Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

2-fotonenmicroscopie gebruiken om de effecten van chronische unilaterale ureterale obstructie op glomerulaire processen te kwantificeren

Published: March 4, 2022 doi: 10.3791/63329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Nephrology, Indiana University School of Medicine

Summary

Hier presenteren we een protocol met behulp van 2-fotonmicroscopie in München Wistar Fromter-ratten met oppervlakteglomeruli om de effecten van langdurige ureterale obstructie op glomerulaire dynamiek en functie te kwantificeren.

Abstract

Het toepassen van nieuwe microscopiemethoden op geschikte dierziektemodellen om de dynamische fysiologie van de nier te verkennen, blijft een uitdaging. Ratten met oppervlakteglomeruli bieden een unieke kans om fysiologische en pathofysiologische processen te onderzoeken met behulp van intravitale 2-fotonenmicroscopie. Kwantificering van glomerulaire capillaire bloedstroom en vasoconstrictie en dilatatie als reactie op geneesmiddelen, permeabiliteit en ontsteking zijn slechts enkele van de processen die kunnen worden bestudeerd. Bovendien bieden transgene ratten, d.w.z. podocyten gelabeld met fluorescerende kleurstoffen en andere moleculaire biomarkerbenaderingen, een verhoogde resolutie om eiwit-eiwitinteracties en de effecten van specifieke moleculaire veranderingen direct te monitoren en te kwantificeren.

Bij muizen, die na vier weken geen oppervlakteglomeruli meer hebben, is unilaterale ureterale obstructie (UUO) gedurende enkele weken gebruikt om oppervlakteglomeruli te induceren. Omdat dit inductiemodel geen basisstudies mogelijk maakt, hebben we de effecten van UUO op glomerulaire processen gekwantificeerd in het UUO-model in München Wistar Frömter (MWF) ratten, die onder fysiologische omstandigheden oppervlakteglomeruli hebben. Het UUO-model gedurende vijf weken of langer veroorzaakte significante veranderingen in de bruto renale morfologie, de peritubulaire en glomerulaire microvasculatuur, evenals de structuur en functie van tubulaire epithelia. De stroom van glomerulaire en peritubulaire rode bloedcellen (RBC) nam significant af (p < 0,01), waarschijnlijk als gevolg van de significante toename van de hechting van witte bloedcellen (WBC's) in glomerulaire en peritubulaire haarvaten. De glomerulaire zeefcoëfficiënt van albumine steeg van 0,015 ± 0,002 in onbehandelde MWF's tot 0,045 ± 0,05 bij 5 weken oude UUO MWF-ratten. Twaalf weken UUO resulteerden in verdere toename van de glomerulaire oppervlaktedichtheid en glomerulaire zeefcoëfficiënt (GSC) voor albumine. Fluorescerend albumine gefilterd over de glomeruli werd niet opnieuw geabsorbeerd door de proximale tubuli. Deze gegevens suggereren dat het gebruik van UUO om oppervlakteglomeruli te induceren het vermogen beperkt om normale glomerulaire processen en ziekteveranderingen te bestuderen en te interpreteren.

Introduction

Het begrijpen van glomerulaire processen, met name podocytenbiologie, is al meer dan 50 jaar een doel. München Wistar-ratten met oppervlakteglomeruli hebben een centrale rol gespeeld in deze studies, waaronder micropunctuurstudies, om tal van aspecten van fysiologische en pathologische processen te begrijpen 1,2,3. Het gebruik van microscopie om glomerulaire componenten intravitaal te bestuderen was beperkt vanwege de effecten van fototoxiciteit tot de komst van 2-fotonmicroscopie die deze toxische blootstelling minimaliseerde en de penetratiediepte verhoogde 1,2. Samen met de snelle vooruitgang in computerhardware en -software, heeft dit het mogelijk gemaakt om urenlang driedimensionale (3D) en vierdimensionale (tijd) studies te doen in een enkele instelling 1,4,5.

De kwantificering van glomerulaire capillaire bloedstroom, vasoconstrictie en dilatatie als reactie op geneesmiddelen, permeabiliteit en de effecten van lading op permeabiliteit en ontsteking zijn slechts enkele van de glomerulaire processen die zijn bestudeerd. Bovendien is het S1-segment van de proximale tubulus identificeerbaar en kunnen de verschillen in het gedrag van S1- en S2-tubulair epitheel worden gekwantificeerd 1,4. Studies bij muizen, vooral met de universele beschikbaarheid van muistransgene faciliteiten, hebben geleid tot snelle vooruitgang in het begrip van de moleculaire biologie van glomerulaire ziekteprocessen. Individuele eiwitten zijn verantwoordelijk voor glomerulaire disfunctie in knock-outstudies, vooral met betrekking tot proteïnurie 6,7,8. Het gebruik van muismodellen voor glomerulaire beeldvormingsstudies is echter beperkt omdat glomeruli zich meer dan 100 μm onder het oppervlak bevinden in de talrijke bestudeerde stammen9.

Dit heeft ertoe geleid dat onderzoekers muismodellen hebben ontwikkeld en gebruikt die resulteren in oppervlakteglomeruli die kunnen worden bestudeerd. Het meest voorkomende model is het gebruik van complete UUO 10,11,12. Aan het einde van de verlengde UUO-periode zijn er tal van oppervlakteglomeruli in muizennieren die13,14 kunnen en zijn onderzocht. Er is geen baseline- of controlestudie geweest in deze muisstudies om de effecten van langdurige UUO op glomerulaire biologie te bepalen. Omdat dit een ernstig en langdurig model van letsel is dat resulteert in snelle fibrose en corticale vernietiging 10,11,12, veronderstelden we dat er effecten zouden zijn op glomerulaire processen en functie. Om deze vraag te beantwoorden, werden Munich Wistar Fromter (MWF) ratten met oppervlakteglomeruli gebruikt om controle / baselineparameters te bestuderen, en de baselinebevinding werd vergeleken met glomerulaire studies bij MWF-ratten na vijf weken UUO. We bestudeerden ook Sprague Dawley (SD) ratten die geen oppervlakteglomeruli hebben na UUO. De bevindingen geven aan dat 5 weken UUO bij MWF- en SD-ratten inderdaad het aantal oppervlakteglomeruli verhogen. Dit waren echter abnormale glomeruli met duidelijke veranderingen in de glomerulaire bloedstroom, ontsteking en macromolecuuldoorlaatbaarheid en -grootte.

Protocol

Alle experimenten volgden de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee aan de Indiana University School of Medicine.

1. De Münchense Wistar Frömter of SD-rat voorbereiden op een UUO-operatie

  1. Verdoof de rat met isofluoraan (5% inductie, 1,5-2,5% onderhoud) en scheer, was en desinfecteer het chirurgische gebied meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel een scrub op basis van jodium als chloorhexidine en alcohol. Pas langwerkende / slow-release analgeticum toe voor pijnbestrijding volgens de institutionele IACUC-richtlijnen.
  2. Maak een incisie langs de middellijn met behulp van een scalpel; lokaliseer de linker nier en bevrijd deze van de omliggende peritoneale organen.
  3. Lokaliseer zorgvuldig de renale pedikel, die de nierslagader, nierader en urineleider omvat. Scheid de urineleider van de andere structuren en neem voorzorgsmaatregelen om de delicate structuur niet te beschadigen.
  4. Gebruik een fijne tang om een 3-0 hechting voorzichtig rond de urineleider en bind deze af, waarbij u oppast dat u deze niet scheurt. Herhaal deze procedure een paar millimeter aan weerszijden van de eerste knoop om een tweede knoop te binden en volledige obstructie te garanderen.
  5. Zodra de procedure is voltooid, sluit u de opeenvolgende spierlagen zorgvuldig. Voeg voorafgaand aan het sluiten van de laatste laag 2 ml warme, steriele zoutoplossing van 0,9% toe aan de buik voordat u deze volledig sluit. Sluit de buitenste huid met chirurgische nietjes.
  6. Pas langwerkende / slow-release analgeticum toe voor pijnbestrijding en observeer herstel nauwlettend volgens de institutionele IACUC-richtlijnen. Controleer daarna periodiek en bereid u voor op beeldvorming aan het einde van de vijfde week.

2. Synthese van Texas Red rat serum albumine (TR-RSA)

  1. Weeg 100 mg Rat Serum Albumine af en los het op in 6,67 ml natriumbicarbonaatbuffer bij pH 8,4 in een conische buis van 50 ml.
  2. Voeg aan een injectieflacon van 5 mg Texas Red-X-succinimidyl ester 100 μL Dimethyl Formamide (DMF, hoge kwaliteit) en vortex toe totdat alle kleurstof is opgelost.
  3. Plaats de serumalbumine-oplossing van ratten op een vortexer op een lage/gemiddelde stand, zodat het volume van de oplossing ruim onder de bovenkant van de open buis draait.
  4. Voeg de opgeloste kleurstof toe terwijl de buis wordt gevortexed.
  5. Neem de conische buis van 50 ml, wikkel deze in folie, plaats de buis op een rocker of roller en roer langzaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
  6. Maak in een emmer van 5 L van 0,9% NaCl met een roerstaaf onder zacht roeren de membranen van een geschikte 50 kDa moleculair gewicht cut-off dialyzer nat (een membraan met clips, ingesloten membraanbuizen of dialysecassettes zijn allemaal geschikt).
  7. Laad de TR-RSA-oplossing in het membraansysteem en bevestig deze aan de flotatiehulpstukken die doorgaans bij het systeem worden geleverd. Plaats de 5 L container met de 0,9% zoutoplossing/TR-RSA een nacht bij 4 °C (in een koude ruimte) met zachte roering op een roerplaat. Vervang de dialyseoplossing ten minste drie keer in de komende 36 uur.
  8. Zwelling van het membraan zal het volume van de nu heldere TR-RSA-oplossing verhogen. Deel de oorspronkelijke 100 mg door het volume om een geschatte concentratie te verkrijgen: de kleurstof:eiwitverhouding is 1:1. Aliquot in geschikte volumes en lyofieliseren voor langdurige opslag.

3. Voorbereiding voor 2-foton intravitale beeldvorming op een omgekeerde microscoop

  1. Verwijder de afdekking van een 50 mm coverslip bodemschaal (met een diameter van 40 mm coverslip) en plaats 8 stukjes autoclaaftape op de binnenbodem naast de rand. Maak een piramidevormig, leeg venster, gebruik 4 stukken per kant om de uitwendige nier in deze ruimte te laten passen terwijl het contact perifeer blijft met de autoclaaftape, waardoor de beweging wordt geminimaliseerd. Pas de afstand aan de grootte van de rat aan om het beste contact met de nier te garanderen.
  2. Plaats 1 thermische pad aan elke kant van de 50 mm coverslip bodemschaal. Zorg ervoor dat het opwarmpad het podium bedekt.
  3. Gebruik een 40x water onderdompelingsobjectief bij 0,75x zoom en 1,5x zoom om respectievelijk 30x en 60x afbeeldingen te genereren, waardoor afbeeldingen met een lagere en hogere vergroting mogelijk zijn. Voeg indien nodig water toe aan het objectief met behulp van een spuit van 1 ml met een lang stuk PE-200-slang dat de bovenkant van het doel in een neerwaartse hoek kan bereiken om te voorkomen dat de waterdruppel door de slang stroomt.
  4. Gebruik 2% lasertransmissiviteit, met blauwe, groene en rode detectoren ingesteld op vooraf bepaalde niveaus om consistentie in de beelden tussen studies te garanderen. Stel de excitatiegolflengte in op 800 nm op de laser waarnaar wordt verwezen (zie de tabel met materialen), die alle fluoroforen die in deze studie worden gebruikt, efficiënt zal exciteren.
    1. Gebruik externe (niet-gedescande) detectoren om blauwe emissies te verzamelen met behulp van een fotomultiplicatorbuis (PMT) (420-490 nm, gain 950).
    2. Gebruik een Hyd-detector om groene emissies af te vangen (500-550 nm, winst 100).
    3. Gebruik een Hyd-detector om rode emissies af te vangen (590-660 nm, winst 200).
    4. Pas de offset in de PMT (blauwe emissies) aan zodat slechts enkele pixels in de lege delen van het weefsel een waarde van nul hebben.
      OPMERKING: De HyD-detectoren voor de groene en rode emissies hebben automatische offset-aanpassing; alleen de versterking kan worden ingesteld.
    5. Stel de bitdiepte in op 12-bits om afbeeldingen een schaal van 4.096 intensiteit te geven tussen zwart en wit.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om de ondergrenzen van de detectoren (offset in PMT) in te stellen om deze waarden niet uit te sluiten om ervoor te zorgen dat de lage intensiteitsemissies in de ruimte van Bowman worden verzameld. Als de gevoeligheidsinstelling te laag is, geven de visuele waarschuwingsmarkeringen dit aan; deze waarden krijgen een intensiteitswaarde van nul.
  5. Verdun ongeveer 6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albumine tot een totaal volume van 1 ml, laad de oplossing in een spuit van 1 ml en plaats deze op de inwonende i.v katheter in stap 4.1 na infusie van Hoechst 33342 in stap 9.1.

4. Chirurgische voorbereiding voor intravitale 2-foton beeldvorming

  1. Plaats de voorgedoofde rat met een inwonende veneuze toegangslijn (femoraal of halsvormig) op zijn kant met de geschoren linkerflank plat en recht op de tafel gericht. Zorg ervoor dat de voorpoten elkaar raken, net als de achterpoten.
  2. Palpeer voorzichtig de linkerflank net onder de ribben om te voelen voor de nier om de natuurlijke positie in de buik te bepalen. Teken indien nodig een lijn met behulp van een permanente marker langs het geschoren gebied, waarbij het niercentrum in een neus-tot-staartoriëntatie wordt doorsneden.
  3. Gebruik een getande tang om de huid vast te pakken en op te tillen om het knijpen van de permanente markerlijn met een paar hemostaten te vergemakkelijken om de onderliggende vasculatuur te verpletteren en bloedingen te voorkomen bij het maken van de incisie met een chirurgische schaar. Herhaal dit voor de dunne buitenste spierlaag om bloedingen te minimaliseren.
  4. Om de uiteindelijke incisie van de dunne binnenste buikspierlaag te maken, moet u de nier opnieuw centreren om de grootte en positie te schatten. Til de binnenste spierlaag voorzichtig op met een tang en verpletter een lijn die de huid boven de nier doorsnijdt met de hemostaten die ongeveer 1/3rd van de geschatte grootte van de nier is.
  5. Houd de grip op de spierlaag met de tang, maak de uiteindelijke incisie.
    OPMERKING: Het is beter om een kleinere incisie te maken en uit te breiden als dat nodig is dan om het te groot te maken, wat gedeeltelijke sluiting met een hechting vereist.
  6. Pak de nier voorzichtig vast door het omringende vet. Gebruik beide handen met een tang in elke hand, werk om het vet aan de onderste pool van de nier vast te pakken door een hand-over-hand techniek te gebruiken om het niervet vast te pakken en vast te houden, naar beneden werkend.
  7. Met één hand stevig grip op het vet aan de onderkant van de nier, trek je voorzichtig aan het vet en knijp je, indien nodig, de nier heel voorzichtig door de incisie. Als de nier niet gemakkelijk passeert, verbreedt u de incisie.

5. De rat positioneren voor beeldvorming

  1. Plaats de blootgestelde nier voorzichtig tegen de rand van de schaal, met een lichte rotatie, zodat de buikzijde van de nier contact maakt met de coverslip en de dorsale kant weg van de rand is gericht.
  2. Om de beweging verder te minimaliseren, neemt u twee steriele 2 x 2 gaasjes, bevochtigt ze met zoutoplossing en verpakt ze tegen de dorsale kant van de nier, waardoor het contact van de buikzijde van de nier tot aan de rand wordt versterkt.
  3. Kijk door het microscoop oculair onder epifluorescentieverlichting met behulp van een dual-pass Rhodamine / FITC-kubus. Als er beweging wordt gedetecteerd, maak dan kleine aanpassingen aan de positie en pas het gaas zorgvuldig aan, zorg ervoor dat het niet onder de nier duwt. Om de beweging verder te verminderen, rolt u de rat iets om, zodat de thorax verder van de schaal verwijderd is.

6. Beeldacquisitie voor kwantitatieve analyse

  1. Scan het oppervlak van de nier met behulp van epifluorescentieverlichting (stap 5.3) en markeer de glomerulipositie (s) met behulp van de software die is gekoppeld aan de gemotoriseerde podiumcontroller (een kenmerk van moderne systemen).
  2. Neem voor elk kleurkanaal onder 2-fotonverlichting een ondiep 3D-volume van het bovenste gedeelte van elke gemarkeerde glomerulus, die als achtergrondafbeeldingen zal dienen. Gebruik een pseudokleurenpalet in de weergaveoptie van de beeldvormingssoftware om de zwakke intensiteiten van de achtergrondfluorescentie van de glomerulaire capillaire lussen beter te visualiseren.
  3. Gebruik een oppervlakkig bloedvat als brandpunt en infundeer langzaam het fluorescerende albumine, waardoor de tijd is om de opkomst en ondergang van fluorescentie als gevolg van systemische distributie te observeren. Infundeer voldoende TR-RSA om een intensiteit in de peritubulaire vasculatuur en capillaire lussen te bereiken die net onder de verzadiging ligt.
    OPMERKING: Er is meestal een vertraging van 5 s tussen de infusie van materiaal en het verschijnen ervan in de bloedbaan wanneer nierperfusie normaal is.
  4. Wacht ongeveer 10 minuten voordat u 3D-volumes (intervallen van 1 μm) aanschaft voor alle gemarkeerde en afgebeelde glomeruli uit stap 6.2.
    OPMERKING: Simonsen's München Wistar ratten hebben minder oppervlakte glomeruli. Omdat de Frömter-stam van MW-ratten echter een groter aantal oppervlakteglomeruli heeft, kunnen vaak tot 10 glomeruli in beeld worden gebracht.
  5. Euthanasie de rat via een overdosis isofluraan aan het einde van het onderzoek. Voer een dubbele pneumothoracotamy uit om euthanasie te garanderen.

7. Glomerulaire permeabiliteit berekenen

  1. Gebruik de beeldweergavesoftware die is gekoppeld aan het microscoopsysteem en exporteer de afbeeldingen naar 12-bits RAW-afbeeldingen voor verwerking en analyse.
  2. Laad de achtergrond 3D-volumes en het onbewerkte 3D-volume met het circulerende fluorescerende albumine. Plaats het brandpuntsvlak in het 3D-volume met de helderste oppervlakkige capillaire lus in de glomeruli met voldoende ruimte aan de rand van de omringende Bowman's capsule.
  3. Zoek met behulp van visuele oriëntatiepunten hetzelfde brandpuntsvlak in het achtergrondvolume. Selecteer een gebied in de capillaire lus en een binnen de Bowman-ruimte met vermelding van de gemiddelde intensiteitswaarden van elk gebied. Gebruik deze intensiteitswaarden als achtergrondwaarden.
  4. Schets een gebied (ten minste 20 x 20 pixels in oppervlakte) binnen de ruimte van de Bowman in de albumine-bevattende afbeelding en noteer de intensiteitsmeting (selecteer een gebied dat niet grenst aan een capillaire lus of de Capsule van de Bowman om de schoonste meting van Bowman's ruimte-intensiteiten te garanderen). Verplaats het getekende gebied over twee andere regio's om een gemiddelde waarde te nemen voor de gemiddelde intensiteit binnen Bowman's Space.
  5. Selecteer de helderste plasma-fluorescerende intensiteit binnen het capillaire lusgedeelte en omcirkel dit gebied. Gebruik de drempelfunctie om de heldere waarden (meestal aan de randen van de capillaire luswanden) te markeren, RBC-schaduwen te vermijden en de waarde vast te leggen.
    OPMERKING: Aangezien factoren in het bloed een onderschatting van de plasmafluorescentieniveaus veroorzaken, is het belangrijk om de helderste gebieden te selecteren.
  6. Voer de waarden in een spreadsheet in om het SGR te berekenen met Eq (1):
    SGR = Equation 1 (1)

8. Berekening van de rode bloedcelstroom in glomerulaire capillaire lussen en renale vasculatuur met behulp van een linescan-functie

  1. Zoek een geschikt vat (een capillaire lus of een peritubulair vat). Aangezien de linescan-functie in de beeldacquisitiesoftware waarnaar wordt verwezen (zie de tabel met materialen) vereist dat het vat loodrecht staat, roteert u het beeld met behulp van de rotatiefunctie .
  2. Zodra het vat is gedraaid en plat ligt, selecteert u de XT-functie in het acquisitiemenu . Instellen om 4.000 regels te scannen. Plaats de lijn over het te onderzoeken vaartuig; zorg ervoor dat het brandpuntsvlak de maximale diameter van het in beeld te brengen segment heeft.
  3. Klik met de linkermuisknop op de samengestelde kleurenafbeelding en selecteer Momentopname maken om een referentieafbeelding te genereren van het gebied waar de lijnscan is gemaakt. Klik onmiddellijk op de knop Start om de linescan van het schip vast te leggen.
  4. Om het RBC-debiet te bepalen, importeert u de linescans in de beeldverwerkingssoftware (zie de tabel met materialen). Open het dialoogvenster Regiostatistieken weergeven in het vervolgkeuzemenu Meten . Selecteer het gereedschap voor het tekenen van één lijn en teken een lijn die overeenkomt met de helling van de RBC-schaduwen. Noteer de breedte- en hoogtewaarden.
    OPMERKING: De pixelwaarden die voor breedte worden verkregen, komen overeen met de afstand; de pixels voor hoogte komen overeen met de tijd.
  5. Gebruik de volgende formule (Eq (2)) om de snelheid te berekenen.
    RBC-debiet in μm/s = Equation 2 (2)
    OPMERKING: Dit komt overeen met acquisitieparameters bij 60x vergroting en een scansnelheid van 400 Hz met de microscoop waarnaar wordt verwezen (zie de tabel met materialen).
    1. Maak ten minste vijf berekeningen en gemiddelde deze om de snelheid voor elke linescan te rapporteren.
      OPMERKING: Deze parameters zijn afhankelijk van de pixeldimensie en acquisitiesnelheid van het microscoopsysteem.

9. Berekening van WBC-occlusie in glomerulaire capillaire lussen

  1. Dien Hoechst 33342 kernvlek (bij ~8 μg/kg rattengewicht) toe via een inwonende veneuze toegangslijn om WBC's in de capillaire lussen te identificeren.
    OPMERKING: De bruikbare diepte zal beperkt zijn als gevolg van fotonenverstrooiing en absorptie door hemoglobine, vooral voor blauwe emissies met een kortere golflengte.
  2. Centreer een glomerulus in het beeldvormingsveld en neem een 3D-dataset die begint bij het glomerulaire oppervlak en beëindig de gegevens ten minste 30 tot 35 μm. Gebruik een stapgrootte van 1 μm in de Z-richting.
  3. Identificeer WBC's door het blauwe Hoechst-kanaal te vergelijken met het Texas Red-albuminekanaal; zoek naar uitsluiting van rode kleurstof in de capillaire lus en een overeenkomstige nucleaire kleuring om de WBC's positief te identificeren. Definieer witte bloedcellen als "gehecht" als ze statisch lijken over 3 optische secties. Rapporteer de waarden als voorkomen/10 optische secties vanaf de bovenkant van de glomerulus, genomen met intervallen van 1 μm.

10. Scoren van de aanwezigheid van Rouleaux-formaties in oppervlakteglomeruli

  1. Volg dezelfde aanwijzingen voor stap 9.3 en verkrijg een 3D-gegevensset. Zoek naar Rouleaux-formaties die verschijnen als RBC's gestapeld in pakketten die bestand zijn tegen dissociatie terwijl ze langs de capillaire lussen bewegen. Gebruik een rode fluorofoor voor een betere visualisatie van de structuur op grotere diepten vanwege minder fotonenverstrooiing voor de rode emissies met een langere golflengte. Rapporteer de waarden als voorkomen/25 optische secties vanaf de bovenkant van de glomerulus, genomen met intervallen van 1 μm.

11. Isolatie van glomeruli

  1. Isoleer drie groepen glomeruli uit verse nieren met behulp van een standaard zeeftechniek die resulteert in bijna 90% zuiverheid van rattenglomeruli15.
    1. Plaats de nierschors in koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en gehakt het met behulp van meerdere fijne scharen of scheermesjes.
    2. Voeg het gehakte weefsel toe aan een steriele celzeef van 100 μm en duw het er voorzichtig doorheen met een 5 ml spuitzuiger en 50-100 ml koude PBS.
      OPMERKING: De meeste buisjes blijven behouden terwijl de glomeruli passeren.
    3. Plaats de verrijkte glomerulifractie op een filter van 70 μm en was ze uitgebreid met koude PBS. Was het filter met 100-200 ml koude PBS om de meeste resterende buisjes te verwijderen.
    4. Verzamel de glomeruli uit het filter met behulp van 1-2 ml koude PBS, centrifugeer (10.000 × g, 2 min, 4 °C) en vries ze in vloeibare stikstof tot RNA-isolatie.
      OPMERKING: Glomerulaire zuiverheid bepaald door fase-contrast microscopie is >90%, en de opbrengst is ongeveer 10 mg van 2 nieren.

12. Glomerulaire RNA-isolatie

  1. Homogeniseer de bevroren glomerulikorrel met behulp van het RNA-isolatiereagens door 400 μL van het reagens toe te voegen en de pellet te breken met behulp van een pipetpunt van 200 μL, gevolgd door korte vortexing en 5 minuten incubatie bij RT16.
  2. Voeg 40 μL 1-broom-3-chloorpropaan (BCP), vortex gedurende 15 s toe en houd 15 minuten op RT.
  3. Centrifugeer bij 12.000 × g, 15 min, 4 °C. Verwijder de waterige laag, verdun de onderste laag met een gelijk volume van 70% ethanol en laad deze rechtstreeks op een spinkolom (zie de tabel met materialen).
  4. Na de wasbeurten, elk bestaande uit het toevoegen van de respectieve oplossing aan de kolom gevolgd door centrifugatie bij 12.000 x g, 15 s, 26 °C [3 totaal, eerste 2 met 500 μL RPE (gepatenteerde milde wasbuffer met ethanol om sporen van zouten te verwijderen,3e wasbeurt met 500 μL van 80% EtOH], elueren het RNA door toevoeging van 15 μL H2 O en centrifuge, zoals voor de wasbeurten. Controleer de concentratie en zuiverheid van het RNA en transporteer de RNA-monsters naar de kernfaciliteit voor Nanostring-analyse 17,18.
    OPMERKING: De totale RNA-opbrengst is ongeveer 1-2 μg. Hier bevatten de 24 monsters 200 ng RNA bij 30 ng/ μL.

13. Nanostring analyse

OPMERKING: Nanostring-technologie is gebaseerd op de digitale detectie en directe moleculaire barcodering van doelmoleculen die kleurgecodeerde sondeparen gebruiken. De Capture-sonde draagt een biotinegroep aan het 3'-uiteinde en de Reporter-sonde draagt het signaal aan zijn 5'-uiteinde.

  1. Verzend de Nanostring-gensondeparen en CodeSets naar de Genomic Core Facility van Michigan State en gebruik zoals aangegeven door NanoString.
    OPMERKING: Er zijn zes posities voor de kleurcodes en elke positie kan een van de vier kleuren zijn, waardoor een grote verscheidenheid aan tags mogelijk is die elk afzonderlijk kunnen worden opgelost en geïdentificeerd tijdens het verzamelen van gegevens.
  2. Verkrijg de gegevens die zijn verzameld door het personeel van de Genomic Core-faciliteit met behulp van de eigen Nanostring nCounter Digital-analyzer, die gezichtsvelden verzamelt met behulp van een microscoopdoel en CCD-camera en de barcodetellingen in tabelvorm weergeeft en weergeeft.
  3. Importeer de ruwe gegevens in de nSolver-software van Nanostring voor analyse. Normaliseer de genormaliseerde gegevens met behulp van hun standaardinstellingen en vergelijk gegevens tussen groepen zoals beschreven in hun handleiding.
    OPMERKING: Het doel was om genveranderingen te monitoren waarvan eerder is aangetoond dat ze zijn veranderd in corticale weefsel van een UUO-model19, nierziekte 17,20,21,22,23,24,25,26. In totaal werden 126 genen, waaronder de aanbevolen positieve en negatieve controles, geanalyseerd in elke glomeruligroep (CONT, SHAM, &UUO).

Representative Results

Drie groepen glomeruli werden geïsoleerd met behulp van een standaard zeeftechniek die resulteert in bijna 90% zuiverheid van rattenglomeruli15. De eerste glomeruligroep was afkomstig uit de linker nier van SD-ratten die gedurende 5 weken een linker nierurterklem ondergingen, UUO (5 mannetjes, 3 vrouwtjes). De tweede glomeruligroep werd geïsoleerd uit de contralaterale controlenier van dezelfde rat, CONT (5 mannetjes, 3 vrouwtjes). De derde groep glomeruli werd geïsoleerd van SD-ratten die een SHAM-operatie ondergingen, en de linker nier werd gebruikt voor glomeruli-isolatie na 5 weken, SHAM (4 mannen, 4 vrouwtjes).

Morfologische veranderingen
Externalisatie van de geblokkeerde nier voor beeldvorming onthulde een sterk vergrote nier, ongeveer vier keer de normale grootte, met dunne epithelia zichtbaar door het met vloeistof gevulde nierinterieur. Door middel van een 20x objectief, met behulp van epifluorescentieverlichting en een FITC / Rhodamine dual-pass kubus, was de meest opvallende verandering de verdunning van de buisvormige epithelia en de uniforme ineenstorting van buisvormige lumens over de gehele buislengte. De histologie is goed beschreven en is ernstig met een week UUO 10,11,12. Het aantal glomeruli dat zichtbaar is aan het oppervlak bij MWF- en SD-ratten nam toe na vijf weken unilaterale urineleiderobstructie. Figuur 1A toont de methode die is gebruikt om het UUO-model te maken. De rechter nier is onaangetast en biedt een adequate glomerulaire filtratiesnelheid voor de rat. Het aantal glomeruli per veld met een 20x objectief (363 μm x 363 μm) werd geteld en weergegeven in een grafiek in figuur 1B. Het aantal oppervlakteglomeruli bij MWF-ratten steeg van 1,08 ± 0,11/veld bij onbehandelde ratten naar 2,97 ± 0,65/veld in de vijfweekse UUO-groep. SD-ratten gingen van geen oppervlakteglomeruli naar 2,02 ± 0,37/veld na 5 weken UUO.

Intravitale 2-fotonen foto's werden gemaakt van deze ratten na injectie met TR-RSA (rood), een 10 kDa Cascade Blue dextran (10 kDa-CB) en Hoechst 33342 om de kernen (cyaan) te labelen. Deze worden getoond voor normale MWF-ratten (figuur 1C), MWF-ratten na vijf weken UUO (figuur 1D) en SD-ratten na vijf weken UUO (figuur 1E). Deze afbeeldingen benadrukken dramatische veranderingen die optreden in de buisvormige epithelia. Proximale tubulilysosomen, die normaal gesproken kleine punctate oranje gekleurde accumulaties zijn in onbehandelde MWF- en SD-ratten, worden grote enkelvoudige vacuolaire structuren die het grootste deel van de gekrompen buiscel vullen. Zoals geschetst door het TR-RSA-albumine, leek de vasculatuur rechtgetrokken en in veel vaten, verstoken van stromende RBC's, met alleen stromend plasma. Fixatie van de nieren onthulde dat de cortex was uitgedund tot een vezelige huid niet dikker dan een millimeter. Deze waarnemingen komen overeen met de vroege literatuur met behulp van dit model 3,10,11,12.

Veranderingen in renale vasculaire dynamica en glomerulaire permeabiliteit
De renale bloedstroom was significant verminderd in zowel de vijfweekse UUO MWF- als de SD-groep in vergelijking met onbehandelde ratten (figuur 2). Sham-operated MWF ratten hadden een peritubulair RBC-debiet van 885 ± 25 μm /s. De peritubulaire RBC-stroom bij vijf weken UUO MWF- en SD-ratten daalde tot respectievelijk 250 ± 100 μm/s en 200 ± 125 μm/s. Deze waarden werden berekend door lijnscans te verzamelen over peritubulaire vaten om de RBC-snelheid te berekenen. Figuur 2D toont een grafiek van deze gegevens.

De RBC-snelheid binnen de glomerulaire capillaire lussen was significant afgenomen bij de vijfweekse UUO MWF- en SD-ratten in vergelijking met onbehandeld MWF (figuur 3). In veel gevallen bleken glomeruli capillaire lussen te hebben die volledig verstoken waren van stromende RBC's. Capillaire lus RBC-stroomsnelheden waren respectievelijk 1.405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ± en 190 ± 200 μm / s of onbehandeld MWF, vijf weken UUO MWF en vijf weken UUO SD-ratten (figuur 3D). Binnen de capillaire lussen van de vijf weken durende UUO-groepen onthulde de trage stroom van de RBC's de aanwezigheid van adherente WBC's, die de stroom vertragen of blokkeren, met alleen plasmastroom gevisualiseerd stroomafwaarts van de gedeeltelijke of totale obstructie. Om deze waarneming te kwantificeren, werd het aantal adherente WBC's in een 3D-volume geteld en vervolgens genormaliseerd tot voorkomen per 10 μm 3D-volumediepte. De structuur van de aangehechte witte cel kon worden onderscheiden met behulp van de cyaankernkleurstoffluorescentie uit Hoechst 33342. Helaas beperkte de grotere fotonenverstrooiing van blauw-emitterende lichten de betrouwbare identificatie van WBC's door hun kernen tot de bovenste 10 optische secties vanaf de bovenkant, genomen met stappen van 1 μm glomerulair volume. Onbehandelde MWF-ratten hadden minder dan 0,125 ± 0,05 WBC's / 10 optische secties van bovenaf, genomen met een volume van 1 μm stappen, terwijl dit aantal steeg tot respectievelijk 1,5 ± 0,5 en 3,25 ± 0,7 in 5-weekse UUO MWF en 5-weekse UUO SD-ratten (figuur 3E).

Een andere vasculaire verandering die ook een verminderde RBC-stroom in de 5-weekse UUO-groepen kan verklaren, was het regelmatig verschijnen van Rouleaux-formaties (gegroepeerde RBC's die worden gehecht in een "gestapelde munt" -configuratie, zie inzet van figuur 3F). Rouleauxformaties stromen langzamer en kunnen worden gestopt door een aanhangende WBC. Onbehandelde WMF-ratten hebben vrijwel geen Rouleaux-formaties in hun glomerulaire haarvaten, met slechts 0,05 ± 0,05 voorkomen per 25 optische secties vanaf de bovenkant, genomen bij stappen van 1 μm . De vijfweekse UUO MWF- en SD-ratten hadden een duidelijke toename van Rouleaux-formaties 2,27 ± 0,46 en 1,46 ± 0,73 per 25 optische secties vanaf de top, genomen bij stappen van respectievelijk 1 μm (figuur 3F).

Naast de vermindering van glomerulaire RBC-stroomsnelheden die bij UUO werd waargenomen, werd een toename van de albuminedoorlaatbaarheid waargenomen. Er was een grotere heterogeniteit in albuminedoorlaatbaarheid tussen glomeruli. Af en toe was de accumulatie van albumine in de Bowman's Space intens genoeg om duidelijk te worden gezien (figuur 4B, sterretje). De glomerulaire zeefcoëfficiënt van albumine steeg van 0,015 ± 0,002 in onbehandelde MWF's, naar 0,045 ± 0,05 in 5-weeks UUO MWF en 0,052 ± 0,075 in vijfweekse UUO SD-ratten.

Veranderde proximale tubulusfunctie
Interessant is dat het gefilterde albumine niet kon worden gedetecteerd in proximale tubulicellen na UUO. Het S1-segment endocytoseert normaal gesproken grote hoeveelheden albumine 27,28,29,30, zoals hier getoond onder fysiologische omstandigheden bij onbehandelde MWF-ratten (figuur 5A). Dezelfde opname was niet te zien in de MWF of SD PT na 5 weken UUO (figuur 5B,C). Proximale tubuli rond de glomeruli die tussen 45 en 60 minuten na TR-RSA-infusie werden afgebeeld, werden gescoord voor aanwezigheid (1) of afwezigheid (0) van albumine. Het is belangrijk op te merken dat onder fysiologische omstandigheden het S1-segment fanatiek bindt en albumine internaliseert met weinig tot geen albumine dat de distale tubuli bereikt of kanalen verzamelt. Daarom ligt het voor de hand dat de laatste proximale tubulussegmenten mogelijk geen albumine bevatten, wat resulteert in een fractionele positiviteit voor albumineopname van minder dan 1,0. Figuur 5D toont een grafiek met de resultaten van het scoren van proximale tubuli albumine opname. Onbehandeld MWF had een proximale tubuli fractionele opnamewaarde van 0,556 ± 0,126. Zowel vijfweekse UUO MWF- als SD-ratten hadden significant lagere waarden van respectievelijk 0,049 ± 0,126 en 0,00 ±0,00.

Studies werden ook afgerond bij 12 weken durende UUO MWF-ratten (tabel 1). Twaalf weken UUO is de standaardtijd die wordt gebruikt voor muisstudies om oppervlakteglomeruli te induceren. Er werden drie UUO-mannetjesratten in beeld gebracht en de glomerulaire dichtheid nam verder toe tot 6,16 ± 1,83 glomeruli per 20x veld bij deze ratten. Het RBC-debiet was 293 ± 67 μm/s, de WBC-adhesie was 1,47 ± 1,12, beide vergelijkbaar met de 5-weekse UUO-gegevens. Ook het SGR van albumine steeg ten opzichte van de 5-weekse UUO-ratten tot 0,109 ± 0,04.

Glomerulaire mRNA-veranderingen geïnduceerd door de chronische UUO
Tabel 2 toont alle genen (probes) met hun gegroepeerde expressie- en standaarddeviatiewaarden. Merk op dat genen zijn geselecteerd voor analyse op basis van eerdere documentatie van verandering in nierziekte, inclusief UUO zoals beschreven in de notitie van protocolsectie 13. Figuur 6 is een heatmap van de gegevens die de dramatische veranderingen in genexpressie voor de meeste genen in de UUO-glomeruli benadrukken in vergelijking met controle- of schijnglomeruli.

Figure 1
Figuur 1: Toename van het aantal oppervlakteglomeruli en inductie van oppervlakteglomeruli bij SD-ratten na 5 weken UUO bij MWF-ratten. (A) Een chirurgisch diagram van de urineleider op de linker nier zorgvuldig bevrijd uit de nierslagader en ader voordat deze werd afgesloten met twee banden met behulp van chirurgische hechting. (B) Een grafiek die de toename aangeeft van het aantal oppervlakteglomeruli dat aanwezig is bij MWF-ratten vóór en vijf weken na UUO, samen met het aantal oppervlakteglomeruli bij SD-ratten, die normaal gesproken geen oppervlakteglomeruli hebben. Het aantal oppervlakteglomeruli bij MWF-ratten steeg van 1,08 ± 0,11/veld bij onbehandelde ratten naar 2,97 ± 0,65/veld in de 5-weekse UUO-groep. SD-ratten gingen van geen oppervlakteglomeruli naar 2,02 ± 0,37 / veld. Driedimensionale gereconstrueerde beelden tonen het nieroppervlak voor onbehandelde MWF (C), MWF na 5 weken UUO (D) en SD na vijf weken UUO (E). Let op het verschijnen van grote, oranje vacuolaire structuren die zijn samengesmolten van kleine individuele lysosomen tot grote abnormale lichamen. De 5-weekse UUO bij SD-ratten resulteerde niet in gebieden die leken op normale buisvormige epithelia gezien in C en gedeeltelijk in D. De vasculatuur leek in sommige regio's rechtgetrokken en had in veel regio's gedeeltelijke occlusies waardoor plasma maar geen RBC's konden stromen. (n = 3 mannelijke ratten per groep) Schaalstaven = 40 μm. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; G = glomerulus; RBC's = rode bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vermindering van de RBC-stroom binnen de oppervlakkige peritubulaire vasculatuur na 5 weken UUO. Linescans werden verzameld in peritubulaire bloedvaten om de RBC-stroomsnelheid in μm / s te bepalen. Kortom, de rode referentielijnen in A, B en C vertegenwoordigen een klein gebied waarin hetzelfde pixelbrede gebied herhaaldelijk werd gescand, en de afbeeldingen gestapeld in een kolom om de vervorming te visualiseren die wordt veroorzaakt door de stromende RBC's, die sneller reizen dan de microscoop ze kan verkrijgen. De kolom naast de referentiefiguur is de linescan, waarbij de helling van de RBC-vervorming wordt gebruikt om de snelheid te berekenen (x-as = afstand en y-as = tijd). Hier komen geleidelijk steilere hellingen overeen met langzamere RBC-snelheden naarmate ze langer in het linescan-gebied blijven. Let op het verschil in het uiterlijk van de RBC's bij onbehandelde MWF-ratten (A) in vergelijking met de vijf weken durende UUO-beelden voor de MWF (B) en SD (C) ratten. De RBC-stroomsnelheden voor de drie rattengroepen worden weergegeven in D. De peritubulaire RBC-stroom in onbehandelde MWF's bedroeg gemiddeld 885 ± μm/s. Deze waarden daalden vijf weken na UUO bij MWF- en SD-ratten aanzienlijk tot respectievelijk 250 ± 100 μm/s en 200 ± 125 μm/s. Schaalbalk = 20 μm, n = 3 mannelijke ratten per groep. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = rode bloedcel; WBC = witte bloedcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Significante vermindering van de glomerulaire capillaire lus RBC-stroom en geïnduceerde activering van WBC-adhesie door 5-weekse UUO. Dezelfde linescan-benadering die werd gebruikt om de peritubulaire RBC-stroom te bepalen, werd gebruikt om veranderingen in de glomerulaire capillaire bloedstroom te onderzoeken. Panelen A, B en C tonen een vergelijkbare lay-out als figuur 2 en richten zich op een glomerulus in respectievelijk sham-operated MWF, vijf weken UUO MWF en vijf weken UUO SSD's. (D) Een grafiek die de fysiologisch hoge RBC-stroomsnelheid in de capillaire lussen van schijngestuurde MWF-ratten met een gemiddelde van 1.405 ± 425 μm/s ± 425 laat zien, daalde tot respectievelijk 250 ± 220 μm/s en 190 ± 200 μm/s voor respectievelijk de UUO MWF- en 5-weekse UUO SD-ratten. Bij het onderzoeken van de glomerulaire capillaire lussen waren aanhangende WBC's gemakkelijk zichtbaar tijdens het scherpstellen door de glomerulus. Driedimensionale optische secties van individuele glomeruli werden genomen en de eerste 10 optische secties, 1 μm uit elkaar, werden gebruikt om het aantal adherente WBC's te meten. Onbehandelde MWF-ratten hadden vrijwel geen zichtbare WBC's in hun volumes, gemiddeld minder dan 0,125 ± 0,05 WBC's / 10 optische secties vanaf de bovenkant, genomen met stappen van 1 μm. Bij 5-weekse UUO MWF- en SD-ratten namen deze aantallen toe tot 1,5 ± 0,5 en 3,25 ± 0,7 WBC's /10 optische secties van bovenaf, genomen met stappen van respectievelijk 1 μm. Deze resultaten worden weergegeven in de grafiek in paneel E, met kleurinzetstukken die WBC's weergeven die capillaire lussen afsluiten. Rouleaux-formaties (pijlen, inzet in paneel F) verschijnen als RBC's die nauw met elkaar verbonden zijn in een "gestapelde munt" -configuratie die grotendeels hun gebundelde groepering behouden, zelfs in de turbulentie van de bloedstroom. Deze pathologische structuren waren gemakkelijk waarneembaar op grotere diepten in de glomerulus. Sham-bediende MWF-ratten waren grotendeels verstoken van deze structuren, met slechts 0,05 ± 0,05 voorkomen 25 optische secties van de bovenkant, genomen met 1 μm stappen van glomerulair volume. Daarentegen had de 5-weekse UUO bij zowel MWF- als SD-ratten een duidelijke toename van Rouleaux-formaties met voorvallen van 2,27± 0,46 en 1,46 ± 0,73/25 optische secties vanaf de bovenkant, genomen bij stappen van respectievelijk 1 μm. Schaalstaven= 20 μm, n = 3 mannelijke ratten per groep. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = rode bloedcel; WBC = witte bloedcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Significante toename van de glomerulaire capillaire albuminedoorlaatbaarheid na 5 weken UUO. Panelen A, B en C tonen pseudokleurbeelden van een 3D-volume voor rattenserumalbuminekanaal in respectievelijk onbehandelde MWF, 5-weekse UUO MWF en vijf weken UUO SD-ratten. De afbeeldingen worden gepresenteerd in een pseudokleurenpalet om de aanzienlijke hoeveelheid gefilterd albumine in de ruimte van de Bowman te benadrukken, met name in paneel B (sterretje). (A) Bowman's ruimte (asterisk) toont het normale niveau van albumine dat typisch wordt gezien bij onbehandelde MWF-ratten, niet te onderscheiden voor het oog. Afbeeldingen van glomeruli werden genomen voorafgaand aan de infusie van albumine om achtergrondfluorescentiewaarden af te trekken van die na toediening van albumine. (D) Een grafiek met de glomerulaire zeefcoëfficiënt voor albumine bij onbehandelde MWF-ratten, met een waarde van 0,015 ± 0,002. Deze waarde steeg aanzienlijk tot 0,045± 0,05 bij 5-weekse UUO MWF-ratten en 0,052 ± 0,075 bij vijfweekse UUO SD-ratten. Deze parameter is een ratio van fluorescerende intensiteiten van Bowman's Space gedeeld door de plasmawaarde en heeft geen bijbehorende maateenheid. Schaalbalk = 20 μm, n = 3 mannelijke ratten per groep. Pseudokleurintensiteitsschaal bevindt zich onder paneel D. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = rode bloedcel; WBC = witte bloedcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Verminderde functie in proximale tubuli na 5 weken UUO. (A) Een afbeelding van een oppervlakkige glomerulus en het S1-segment van een normale München Wistar Frömter-rat, genomen 40 minuten na infusie van TR-RSA en Cascade Blue dextran. Internalisatie van de TR-RSA is te zien in het S1-segment en de proximale tubulus. In schril contrast daarmee vertonen MWF-ratten (B) en SD-ratten (C), onderworpen aan 5 weken UUO, ernstig veranderde proximale tubuli met minimale of geen opname van TR-RSA. De normaal kleine, punctate autofluorescente lysosomen (A) worden grote en vacuolaire geeloranje structuren, vaak met een volledige ineenstorting van het buisvormige lumen, dat niet kan worden gevonden in de driedimensionale datasets. (C) Distale tubuli die normaal gesproken verstoken zijn van enige vorm van autofluorescentie bevatten nu autofluorescente accumulaties. Het scoren van de proximale tubuli rond de glomeruli in vergelijkbare beelden die 45-60 minuten na infusie zijn gemaakt, voor albumine-opname, toonde een significant verschil tussen de door sham-operatieve MWF-groep en beide 5-weekse UUO-groepen. Onbehandelde MWF-ratten hadden een proximale tubuli fractionele opnamewaarde van 0,556 ± 0,126. Zowel vijfweekse UUO MWF- als SD-ratten hadden significant lagere waarden van respectievelijk 0,049 ± 0,126 en 0,00 ±0,00. Schaalbalk= 20 μm, n = 3 mannelijke ratten per groep. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = rode bloedcel; WBC = witte bloedcel; TR-RSA = Texas Red rat serum albumine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Genexpressieveranderingen met UUO. (A) Een heatmap van de gegevens. (B) Genormaliseerde genveranderingen voor alle gegevens in een scatter plot. Expressie van genen in de controlenieren werd uitgezet van lage naar hoge expressie, en de genen van zowel SHAM- als UUO-nieren werden vergeleken met de controleexpressieniveaus. Gengegevenspunten die dicht bij de diagonale waarde van de controlegenen vallen, duiden op vergelijkbare expressieniveaus voor beide groepen, terwijl gegevenspunten boven of onder de diagonaal respectievelijk hogere of lagere expressieniveaus aangeven. Merk op dat de SHAM-genen dichter bij de controlediagonaalexpressie clusteren dan de UUO-genen, die meer variabel zijn. Afkorting: UUO = unilaterale ureterale obstructie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Progressie van letsel van 5 tot 12 weken UUO. Vergelijking van 5- en 12-weekse UUO-beeldvormingsparameters bij drie mannelijke MWF-ratten en drie SD-mannetjesratten op elk tijdstip. De vijfweekse gegevens zijn hetzelfde als in de vorige cijfers. Let op de toename van de glomerulaire dichtheid en de SGR voor albumine met voortgezette UUO. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; SGR = glomerulaire zeefcoëfficiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Analyse van ontstekingsmarkers in glomeruli van UUO en controleratten. Gensondeparen en CodeSets werden ontworpen en gebruikt zoals voorgeschreven door NanoString. Meer dan 100 genen werden geanalyseerd, plus positieve en negatieve controles zoals gespecificeerd door Nanostring. Alle genen (sondes) met hun gegroepeerde expressie en SD-waarden worden weergegeven in de tabel. Figuur 6A is een heatmap van de gegevens, terwijl figuur 6B de genveranderingen weergeeft voor alle gegevens in een scatterplot. Let op de overeenkomsten tussen controles en SHAM en duidelijke veranderingen voor de meeste genen in de UUO. Afkortingen: UUO = unilaterale ureterale obstructie; SD = standaarddeviatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De studie van glomerulaire fysiologie heeft veel verschillende benaderingen gezien, met name het gebruik van micropunctuur, perfusie van geïsoleerde glomeruli en microscopie. De beschikbaarheid van oppervlakteglomeruli in München Wistar-ratten, Fromter- en Simonsen-stammen heeft in vivo dynamische studies mogelijk gemaakt. Een belangrijke opmerking voor onderzoekers die deze technologie gebruiken, is de noodzaak om acquisitieparameters in te stellen om consistente beelden tussen studies te behouden, zodat de autofluorescentie in weefsel consistent blijft. Het gebruik van een dual-pass fluoresceïne / rhodamine epifluorescentiekubus en het aanpassen van de versterkingsinstellingen aan de groene en rode emissiekanalen om op het computerscherm na te bootsen wat door de oculairs wordt gezien, zorgt voor een consistente kleursignatuur in de autofluorescentie, zelfs tussen verschillende microscoopsystemen.

De Fromter-stam is op grote schaal gebruikt omdat het een verminderd aantal totale glomeruli heeft, ~ 75% normaal, en de mannen ontwikkelen spontaan hypertensie rond de leeftijd van 12 weken, met progressieve proteïnurie en daaropvolgende focale glomerulaire sclerose, uiteindelijk stervend aan nierfalen12. Het gebruik van deze ratten en de toevoeging van 2-fotonmicroscopie met zijn verminderde fototoxiciteit, verbeterde penetratiediepte en de mogelijkheid om meerdere fluorescerende sondes tegelijkertijd te bekijken, maakten de weg vrij voor nieuwe ontdekkingen 1,4,5. Met de ontwikkeling van computerhardware en -software zijn kwantitatieve gegevens nu de standaard voor alle 2-fotonlaboratoria. Meerdere kwantitatieve technieken zijn ontwikkeld en toegepast op glomerulaire, proximale tubuli, vasculaire en interstitiële processen onder fysiologische en ziekteomstandigheden 1,4,5,27,28,29,30.

Transgene muisgeneratiefaciliteiten voegden een nieuwe dimensie toe aan de studie van nierfysiologie en pathologie, en het was slechts een kwestie van tijd totdat dit werd gecombineerd met 2-fotonmicroscopie om het belang van specifieke genproducten in de nierstructuur en -functie verder af te bakenen. Muisglomeruli, behalve bij zeer jonge muizen, bevinden zich echter op meer dan 100 μm van het oppervlak van de nier9. Twee-fotonenmicroscopie kan het beste worden uitgevoerd op een diepte tussen 20 en 50 μm als resolutie, en de fluorescentie-intensiteit neemt daarna snel af als gevolg van lichtverstrooiing van uitgezonden licht en absorptie door interactie met hemoglobine. Daarom was het noodzakelijk om oppervlakteglomeruli te induceren. De meest gebruikte aanpak is een langdurig eenzijdig obstructiemodel gedurende 12 weken. Omdat deze modellen geen basislijnbepalingen mogelijk maken, is het niet mogelijk om de effecten van de UUO te scheiden van het proces dat wordt bestudeerd.

Met behulp van MWF-ratten kan men de glomerulaire functie vergelijken met die na UUO. Van dit UUO-model is bekend dat het ontstekingen en een snelle snelheid van fibrose induceert en is gebruikt om CKD en fibrose 10,11,12 te bestuderen. Zoals verwacht was er een toename van oppervlakteglomeruli bij zowel de MWF- als sd-ratten. Bovendien waren de kwantitatieve resultaten na de UUO voor de MWF- en SD-ratten zeer vergelijkbaar. De hier geregistreerde vermindering van de bloedstroom was eerder gemeld door microscopische gegevens na UUO te vergelijken met micropunctuurgegevens3. Het was ook bekend dat tubulaire en interstitiële histologie duidelijk is veranderd, en de PT's zijn meestal niet-functioneel, zoals hier gemeld, met een gebrek aan albumine-endocytose. De studies in figuur 2 en figuur 3 tonen een dramatische vermindering van de RBC-stroomsnelheid in glomerulaire en peritubulaire capillairen en verbeterde WBC-adhesie. De vermindering van de stroming is waarschijnlijk te wijten aan capillaire blokkade van WBC-adhesie en rouleauxformaties.

Om ontstekingen verder te evalueren, kwantificeerden we de albuminedoorlaatbaarheid en toonden we aan dat deze vertienvoudigde. Bovendien toonde geïsoleerde glomeruli aan dat de mRNA-expressie toenam voor veel genen waarvan eerder bekend was dat ze verhoogd waren bij nierontsteking in een verscheidenheid aan nierziektetoestanden 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . De toename van de glomerulaire oppervlaktedichtheid en albuminedoorlaatbaarheid waren progressief, zoals blijkt uit de 12-weekse UUO-gegevens. De huidige gegevens zijn de eerste die direct aantonen dat glomeruli aanzienlijke structurele schade, ontstekingen en moleculaire veranderingen ondergaan in het UUO-model. De resultaten komen overeen met een eerdere studie van volledig nierweefsel dat schapennierbiopten na UUO analyseerde en meerdere ontstekingsmarkers vond die19 verhoogden. De huidige resultaten wijzen erop dat er een duidelijke ontsteking bestaat in de glomeruli, voorheen alleen bekend om corticale weefsel.

De huidige gegevens verschillen van eerdere studies bij muizen waar geen veranderingen werden gevonden in adhesiemolecuulexpressie, complementafzetting en neutrofiele infiltratie tussen 12 weken posthydronefrrotische en normale glomeruli31. Daarnaast gebruikte het Hickey-laboratorium het 12 weken durende UUO-model om immuunreacties in glomeruli van muizen te bestuderen. Ze vonden geen verschillen in neutrofiele infiltratie tussen vier weken oude muisglomeruli en postobstructieve glomeruli32,33. Deze latere studies werden uitgevoerd nadat het bekken van de geblokkeerde nier was afgevoerd van urine. We hebben dit niet gedaan omdat we het effect van UUO op de glomerulaire functie wilden bepalen zoals het in vivo zou zijn, zonder kunstmatig de vloeistof te verwijderen die de obstructie veroorzaakt. Tot slot wordt het gebruik van UUO bij muizen vervangen door het in beeld brengen van glomeruli op meer dan 100 μm onder het oppervlak. Hoewel mogelijk, is er een afweging in resolutie en intensiteit, die beide aanzienlijk worden verminderd naarmate men verder gaat dan 50 μm34.

De gepresenteerde resultaten zijn niet verrassend als men de gegevens uit de bestaande literatuur over histologische veranderingen, vorming van atubulaire glomeruli, ontsteking, fibrose, hemodynamieksamenvoegt 10,11,12. De gepresenteerde gegevens, waaronder WBC-adhesie, rouleauxformaties, glomerulaire moleculaire ontstekingsmarkers en verhoogde albuminedoorlaatbaarheid, wijzen verder op de uitgebreide ontsteking die in dit UUO-model aan de gang is, zelfs na vijf weken en ook aanwezig is na twaalf weken. Het is duidelijk dat chronische UUO geen fysiologische toestand is en het gebruik van UUO om oppervlakteglomeruli te induceren vertegenwoordigt een verwondingsmodel. De MWF-ratten, die onder fysiologische omstandigheden oppervlakteglomeruli hebben, kunnen longitudinaal worden bestudeerd als er letsel optreedt. Het is mogelijk om transgene ratten te genereren en tal van onderzoekers maken ze met biosensoren om specifieke vragen te stellen. In het bijzonder heeft het Medical College of Wisconsin nu een kolonie MWF-ratten en heeft het transgene ratten gemaakt met als doel glomerulaire processen onder fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen. Deze MWF-ratten bieden een geweldige kans om glomerulaire processen te bestuderen bij normale, zieke en genetisch veranderde ratten.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 en P30DK079312 (aan B.A.M.). We bedanken het personeel van de Genomics Core Facility van de Research Technology Support Facility (RTSF) van de Michigan State University voor het uitvoeren van de Nanostring-analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 µm sterile cell strainer Corning #421751
100 µm sterile cell strainer Corning #421752
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Electric heating pad Sunbeam Kroger
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope Leica Microsystems Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser Spectra-Physics NA
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Cat# 78266-04
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit Invitrogen/ThermoFisher Q33140
Reptitherm Undertank Heater Zoomed Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) Qiagen 74204
RPE buffer Qiagen 1018013
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
TRI Reagent Sigma T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

Tags

Geneeskunde Nummer 181 Ontsteking glomerulaire capillaire bloedstroom corticale vernietiging München Wistar Fromter ratten
2-fotonenmicroscopie gebruiken om de effecten van chronische unilaterale ureterale obstructie op glomerulaire processen te kwantificeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M. C., Sandoval, R. M.,… More

Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes. J. Vis. Exp. (181), e63329, doi:10.3791/63329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter