Summary
本文的总体目标是描述如何在卵细胞内将外源性物质注射到鸡胚 中 。这种方法对于研究鸡胚的发育生物学非常有用。
Abstract
作为胚胎生物学的经典模型系统，鸡胚已被用于研究胚胎发育和分化。将外源物质递送到鸡胚中，对于研究胚胎发育过程中的基因功能、转基因育种和嵌合体制备具有很大的优势。在这里，我们展示了 在卵子 血管内注射中的方法，其中外源性物质如质粒载体或修饰的原始生殖细胞（PGCs）可以在早期发育阶段转移到供体鸡胚胎中。结果表明，通过背主动脉和头部的血管内注射允许注射的物质通过血液循环系统扩散到整个胚胎中。在所提出的方案中，通过观察胚胎中的荧光，确定了外源质粒和慢病毒载体引入的疗效，以及注射的外源PGC在受体性腺中的定植。本文介绍了该方法的详细程序，从而为研究基因功能，胚胎和发育生物学以及性腺嵌合鸡的生产提供了极好的方法。综上所述，本文将使研究人员 能够在卵 子血管内将外源物质注射到鸡胚中，取得巨大成功和可重复性。
Introduction
几个世纪以来，鸡胚已被广泛用于发育，免疫，病理和其他生物学应用1，2，3。它们在毒理学和细胞生物学研究中比其他动物模型具有许多固有的优势4.鸡胚易于获取，可以在 体外 操纵并在任何发育阶段直接观察，这提供了一个方便的胚胎研究模型系统。
一般来说，目前的鸡胚胎递送方法，如电转染和胚芽下腔注射，具有局限性，例如需要专业设备和设计的程序，并且由于蛋黄和蛋白5，6，7的存在而效率低下。在这里，我们展示了一种将外源性物质输送到鸡胚中的简单有效的处理方法。这可以成为用于发育生物学研究的强大工具。注射的材料 通过 血液循环扩散到整个胚胎。在鸡胚胎的早期发育过程中，PGCs可以通过血液迁移，定植于生殖器脊，然后发育成配子，这为传递外源性物质提供了有价值的可能途径8。现在，该方法已广泛应用于研究基因功能、胚胎和发育生物学，以及嵌合和转基因鸡的生产9，10，11。
在蛋黄 血管内注射鸡胚中是一种完善和常用的方法12，13，14。在本文中，我们展示了该方案的全面描述，包括注射材料，部位，剂量和代表性结果。
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Protocol
所有涉及动物护理和使用的程序均符合美国国立卫生研究院指南（NIH Pub. No. 85-23，1996年修订）和鸡胚胎方案均获得中国扬州大学实验动物管理和实验动物伦理委员会的批准（No.201803124）。
1. 受精卵收集和制备
注意：与哺乳动物不同，鸡在单个卵巢中有数百万个卵泡，但只有少数这些卵泡成熟到足以排卵。每个卵泡含有一个卵母细胞或生殖细胞。一旦卵泡成熟并释放其卵黄，它就会被纳入输卵管的漏斗中。当卵泡进入输卵管的颈腹部时，精液与母鸡体内的鸡蛋结合，母鸡体内的钙形成一个壳，包裹受精卵，在体内形成软壳蛋。钙壳逐渐变厚，直到产生卵子。
- 从当地供应商或机构收集受精卵，可在16°C下储存1周。
注意：高储存温度将有助于胚胎发育，而低温将降低胚胎的活力。如果储存时间太长，胚胎将无法发育。 - 在将蛋转移到孵化器之前，用75%乙醇轻轻地擦洗蛋壳。
- 将种蛋侧向放置，整齐地放在37.8°C和60%湿度的孵化器中的架子上。在60小时的孵育后（HH阶段17），胚胎将发育出可见的血管，心脏开始跳动15。
注意：孵育2天后，出现心脏早期阶段的小原始点。这个过程被称为樱桃串珠。在~2.5天时，心脏和其他身体部分由可见的血管形成。
2. 注射前的准备
- 准备将用作针头的玻璃毛细管。注射前，使用拉拔器拉出外径为1 mm，内径为0.6 mm的90 mm玻璃毛细管。使用镊子（玻璃毛细管的角度通常为45°）打破尖端，并在紫外线下对毛细管进行灭菌2小时。
- 制备外源性材料，如质粒、包装慢病毒和PGC。
- 以1：3的比例（m / v）将质粒pEGFP-N1（表达质粒的增强GFP，1μg / μL）与脂质体轻轻混合。加水，得到10 ng/μL的最终DNA浓度。在注射前让DNA混合物在37°C下静置20分钟。
- 注射前在冰上解冻病毒。用于注射的慢病毒的滴度应超过5 x 106 Tu / mL。
- 将亲本或修饰的性腺PGCs（E4.5，HH分期24）稀释至2，000-5，000个细胞/ μL。
注意：在这里，我们展示了使用台盼蓝的注射程序。
3. 窗口化
- 在暴露胚胎之前，使用棉球用75%的酒精轻轻地擦拭蛋壳表面，确保彻底消毒卵子的钝边缘。
- 灭菌后，用镊子轻轻拍打钝端，在蛋壳表面形成一个小窗口（0.5 cm x 0.5 cm）以暴露胚胎。取出胚胎膜，然后将卵子放在解剖显微镜下的支架上。
4. 注射
- 在显微镜下寻找血管，调整解剖显微镜的焦点以定位胚胎，然后找到准备注射的血管。
- 使用移液器缓慢地用外源溶液（质粒，慢病毒或PGCs）填充玻璃针，避免针头中的气泡。
- 用外源性溶液将针头对准血管，针头平行于注射的血管。
- 轻轻地将填充的针头插入容器中，然后打开泵以在显微镜下弹出溶液（通常注射体积为〜1-5μL）。空气泵压力应足够低，以防止血管损坏，因为过高的气压会损坏血管，导致高速流动。
- 一旦外源溶液注入血管，确保血管的颜色变成溶液颜色并在2-5秒内恢复为红色，表明外源溶液成功输送到血管。此时，溶液进入动脉，并且随着心脏的跳动通过动脉循环回胚胎，然后循环到静脉。
注意：血管注射有两个注射部位（图1B）：一个是头部，其中外源性溶液从胚胎头部的静脉注射并通过血流进入心脏，然后随着心脏跳动循环到整个胚胎（图1B，箭头1）。另一种是通过胚胎血液的背主动脉;外源溶液被注射并扩散到整个胚胎（图1B。箭头2）随着胚胎心脏的跳动。
- 一旦外源溶液注入血管，确保血管的颜色变成溶液颜色并在2-5秒内恢复为红色，表明外源溶液成功输送到血管。此时，溶液进入动脉，并且随着心脏的跳动通过动脉循环回胚胎，然后循环到静脉。
- 注射后，从体视显微镜中取出卵子，并在蛋壳内滴下200μL青霉素溶液。切一块3厘米长的医用胶带，密封窗户。用剪刀轻轻刮拭胶带以挤出任何气泡，然后切开另一块以密封开口。
- 将注射的鸡蛋贴上标签并放回孵化器中，并孵化直到所需的发育阶段或孵化。
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Representative Results
我们在这里展示了在 卵子 血管内注射鸡胚。血管内注射的过程示意图如图 1所示;在我们的研究中，我们使用各种外源性溶液来测试和验证注射。
为了更好地可视化注射的材料，台盼蓝（0.4%）作为示踪剂注射到胚胎中。观察到示踪剂（蓝色）通过背主动脉或头部注射 通过 血液循环扩散到整个胚胎（图2）。在两个不同部位注射的材料能够扩散到整个胚胎，表明通过血液循环扩散。蓝色的可视化证实了注射的成功。
用PEI包裹pEGFP-N1载体以达到1μg/ μL的浓度，而用PEI包裹慢病毒载体pLVX-EGFP并在滴定后稀释以达到5 x 106 Tu / μL的病毒浓度。在4.5天（HH阶段24）时，使用立体荧光显微镜观察胚胎。在胚胎中观察到绿色荧光，表明注射后的载体表达。结果表明，脂质体（PEI）和包装慢病毒包封的质粒在注射后2天的鸡胚中表达（图3）。质粒和慢病毒载体注射结果证明了胚胎中外源基因的表达，暗示了在基因转移中的可能应用。
从胚胎的生殖器脊（E4.5，HH阶段24）中分离出PGCs并培养纯化，如先前的出版物16所示。注射的PGCs用红色荧光蛋白（RFP）标记。在E6.0天（HH阶段28）时，分离并观察受体胚胎的性腺。结果显示，供体PGCs（红点）能够有效地进入并定植受体的性腺（图4）。
图1：血管内注射示意图。 （A）血管内注射的时间线;（B） 黑色箭头表示的两个注射部位，头部（1）和背主动脉（2）;（C）血管内注射的过程。 请点击此处查看此图的大图。
图2：示踪染料在不同注射部位的扩散。 顶部：背主动脉;底部：头部。比例尺 = 50 mm 。请点击此处查看此图的大图。
图3：慢病毒载体和包封质粒注射后2天GFP在胚胎中的表达。 比例尺 = 100 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：在受体鸡胚（E6.0，HH阶段28）性腺中注射红色荧光标记PGC的可视化。比例尺 = 500 μm。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在 卵 子血管内注射鸡胚胎的方法针对要转移到胚胎中的外源性物质（载体，病毒或PGC）进行了优化。基于该方法，我们构建了具有稳定基因过表达或干扰的鸡胚模型（SpinZ，JUN，UBE2I等）。17，18，19.这些成熟的模型证明了这种方法的可行性。此外，我们不仅将分离的PGCs转移到受体的胚胎性腺上，而且还成功地用诱导的PGC移植胚胎性腺产生了可行的后代，这意味着该方法在未来的宏伟应用20。
该方法的关键步骤是注射。外源性物质必须直接注射到血管中，不能太深或太浅。因此，它需要使用鸡胚的经验和高注射技能，这可以通过实践轻松获得。与空气电池注射相比，使用这种方法更容易实现高注射效率和准确性。除了成本高和步骤复杂的局限性外，在制造大窗口时不应用电转染，因为它可能导致低存活率。
作为鸡胚基因操作的方法，该方法也有一定的局限性。大约一半的卵在注射后的孵化过程中死亡，存活率为40%-60%。同时，递送效率是另一个需要考虑的重要因素，特别是对于PGC注射（在本例中，质粒和慢病毒注射的效率约为50%-60%，PGC注射的效率约为30%-40%）。将来，该方案可能会得到优化，存活率可能会大大提高，从而进一步改善该方法的应用领域。
总之，该方案表明 ，在蛋鸡胚血管 内注射中，对于将外源性物质（载体或PGCs）转移到胚胎中是特异性的。而且，这种方法可以很容易地学习和应用于许多领域。
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Disclosures
没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（31972547）的支持。我们感谢王静的文案编辑和美国华盛顿州立大学马利克·唐利克的画外音。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
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