Summary
Det övergripande målet med detta dokument är att beskriva hur man utför i ovo intracellulär injektion av exogena material i kycklingembryon. Detta tillvägagångssätt är mycket användbart för att studera utvecklingsbiologin hos kycklingembryon.
Abstract
Som ett klassiskt modellsystem för embryobiologi har kycklingembryot använts för att undersöka embryonal utveckling och differentiering. Att leverera exogena material till kycklingembryon har en stor fördel för att studera genfunktion, transgen avel och chimärberedning under embryonal utveckling. Här visar vi metoden för in ovo intravaskulär injektion varigenom exogena material såsom plasmidvektorer eller modifierade primordiala könsceller (PGC) kan överföras till donator kycklingembryon i tidiga utvecklingsstadier. Resultaten visar att den intravaskulära injektionen genom dorsal aorta och huvud gör att injicerade material kan diffundera in i hela embryot genom blodcirkulationssystemet. I det presenterade protokollet bestämdes effekten av exogen plasmid och lentiviral vektorintroduktion och koloniseringen av injicerade exogena PGC i mottagargenaden genom att observera fluorescens i embryonerna. Denna artikel beskriver detaljerade förfaranden för denna metod, vilket ger ett utmärkt sätt att studera genfunktion, embryo- och utvecklingsbiologi och gonad-chimär kycklingproduktion. Sammanfattningsvis kommer denna artikel att tillåta forskare att utföra i ovo intravaskulär injektion av exogena material i kycklingembryon med stor framgång och reproducerbarhet.
Introduction
Kycklingembryon har använts i stor utsträckning i århundraden i utvecklings-, immunologiska, patologiska och andra biologiska tillämpningar 1,2,3. De har många inneboende fördelar jämfört med andra djurmodeller i studiet av toxikologi och cellbiologi4. Kycklingembryon är lättillgängliga och kan manipuleras in vitro och observeras direkt i alla utvecklingsstadier, vilket ger ett praktiskt embryoforskningsmodellsystem.
I allmänhet har nuvarande leveransmetoder för kycklingembryo som elektrotransfektion och subgerminal kavitetsinjektion begränsningar såsom kravet på specialutrustning och ett utformat program och ineffektivitet på grund av närvaron av äggula och albumen 5,6,7. Här visar vi en enkel och effektiv hanteringsmetod för att leverera exogena material till kycklingembryon. Detta kan vara ett kraftfullt verktyg som används vid studier av utvecklingsbiologi. De injicerade materialen sprids till hela embryot via blodcirkulationen. Under den tidiga utvecklingen av kycklingembryon kunde PGC migrera genom blod, kolonisera könsryggen och sedan utvecklas till gameter, vilket ger en värdefull möjlig väg att leverera exogena material8. Nu har denna metod använts i stor utsträckning i studien av genfunktion, embryo och utvecklingsbiologi och chimär och transgen kycklingproduktion 9,10,11.
I ovo intravaskulär injektion i kycklingembryon är en väletablerad och vanligt använd metod 12,13,14. I detta dokument visar vi en omfattande beskrivning av detta protokoll inklusive injektionsmaterial, platser, dosering och representativa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar vård och användning av djur överensstämde med U.S. National Institute of Health riktlinjer (NIH Pub. nr 85-23, reviderad 1996) och kycklingembryoprotokollen godkändes av Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee vid Yangzhou University, Kina (nr 201803124).
1. Befruktad ägguppsamling och beredning
OBS: Till skillnad från däggdjur har kycklingen miljontals folliklar i en enda äggstock, men endast ett fåtal av dessa folliklar är mogna nog att ägglossa. Varje follikel innehåller en äggcell eller bakteriecell. Så snart follikeln mognar och släpper ut sin äggula, införlivas den i äggledarens tratt. När follikeln kommer in i äggledarens jugulära buk binder sperma till ägget i hönans kropp, och kalciumet i hönans kropp bildar ett skal som omsluter det befruktade ägget och bildar ett mjukskalat ägg i kroppen. Kalciumskalet tjocknar gradvis tills ägget produceras.
- Samla befruktade ägg från en lokal leverantör eller institution, som kan lagras vid 16 ° C i 1 vecka.
OBS: Den höga lagringstemperaturen hjälper embryot att utvecklas, medan den låga temperaturen minskar embryots livskraft. Embryona kommer inte att utvecklas om lagringstiden är för lång. - Skrubba äggskalet mjukt och långsamt med 75% etanol innan du överför äggen till inkubatorn.
- Placera äggen i sidled, snyggt på ett ställ i en inkubator vid 37,8 ° C och 60% fuktighet. Efter 60 timmars inkubation (HH steg 17) kommer embryon att utveckla synliga blodkärl och hjärtat börjar slå15.
OBS: Efter 2 dagars inkubation uppträder små primordiala prickar, det tidiga skedet av hjärtat. Denna process kallas körsbärspöd. Vid ~ 2,5 dagar bildas hjärta och andra kroppssegment med synliga kärl.
2. Beredning före injektion
- Förbered glaskapillärer som kommer att användas som nålar. Dra 90 mm glaskapillärer med en ytterdiameter på 1 mm och en innerdiameter på 0,6 mm före injektionen med hjälp av avdragaren. Bryt spetsar med pincett (vinkeln på glaskapillären är vanligtvis 45 °) och sterilisera kapillärerna under UV-ljus i 2 timmar.
- Förbered exogena material såsom plasmider, förpackade lentivirus och PGC.
- Blanda försiktigt plasmiden pEGFP-N1 (en förbättrad GFP-uttryckande plasmid, 1μg / μL) med liposom i förhållandet 1: 3 (m / v). Tillsätt vatten för att erhålla en slutlig DNA-koncentration på 10 ng / μL. Låt DNA-blandningen sitta vid 37 °C i 20 minuter före injektion.
- Tina virus på is före injektion. Titern av lentivirus som används för injektion bör vara över 5 x 106 Tu / ml.
- Späd ut föräldra-ELLER MODIFIERAD GONAD PGC (E4.5, HH steg 24) till 2 000-5 000 celler/μL.
OBS: Här har vi visat injektionsproceduren med trypanblå.
3. Fönster
- Innan du utsätter embryon, sterilisera dem genom att försiktigt och mjukt torka av äggskalans yta med 75% alkohol med en bomullstuss, vilket säkerställer att äggets trubbiga kant steriliseras noggrant.
- Efter steriliseringen, knacka försiktigt på den trubbiga änden med pincett för att skapa ett litet fönster (0,5 cm x 0,5 cm) på äggskalytan för att exponera embryot. Ta bort embryomembranet och placera sedan ägget på hållaren under dissektionsmikroskopet.
4. Injektion
- Leta efter blodkärl under mikroskopet och justera dissektionsmikroskopets fokus för att lokalisera embryot och hitta sedan blodkärlet redo för injektion.
- Fyll glasnålen med den exogena lösningen (plasmid, lentivirus eller PGC) med en pipett långsamt och undvik luftbubblor i nålen.
- Rikta nålen med exogen lösning mot blodkärlet, med nålen parallell med blodkärlet som injiceras.
- Sätt försiktigt in den fyllda nålen i kärlet och sätt på pumpen för att mata ut lösningen (vanligtvis är den injicerade volymen ~ 1-5 μL) under mikroskopet. Luftpumptrycket bör vara tillräckligt lågt för att förhindra förstörelse av kärl, eftersom det alltför höga lufttrycket skulle skada blodkärlen vilket leder till höghastighetsflöde.
- När den exogena lösningen injiceras i kärlet, se till att kärlets färg förvandlas till lösningsfärgen och återhämtar sig till rött i 2-5 s, vilket indikerar att den exogena lösningen framgångsrikt levereras till kärlet. Vid denna tidpunkt kommer lösningen in i artären, och med hjärtslaget cirkuleras tillbaka till embryot genom artären och sedan till venen.
OBS: Det finns två injektionsställen för vaskulär injektion (figur 1B): en är huvudet, där den exogena lösningen injiceras från venen i embryonets huvud och in i hjärtat genom blodflödet och cirkulerar sedan till hela embryot med hjärtat som slår (Figur 1B, pil 1). En annan är genom dorsal aorta av embryoblod; den exogena lösningen injiceras och sprids till hela embryot (figur 1B. Pil 2) med det embryonala hjärtats slag.
- När den exogena lösningen injiceras i kärlet, se till att kärlets färg förvandlas till lösningsfärgen och återhämtar sig till rött i 2-5 s, vilket indikerar att den exogena lösningen framgångsrikt levereras till kärlet. Vid denna tidpunkt kommer lösningen in i artären, och med hjärtslaget cirkuleras tillbaka till embryot genom artären och sedan till venen.
- Efter injektion, ta bort ägget från stereomikroskopet och släpp 200 μL Penicillin-lösningen inuti äggskalet. Skär en 3 cm lång bit medicinsk tejp och försegla fönstret. Skrapa försiktigt tejpen med sax för att pressa ut eventuella luftbubblor och skär sedan en annan bit för att försegla öppningen över.
- Märk och placera det injicerade ägget tillbaka i inkubatorn och inkubera tills det önskade utvecklingsstadiet eller kläckningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visar här in ovo intravaskulär injektion av kycklingembryon. En schematisk process för intravaskulär injektion visas i figur 1; i vår studie använde vi olika exogena lösningar för att testa och verifiera injektionen.
För att bättre visualisera de injicerade materialen injicerades Trypan Blue (0,4%) som ett spårämne i embryot. Spårämnet (blått) observerades diffundera till hela embryot via blodcirkulationen genom antingen dorsal aorta eller huvudinjektion (figur 2). Material som injicerades på två olika platser kunde spridas till hela embryot, vilket indikerar diffusionen genom blodcirkulationen. Visualiseringen av den blå färgen bekräftar injektionens framgång.
PEGFP-N1-vektorn lindades med PEI för att uppnå en koncentration på 1 μg/μL, medan den lentivirala vektorn pLVX-EGFP lindades med PEI och späddes ut efter titrering för att uppnå en viruskoncentration på 5 x 106 Tu/μL. De 2,5 dagars embryon (HH-steg 14-15) injicerades med lindad pEGFP-N1 eller pLVX-EGFP. Vid 4,5 dagar (HH-steg 24) observerades embryona med användning av stereoskopisk fluorescensmikroskopi. Grön fluorescens observerades i embryot vilket indikerar vektoruttrycket efter injektion. Resultaten visar att inkapslade plasmider av liposomer (PEI) och förpackat lentivirus uttrycktes i kycklingembryot 2 dagar efter injektionen (figur 3). Resultaten av plasmid- och lentiviralvektorinjektionen visade det exogena genuttrycket i embryot, vilket innebar en möjlig tillämpning vid genöverföring.
PGC isolerades från embryonernas könsrygg (E4.5, HH steg 24) och odlades för rening som i föregående publikation16. De injicerade PGC: erna märktes med det röda fluorescerande proteinet (RFP). Vid E6,0 dagar (HH-steg 28) isolerades och observerades gonaden av mottagarembryon. Resultaten visade att donatorns PGC (röda punkter) effektivt kunde komma in och kolonisera mottagarens gonader (Figur 4).
Figur 1: Schemat för den intravaskulära injektionen. A) Tidslinjen för den intravaskulära injektionen. B) Två injektionsställen som indikeras med svarta pilar, huvudet (1) och dorsal aortan (2). (C) Processen för intravaskulär injektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Diffusion av spårfärgämnet på olika injektionsställen. Överst: dorsal aorta; Botten: Huvud. Skalstång = 50 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Uttryck av GFP i embryon 2 dagar efter lentiviral vektor och inkapslad plasmidinjektion. Skalstång = 100 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Visualisering av injicerade röda fluorescensmärkta PGC i det mottagande kycklingembryot. (E6.0, HH steg 28) gonad. Skalstång = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för intravaskulär injektion av kycklingembryon i ovo är optimerad för exogena material (vektor, viral eller PGC) som ska överföras till embryot. Baserat på denna metod konstruerade vi kycklingembryomodeller med stabilt genuttryck eller interferens (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Dessa väletablerade modeller bevisar genomförbarheten av detta tillvägagångssätt. Dessutom överförde vi inte bara isolerade PGC till mottagarens embryonad, utan producerade också framgångsrikt de livskraftiga avkommorna med embryonadnad transplanterad med inducerade PGC, vilket innebär en stor tillämpning av denna metod i framtiden20.
Det kritiska steget i metoden är injektionen. De exogena materialen måste injiceras direkt i blodkärlen, inte för djupa eller för grunda. Således kräver det erfarenhet av att arbeta med kycklingembryon och höga injektionsfärdigheter som lätt kan erhållas genom övning. Jämfört med luftcellsinjektionen uppnås hög injektionseffekt och noggrannhet lättare med hjälp av denna metod. Förutom begränsningarna av höga kostnader och komplicerade steg tillämpas inte elektrotransfektion när ett stort fönster görs, eftersom det kan leda till en låg överlevnad.
Som metod för genmanipulation i kycklingembryon har metoden också vissa begränsningar. Ungefär hälften av äggen var döda under inkubationen efter injektion med en överlevnad på 40%-60%. Under tiden är leveranseffektiviteten en annan viktig faktor att tänka på, särskilt för PGC-injektion (i vårt fall är effektiviteten av plasmid- och lentivirusinjektion ~ 50% -60%, och PGC-injektionen är ~ 30% -40%). I framtiden kan protokollet optimeras och överlevnadsgraden kan ökas avsevärt, vilket ytterligare förbättrar tillämpningsområdet för denna metod.
Sammanfattningsvis visar detta protokoll att intravaskulär injektion av kycklingembryot i ovo är specifik för exogena material (vektorer eller PGC) som ska överföras till embryon. Dessutom kan denna metod enkelt läras och tillämpas på många områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarades.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31972547). Vi uppskattar copyediting av Jing Wang och voiceover av Malik Donlic vid Washington State University, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
