0,125 ± 0,05 WBC'er / 10 optiske sektioner fra toppen, taget ved 1 μm trin. I 5-ugers UUO MWF- og SD-rotter steg disse tal til henholdsvis 1,5 ± 0,5 og 3,25 ± 0,7 WBC'er/10 optiske sektioner fra toppen, taget ved henholdsvis 1 μm trin. Disse resultater vises i grafen i panel E, med farveindsatser, der viser WBC'er, der lukker kapillærsløjfer. Rouleaux-formationer (pile, indsat i panel F) vises som RBC'er tæt bundet sammen i en "stablet mønt" -konfiguration, som stort set bevarer deres bundtede gruppering, selv i blodgennemstrømningens turbulens. Disse patologiske strukturer var let synlige på større dybder inden for glomerulus. Sham-opererede MWF-rotter var stort set blottet for disse strukturer og havde kun 0,05 ± 0,05 forekomster 25 optiske sektioner fra toppen, taget ved 1 μm trin af glomerulært volumen. I modsætning hertil havde 5-ugers UUO i både MWF- og SD-rotter en markant stigning i Rouleaux-formationer med forekomster på henholdsvis 2,27± 0,46 og 1,46 ± 0,73/25 optiske sektioner fra toppen, taget ved 1 μm trin. Skalastænger = 20 μm, n = 3 hanrotter pr. Gruppe. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvide blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Signifikant stigning i glomerulær kapillær albuminpermeabilitet efter 5-ugers UUO. Panelerne A, B og C viser pseudofarvebilleder af et 3D-volumen for rotteserumalbuminkanal i henholdsvis ubehandlet MWF, 5-ugers UUO MWF og fem ugers UUO SD-rotter. Billederne præsenteres i en pseudofarvepalet for at fremhæve den mærkbare mængde filtreret albumin, der ses i Bowmans rum, især i panel B (stjerne). (A) Bowmans mellemrum (stjerne) viser det normale niveau af albumin, der typisk ses hos ubehandlede MWF-rotter, der ikke kan ses for øjet. Billeder af glomeruli blev taget før infusionen af albumin for at trække baggrundsfluorescensværdier fra dem, der blev taget efter albuminadministration. (D) En graf med den glomerulære sigtningskoefficient for albumin i ubehandlede MWF-rotter med en værdi på 0,015 ± 0,002. Denne værdi steg betydeligt til 0,045± 0,05 i 5-ugers UUO MWF-rotter og 0,052 ± 0,075 i fem ugers UUO SD-rotter. Denne parameter er en ratioed værdi af fluorescerende intensiteter af Bowman's Space divideret med plasmaværdien og har ingen tilknyttet måleenhed. Skalabar = 20 μm, n = 3 hanrotter pr. gruppe. Pseudocolor intensitetsskala er placeret under panel D. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvide blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Nedsat funktion i proksimale tubuli efter 5 ugers UUO. (A) Et billede af en overfladisk glomerulus og S1-segmentet fra en normal München Wistar Frömter-rotte taget 40 minutter efter infusion af TR-RSA og Cascade Blue dextran. Internalisering af TR-RSA kan ses i S1-segmentet og det proksimale rør. I skarp kontrast viser MWF-rotter (B) og SD-rotter (C), der udsættes for 5-ugers UUO, alvorligt ændrede proksimale rør med minimal eller ingen optagelse af TR-RSA. De normalt små, punkterede autofluorescerende lysosomer (A) bliver store og vakuolære gul-orange strukturer, ofte med en fuldstændig sammenbrud af det rørformede lumen, som ikke kan findes i de tredimensionelle datasæt. (C) Distale tubuli, der normalt er blottet for enhver form for autofluorescens, indeholder nu autofluorescerende akkumuleringer. Scoring af de proksimale tubuli omkring glomeruli i lignende billeder taget 45-60 minutter efter infusion, for albuminoptagelse, viste en signifikant forskel mellem den sham-opererede MWF-gruppe og begge 5-ugers UUO-grupper. Ubehandlede MWF-rotter havde en proksimal tubulifraktionsoptagelsesværdi på 0,556 ± 0,126. Både fem ugers UUO MWF- og SD-rotter havde signifikant lavere værdier på henholdsvis 0,049 ± 0,126 og 0,00 ±0,00. Skala bar = 20 μm, n = 3 hanrotter pr. Gruppe. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvide blodlegemer; TR-RSA = Texas Rød rotte serum albumin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Genekspressionsændringer med UUO . (A) Et varmekort over dataene. (B) Normaliserede genændringer for alle data i et spredningsplot. Ekspression af gener i kontrolnyrerne blev plottet fra lav til høj ekspression, og generne fra både SHAM- og UUO-nyrerne blev sammenlignet med kontrolekspressionsniveauerne. Gendatapunkter, der falder tæt på kontrolgenernes diagonale værdi, indikerer lignende ekspressionsniveauer for begge grupper, mens datapunkter over eller under diagonalen indikerer henholdsvis højere eller lavere ekspressionsniveauer. Bemærk SHAM-generne klynge tættere på kontroldiagonal ekspression end UUO-generne, som er mere variable. Forkortelse: UUO = ensidig ureteral obstruktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Skadens udvikling fra 5 til 12 ugers UUO. Sammenligning af 5- og 12-ugers UUO-billeddannelsesparametre hos tre mandlige MWF-rotter og tre SD-hanrotter på hvert tidspunkt. Fem ugers data er de samme som i de foregående tal. Bemærk stigningen i glomerulær tæthed og GSR for albumin med fortsat UUO. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; GSR = glomerulær sigtningskoefficient. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Analyse af inflammationsmarkører i glomeruli fra UUO og kontrolrotter. Gensondepar og CodeSets blev designet og brugt som instrueret af NanoString. Over 100 gener blev analyseret, plus positive og negative kontroller som specificeret af Nanostring. Alle gener (sonder) med deres grupperede ekspression og SD-værdier er vist i tabellen. Figur 6A er et varmekort over dataene, mens figur 6B viser genændringerne for alle data i et spredningsplot. Bemærk lighederne mellem kontroller og SHAM og tydelige ændringer for de fleste gener i UUO. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = standardafvigelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Undersøgelsen af glomerulær fysiologi har set mange forskellige tilgange, især brugen af mikropunktur, perfusion af isolerede glomeruli og mikroskopi. Tilgængeligheden af overfladeglomeruli i München Wistar rotter, Fromter og Simonsen stammer, har tilladt in vivo dynamiske undersøgelser. En vigtig note til efterforskere, der vedtager denne teknologi, er behovet for at indstille erhvervelsesparametre for at opretholde ensartede billeder mellem undersøgelser, så autofluorescensen i væv forbliver konsistent. Brug af en dual-pass fluorescein / rhodamin epifluorescensterning og justering af forstærkningsindstillinger til de grønne og røde emissionskanaler for at efterligne på computerskærmen, hvad der ses gennem okularerne, vil sikre en ensartet farvesignatur i autofluorescensen selv mellem forskellige mikroskopsystemer.

Fromter-stammen er blevet brugt i vid udstrækning, da den har et reduceret antal samlede glomeruli, ~ 75% normal, og mændene udvikler spontant hypertension omkring 12 uger med progressiv proteinuri og efterfølgende fokal glomerulær sklerose, der til sidst dør af nyresvigt12. Brugen af disse rotter og tilføjelsen af 2-fotonmikroskopi med dens reducerede fototoksicitet, forbedrede penetrationsdybde og evnen til at se flere fluorescerende sonder samtidig banede vejen for nye opdagelser 1,4,5. Med udviklingen af computerhardware og -software er kvantitative data nu standarden for alle 2-fotonlaboratorier. Flere kvantitative teknikker er blevet udviklet og anvendt til glomerulære, proksimale tubuli-, vaskulære og interstitielle processer under fysiologiske og sygdomstilstande 1,4,5,27,28,29,30.

Transgene museproduktionsfaciliteter tilføjede en ny dimension til studiet af nyrefysiologi og patologi, og det var kun et spørgsmål om tid, før dette blev kombineret med 2-fotonmikroskopi for yderligere at afgrænse betydningen af specifikke genprodukter i nyrestruktur og funktion. Imidlertid er museglomeruli, undtagen hos meget unge mus, placeret over 100 μm fra overfladen af nyren9. To-fotonmikroskopi udføres bedst i en dybde på mellem 20 og 50 μm som opløsning, og fluorescensintensiteten falder hurtigt derefter på grund af lysspredning af udsendt lys og absorption fra interaktion med hæmoglobin. Derfor var det nødvendigt at inducere overfladeglomeruli. Den almindeligt anvendte tilgang er en langvarig ensidig obstruktionsmodel i 12 uger. Da disse modeller ikke tillader baseline-bestemmelse, er det ikke muligt at adskille virkningerne af UUO fra den proces, der undersøges.

Ved hjælp af MWF-rotter kan man sammenligne baseline glomerulær funktion med den følgende UUO. Denne UUO-model er kendt for at fremkalde betændelse og en hurtig fibrose og er blevet brugt til at studere CKD og fibrose10,11,12. Som forventet var der en stigning i overfladeglomeruli hos både MWF- og SD-rotter. Desuden var de kvantitative resultater, der blev opnået efter UUO for MWF- og SD-rotterne, meget sammenlignelige. Reduktionen i blodgennemstrømningen registreret her var tidligere blevet rapporteret sammenlignet med mikroskopiske data efter UUO med mikropunkturdata3. Det var også velkendt, at rørformet og interstitiel histologi er markant ændret, og PT'erne er for det meste ikke-funktionelle, som rapporteret her, med mangel på albuminendocytose. Undersøgelserne i figur 2 og figur 3 viser en dramatisk reduktion i RBC-strømningshastigheden i glomerulære og peritubulære kapillærer og forbedret WBC-vedhæftning. Reduktionerne i flow skyldes sandsynligvis kapillærblokering fra WBC-adhæsions- og rouleauxformationer.

For yderligere at evaluere inflammation kvantificerede vi albuminpermeabilitet og viste, at det steg ti gange. Derudover viste isoleret glomeruli, at mRNA-ekspression steg for mange gener, der tidligere var kendt for at være øget i nyrebetændelse i en række nyresygdomstilstande 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Stigningerne i glomerulær overfladetæthed og albuminpermeabilitet var progressive, som det fremgår af de 12-ugers UUO-data. De nuværende data er de første til direkte at vise, at glomeruli gennemgår betydelige strukturelle skader, inflammation og molekylære ændringer i UUO-modellen. Resultaterne er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse af hele nyrevæv, der analyserede fårnyrebiopsier efter UUO og fandt flere inflammationsmarkører forhøjet19. De nuværende resultater indikerer, at der findes markant betændelse i glomeruli, der tidligere kun var kendt for kortikalt væv.

De nuværende data adskiller sig fra tidligere undersøgelser på mus, hvor der ikke blev fundet ændringer i adhæsionsmolekyleekspression, komplementaflejring og neutrofil infiltration mellem 12-ugers posthydronefrotisk og normal glomeruli31. Derudover brugte Hickey-laboratoriet den 12-ugers UUO-model til at studere immunreaktioner i glomeruli hos mus. De fandt ingen forskelle i neutrofil infiltration mellem fire uger gamle museglomeruli og postobstruktiv glomeruli32,33. Disse senere undersøgelser blev udført, efter at bækkenet i den blokerede nyre blev drænet for urin. Vi gjorde ikke dette, da vi ønskede at bestemme effekten af UUO på glomerulær funktion, som det ville være in vivo, uden kunstigt at fjerne væsken, der forårsager obstruktionen. Endelig erstattes brugen af UUO i mus med billeddannelse glomeruli på mere end 100 μm under overfladen. Selvom det er muligt, er der en afvejning af opløsning og intensitet, begge reduceres betydeligt, når man går ud over 50 μm34.

De præsenterede resultater er ikke overraskende, hvis man sammenstykker dataene fra den eksisterende litteratur om histologiske ændringer, dannelse af atubulær glomeruli, inflammation, fibrose, hæmodynamik10,11,12. De præsenterede data, herunder WBC-vedhæftning, rouleauxformationer, glomerulære molekylære inflammationsmarkører og øget albuminpermeabilitet, indikerer yderligere den omfattende inflammation, der pågår i denne UUO-model, selv efter fem uger og også til stede ved tolv uger. Det er klart, at kronisk UUO ikke er en fysiologisk tilstand, og brugen af UUO til at inducere overfladeglomeruli repræsenterer en skademodel. MWF-rotterne, som har overfladeglomeruli under fysiologiske forhold, kan undersøges i længderetningen, når der opstår skade. Det er muligt at generere transgene rotter, og mange efterforskere skaber dem med biosensorer for at stille specifikke spørgsmål. Især Medical College of Wisconsin har nu en koloni af MWF-rotter og har lavet transgene rotter med det formål at studere glomerulære processer under fysiologiske og patologiske forhold. Disse MWF-rotter giver en fantastisk mulighed for at studere glomerulære processer hos normale, syge og genetisk ændrede rotter.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 og P30DK079312 (til B.A.M.). Vi takker personalet på Genomics Core Facility i Research Technology Support Facility (RTSF) ved Michigan State University for at udføre Nanostring-analysen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 µm sterile cell strainer Corning #421751
100 µm sterile cell strainer Corning #421752
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Electric heating pad Sunbeam Kroger
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope Leica Microsystems Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser Spectra-Physics NA
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Cat# 78266-04
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit Invitrogen/ThermoFisher Q33140
Reptitherm Undertank Heater Zoomed Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) Qiagen 74204
RPE buffer Qiagen 1018013
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
TRI Reagent Sigma T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

Tags

Medicin udgave 181 betændelse glomerulær kapillær blodgennemstrømning kortikal ødelæggelse München Wistar Fromter rotter
Brug af 2-fotonmikroskopi til at kvantificere virkningerne af kronisk ensidig ureteral obstruktion på glomerulære processer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M. C., Sandoval, R. M.,… More

Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes. J. Vis. Exp. (181), e63329, doi:10.3791/63329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter