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Immunology and Infection

एडीज अल्बोपिक्टस सेल लाइन्स में वोल्बाचिया स्ट्रेन डब्ल्यूएएलबीबी का पता लगाना

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया का पता लगाने के लिए चार तरीकों का उपयोग किया गया था, जिसने एक-दूसरे को पूरक किया और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके देशी वोल्बाचिया संक्रमण के एडीईएस अल्बोपिक्टस-व्युत्पन्न एए 23 और एए 23-टी के वोल्बाचिया संक्रमण की पहचान सटीकता में सुधार किया।

Abstract

मातृ रूप से परेशान एंडोसिम्बियन के रूप में, वोल्बाचिया कीट आबादी के बड़े अनुपात को संक्रमित करता है। अध्ययनों ने हाल ही में वोल्बाचिया-ट्रांसफेक्टेड मच्छरों का उपयोग करके आरएनए वायरस संचरण के सफल विनियमन की सूचना दी है। वायरस को नियंत्रित करने की प्रमुख रणनीतियों में साइटोप्लाज्मिक असंगति के माध्यम से मेजबान प्रजनन का हेरफेर और प्रतिरक्षा भड़काना और मेजबान-व्युत्पन्न संसाधनों के लिए प्रतिस्पर्धा के माध्यम से वायरल टेपों का निषेध शामिल है। हालांकि, वायरल संक्रमण के लिए वोल्बाचिया-ट्रांसफेक्टेड मच्छरों की प्रतिक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्र को खराब समझा जाता है। यह पेपर वोल्बाचिया और इसके कीट वैक्टर के बीच बातचीत की समझ को बढ़ाने के लिए एडीज अल्बोपिक्टस (डिप्टेरा: क्यूलिसिडे) एए 23 कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के स्तर पर वोल्बाचिया संक्रमण की इन विट्रो पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), मात्रात्मक पीसीआर, पश्चिमी धब्बा और प्रतिरक्षाविज्ञानी विश्लेषणात्मक तरीकों के संयुक्त उपयोग के माध्यम से, वोल्बाचिया-संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक मानक रूपात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो एक विधि के उपयोग की तुलना में अधिक सटीक है। इस दृष्टिकोण को अन्य कीट कर में वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

एशियाई बाघ मच्छर एडीज अल्बोपिक्टस (स्कॉस) (डिप्टेरा: क्यूलिसिडे), जो एशिया और दुनिया के अन्य हिस्सों में डेंगू वायरस (डीईएनवी) का एक प्रमुख वेक्टर है1, दो प्रकार के इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का एक प्राकृतिक मेजबान है, वोल्बाचिया (डब्ल्यूअल्बा और डब्ल्यूअल्बबी), जो रोगाणु रेखा और दैहिक ऊतक 2,3 में वितरित किए जाते हैं। अल्बोपिक्टस भ्रूण से प्राप्त एए 23 सेल लाइन में कम से कम दो रूपात्मक कोशिका प्रकार होते हैं, जिनमें से दोनों संक्रमण4 का समर्थन करते हैं और एंटीबायोटिक दवाओं (एए 23-टी) का उपयोग करके देशी वोल्बाचिया संक्रमण से ठीक हो सकते हैं। यह देखते हुए कि एए 23 केवल डब्ल्यूएल्बीबी को बरकरार रखता है, यह मेजबान-एंडोसिम्बियन इंटरैक्शन 4,5,6 के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल है।

वोल्बाचिया मातृ रूप से प्रेषित होता है और अनुमानित 65% कीट प्रजातियों 8,9 और मच्छर प्रजातियों के 28% को संक्रमित करताहै। यह विभिन्न प्रकार के ऊतकों को संक्रमित करता है और मेजबान के साथ एक अंतरंग सहजीवी संबंध बनाता है, आमतौर पर मेजबान प्रजनन प्रणाली 12,13 में हेरफेर करके साइटोप्लाज्मिक असंगति (सीआई)11 और जनसंख्या प्रतिस्थापन को प्रेरित करता है। ये मेजबान प्रतिक्रियाएं ड्रोसोफिला सिमुलन्स14 की प्राकृतिक आबादी में और प्रयोगशाला पिंजरे और फील्ड ट्रायल15 में ए एजिप्टी में देखी गई हैं। वोल्बाचिया द्वारा प्राप्त एक महत्वपूर्ण अनुत्पादक हेरफेर डेनवी, चिकनगुनिया वायरस (सीएचआईकेवी), और वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी) 16,17 सहित विभिन्न रोगजनकों के लिए मेजबान प्रतिरोध को प्रेरित करता है, जिसे सहजीवन18,19 की बेहतर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है, आवश्यक मेजबान संसाधनों के लिए वोल्बाचिया और वायरस के बीच प्रतिस्पर्धा20, और मेजबान वायरल रक्षा मार्गों का हेरफेर .

यह प्रोटोकॉल वोल्बाचिया-प्रेरित मेजबान एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं के इन अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यह एए 23 कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के चार तरीकों का उपयोग करता है। ये विधियां अन्य मेजबान प्रजातियों के इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण के अध्ययन के लिए एक मजबूत सैद्धांतिक आधार प्रदान करती हैं। पहली विधि, पीसीआर-पारंपरिक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग किए बिना डीएनए के विशिष्ट क्षेत्रों के एंजाइमी प्रवर्धन की अनुमति देने वाली एक शक्तिशाली तकनीक- वोल्बाचिया डीएनए का पता लगाने और वोल्बाचिया संक्रमण22 की उपस्थिति / दूसरी विधि प्रत्येक पीसीआर चक्र के दौरान उत्पन्न उत्पादों का विश्वसनीय पता लगाने और माप के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके वोल्बाचिया डीएनए कॉपी घनत्व को मापती है जो पीसीआर23 से पहले टेम्पलेट की मात्रा के सीधे आनुपातिक है। तीसरी विधि इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया प्रोटीन की उपस्थिति का पता लगाती है, पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके- वैद्युतकणसंचलन की उच्च पृथक्करण शक्ति, एंटीबॉडी की विशिष्टता और क्रोमोजेनिक एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं की संवेदनशीलता के संयोजन से जटिल मिश्रण में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक। अंतिम विधि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (आईएफए) है जो वोल्बाचिया के सेलुलर उत्थान की पुष्टि करने और इसके सेलुलर स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के माध्यम से वोल्बाचिया सतह प्रोटीन (डब्ल्यूएसपी) का पता लगाने के लिए इम्यूनोलॉजी , जैव रसायन और माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है।

यह पत्र कोशिकाओं में वोल्बाचिया के अस्तित्व को सत्यापित करने के लिए ऊपर सूचीबद्ध चार तरीकों का वर्णन करता है, जिसका उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि क्या बहिर्जात वोल्बाचिया सफलतापूर्वक ट्रांसफेक्टेड था और सेल में वोल्बाचिया को मंजूरी दे दी गई थी। यह निर्धारित करने के बाद कि वोल्बाचिया कोशिकाओं में मौजूद है या नहीं, जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स या मेटाबोलॉमिक्स सहित विभिन्न विश्लेषण किए जा सकते हैं। यह प्रोटोकॉल एए 23 कोशिकाओं के माध्यम से वोल्बाचिया का पता लगाने को दर्शाता है लेकिन अन्य कोशिकाओं में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

1. सामग्री और अभिकर्मकों

  1. सेल संस्कृति के लिए पायरोजन मुक्त समाधान और मीडिया का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सभी समाधान तैयार करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करें।
  3. बहुत जांच प्रक्रिया के बाद, सेल संस्कृति के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का चयन करने में सावधान रहें।
    नोट: चूंकि एफबीएस लॉट नियमित परिवर्तन के अधीन हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल में प्रासंगिक कैटलॉग और बहुत संख्याओं को बताना असंभव है।
  4. एल्बोपिक्टस अंडे से प्राप्त एए 23 सेल उपभेदों का चयन करें, जो वोल्बाचिया मुक्त एए 23-टी के अनुरूप है।

2. सेल संस्कृति

  1. 10% एफबीएस के साथ श्नाइडर के माध्यम के 4 एमएल के साथ25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क तैयार करें।
  2. 5 से7 दिनों 7,24 के लिए एक 5% सीओ 2 वातावरण के तहत28 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं।
  3. 100x आवर्धन (चित्रा 1) पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर फ्लास्क में बिना दाग एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं का निरीक्षण करें।

3. डीएनए निष्कर्षण

  1. फ्लास्क प्रति 70-80% संगम तक 5-7 दिनों के लिए कोशिकाओं को संस्कृति (चरण 2)। एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज में 100 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पुन: निलंबित संस्कृति माध्यम के 1 एमएल से मैनुअल पाइपिंग के साथ कोशिकाओं को हार्वेस्ट करें।
  2. आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें और परिणामी सेल गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 0.40 मिलीलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें, एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में समाधान के 50 μL रखें, प्रोटीनेज के (20 मिलीग्राम / एमएल) के 5 μL जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। अंत में, कच्चे डीएनए प्राप्त करने और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 15 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर इन ट्यूबों को गर्म करें।

4. वोल्बाचिया न्यूक्लिक एसिड का पता लगाना

  1. पीसीआर विश्लेषण
    1. 20 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में पीसीआर निष्पादित करें, जिसमें डीडीएच2ओ के 8 μL, टैक पोलीमरेज़ के 10 μL ( सामग्री की तालिका देखें), डीएनए टेम्पलेट के 1 μL (चरण 3 से), आगे और रिवर्स प्राइमरों के 0.5 μL (10 μM): wsp81F (5' टीजीजी टीसीसी एएटी एएजी टीजीजीएएएएसी 3 ') और डब्ल्यूएसपी 691आर (5' एएए क्रमशः।
    2. निम्नलिखित पीसीआर स्थितियों का उपयोग करें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण, 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 35 चक्रों के बाद, 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; फिर, 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार।
    3. एक जेल इमेजर का उपयोग करके 1% एगरोज़ जेल (पीबीएस में 1% डब्ल्यू / वी एगरोज़) पर डीएनए का पता लगाएं।
  2. क्यूपीसीआर विश्लेषण
    1. निकाले गए डीएनए (चरण 3) से तीन जैविक प्रतिकृतियों (एन = 6) के लिए वोल्बाचिया जीनोम कॉपी का विश्लेषण डब्ल्यूएसपी प्राइमर 183 एफ (5 'एएजीएजीएसीसीजीएजीटीएजीसीटीजी 3') और क्यूब्रेव आर (5 'एजीटीजीएजीटीएजीटीसीसी 3') 22 का उपयोग करके, राइबोसोमल प्रोटीन एस 6 (आरपीएस 6) के साथ सामान्यीकृत आगे और रिवर्स प्राइमर (5'गागटीजीएसजीटीटीसी)
    2. डब्ल्यूएएलबीबी और आरपीएस 6 के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करें।
      1. पीएमडी -18 टी (पीसीआर उत्पादों (टीए क्लोनिंग) के कुशल क्लोनिंग के लिए एक विशेष वेक्टर) से डीएनए निकालें पुनः संयोजक प्लास्मिड जिसमें डब्ल्यूएसपी और आरपीएस 6 जीन टुकड़े (पूरक फ़ाइल) होते हैं और प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता को मापते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      2. समीकरण (1) का उपयोग कर संख्या एकाग्रता की प्रतिलिपि बनाने के लिए प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता परिवर्तित करें।
        प्लास्मिड कॉपी संख्या = Equation 1 (1)
      3. अल्ट्राप्योर पानी के साथ 10 1 से10 8 तक प्लास्मिड कॉपी नंबर को पतला करें, और प्रत्येक एकाग्रता ढाल के लिए 3 प्रतिकृति सेट करें।
      4. टीबी ग्रीन और एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली का उपयोग करके क्यूपीसीआर प्रवर्धन करें ( सामग्री की तालिका देखें), और प्रत्येक प्रतिक्रिया के परिणामों को रिकॉर्ड करें। एक मानक वक्र विकसित करने के लिए सीटी मान का उपयोग करें। 20 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में डीएनए का विश्लेषण करें, जिसमें डीडीएच2ओ के 7 μL, टीबी ग्रीन के 10.4 μL ( सामग्री की तालिका देखें), डीएनए टेम्पलेट के 1 μL (चरण 3 द्वारा प्रदान किया गया), और आगे और रिवर्स प्राइमरों (10 μM) के 0.8 μL शामिल हैं। निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण, इसके बाद 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्र, और 35 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग।
      5. स्थापित मानक वक्र और वोल्बाचिया सापेक्ष घनत्व के अनुसार कोशिकाओं में डब्ल्यूएसपी और आरपीएस 6 जीन कॉपी संख्या की गणना डब्ल्यूएसपी / एक स्वतंत्र नमूने टी-परीक्षण का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
  3. वोल्बाचिया प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
    1. प्रोटीन निष्कर्षण
      1. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में छह अच्छी तरह से प्लेट (चरण 2 से) से 2 × 107 एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं को इकट्ठा करें, उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
      2. आरआईपीए लाइसिस बफर (50 एमएम ट्रिस (पीएच 7.4), 150 एमएम एनएसीएल, 1% ट्राइटन एक्स -100, 1% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट [एसडीएस], 2 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 25 एमएम β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम ना3वीओ4 के साथ 1 एमएल लाइसेट्स तैयार करें।
      3. सेल गोली के लिए लाइसिस बफर के 200 μL जोड़ें और बर्फ पर 30 मिनट के लिए बनाए रखने। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर लाइसेट्स अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला की डब्ल्यूएसपी एकाग्रता परख करें।
    3. 15% एसडीएस-पेज जेल [10% आसुत जल; 50% (30% एसीआर-बिस (29: 1), 38% 1 एम ट्रिस, पीएच 8.8; 1% (10% एसडीएस), 1% (10% अमोनियम पर्सल्फेट), 0.04% टीईएमईडी] पर प्रोटीन की समान मात्रा लोड करें।
    4. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में प्रोटीन को स्थानांतरित करें, कमरे के तापमान पर 2 घंटे26,27 के लिए 5% स्किम्ड दूध के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करें, और फिर झिल्ली को टीबीएसटी के साथ तीन बार धोएं (टीबीएस के 1 एल में ट्वीन 20 का 1 एमएल) (सामग्री की तालिका देखें)।
    5. एंटी-डब्ल्यूएसपी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (घर में तैयार, पूरक फ़ाइल देखें) के 100 μL के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली सेते हैं, 5% स्किम्ड दूध (1: 12,000) के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करके तैयार किया जाता है।
    6. टीबीएसटी के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को तीन बार धोएं।
    7. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μL में झिल्ली सेते हैं।
    8. टीबीएसटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं, और 1: 1 के अनुपात में केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन किट में समाधान ए (एचआरपी सब्सट्रेट ल्यूमिनोल अभिकर्मक) और समाधान बी (एचआरपी सब्सट्रेट पेरोक्साइड अभिकर्मक) के 20 μL मिश्रण करें। एक ही समय में ल्यूमिनेसेंस समाधान में पूरी झिल्ली विसर्जित करें, और एक बहुआयामी इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके संकेतों का निरीक्षण करें।
  4. वोल्बाचिया प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण
    1. 5 × 105 एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं को 28 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 0.17 मिमी की मोटाई के साथ लेजर कॉन्फोकल पेट्री डिश पर सेते हैं, 3 से 4 दिनों के लिए 5% सीओ2 वातावरण के तहत 7,24। सेल 60% -70% संगम है जब तक प्रतीक्षा करें और पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो लें।
    2. पीबीएस में 4% (डब्ल्यू / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड के 1 एमएल में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
    3. 5 मिनट के लिए पीबीएसटी (पीबीएस में 0.2% वी / वी ट्राइटन एक्स -100) का उपयोग करके निश्चित कोशिकाओं को धो लें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से दो बार धो लें।
    4. पीबीएस में 3% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 1 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं।
    5. एक गीले बॉक्स में माउस एंटी-डब्ल्यूएसपी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (घर में तैयार) और माउस सीरम (पीबीएस में 1: 1,000 कमजोर पड़ने) के 100 μL में रात भर स्लाइड सेते हैं (यह आर्द्रता बनाए रख सकता है और नमी को वाष्पित होने से रोक सकता है) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. गीले बॉक्स से स्लाइड निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर वापस करें; उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और पीबीएस को हटा दें।
      नोट: चरण 4.4.7 से आगे, सभी ऑपरेशन प्रकाश से संरक्षित होना चाहिए।
    7. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (पीबीएस में 1: 2,000 कमजोर पड़ने) के 100 μL के साथ स्लाइड सेते हैं।
    8. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई पीबीएस में पतला 10 μg / एमएल, डीएनए को दृढ़ता से बांधता है) के 50 μL के साथ नमूना स्लाइड सेते हैं और फिर उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोलें।
    9. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत इम्यूनोस्टेनिंग का निरीक्षण करें।
      1. शक्ति और लेजर चालू करें।
      2. माइक्रोस्कोप के सामान्य और पारा लैंप चालू करें।
      3. सिस्टम प्रारंभ करें और ऑपरेशन सॉफ़्टवेयर चलाएँ। नमूना स्लाइड पर देवदार के तेल की एक बूंद रखो, माइक्रोस्कोप मंच पर नमूना स्लाइड रखें, और मंच को उचित स्थिति में ले जाएं।
      4. सॉफ्टवेयर में पारा दीपक अवलोकन बटन पर क्लिक करें, पारा दीपक शटर खोलें, और ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत नमूना का निरीक्षण करें।
      5. 100x आवर्धन के तहत प्रतिदीप्ति तस्वीरें लेने के लिए हरे और नीले प्रतिदीप्ति का चयन करने के लिए मैनुअल नियंत्रण कक्ष का उपयोग करें।
      6. पारा दीपक अवलोकन बटन बंद करें और छवियों को प्राप्त करना शुरू करें।
      7. अच्छी छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, स्कैन आकार (512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल) द्वारा प्रीस्कैन करें। स्पष्ट छवियों (1,024 पिक्सेल x 1,024 पिक्सेल) प्राप्त करने के लिए स्कैन आकार समायोजित करें।
      8. यदि पृष्ठभूमि शोर बहुत अधिक है तो शोर में कमी करें।
      9. छवियों को स्कैन करना और सहेजना बंद करें।
      10. पारा लैंप और लेजर बंद करें।
      11. 75% अल्कोहल के साथ उद्देश्य को मिटा दें और उद्देश्य को सबसे कम स्थिति में कम करें।
      12. शटर और माइक्रोस्कोप पावर बंद करें।
      13. उपकरण ठंडा होने के बाद, इसे धूल के आवरण से कवर करें।

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Representative Results

वोल्बाचिया का पता लगाने से पहले, एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं को दो सेल लाइनों के बीच किसी भी रूपात्मक अंतर को निर्धारित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं में कम से कम दो सेल आकृति विज्ञान होते हैं लेकिन दो सेल प्रकारों (चित्रा 1) के बीच कोई स्पष्ट रूपात्मक अंतर नहीं होता है। यहां, एए 23 कोशिकाओं को चार तरीकों का उपयोग करके वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नैदानिक प्राइमरों 81 एफ /691 आर का उपयोग करके वोल्बाचियावस्प जीन का सकारात्मक प्रवर्धन एए 23 कोशिकाओं (लेन 1 और 2) में संभव था, लेकिन एए 23-टी कोशिकाओं (लेन 3 और 4) (चित्रा 2 ए) में नहीं। क्यूपीसीआर का उपयोग करके सेल लाइनों में वोल्बाचिया घनत्व के विश्लेषण ने एए 23 कोशिकाओं में 2.4 का डब्ल्यूएसपी / आरपीएस 6 अनुपात दिखाया, लेकिन एए 23-टी कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) में कोई वोल्बाचिया नहीं है। प्रोटीन अर्क के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण एए 23 के लिए एक मजबूत डब्ल्यूएसपी संकेत और एए 23-टी (चित्रा 3 ए) के लिए कोई संकेत नहीं दिखाया, जबकि अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख ने एए 23 कोशिकाओं (हरे) में डब्ल्यूएसपी प्रोटीन (चित्रा 3 बी) का पता लगाया, जबकि डीएपीआई (नीले) के साथ दाग वाले केवल डीएनए एए 23-टी कोशिकाओं में पाए गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: बिना दाग एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं की हल्की माइक्रोस्कोपी। विषम आकृति विज्ञान इंगित करता है कि दोनों सेल लाइनों में एक से अधिक सेल प्रकार मौजूद हैं, जैसा कि तीर द्वारा इंगित किया गया है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: न्यूक्लिक एसिड स्तर पर कोशिकाओं में वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाना। (ए) एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं का पीसीआर विश्लेषण 1% एगरोज़ जेल पर हल किया गया। नैदानिक प्राइमरों, 81 एफ / 691 आर का उपयोग करके वोल्बाचियावस्प जीन का सकारात्मक पीसीआर प्रवर्धन, एए 23 कोशिकाओं (लेन 1 और 2) में मनाया जाता है, लेकिन एए 23-टी कोशिकाओं (लेन 3 और 4) में नहीं। (बी) वोल्बाचिया डब्ल्यूएसपी एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं के घनत्व की प्रतिलिपि बनाता है। एए 23 कोशिकाओं में घनत्व अधिक था और एए 23-टी कोशिकाओं में पता लगाने योग्य नहीं था। एडीज अल्बोपिक्टस आरपीएस 6 का उपयोग करके कॉपी नंबर को सामान्यीकृत किया गया था; डेटा एसईएम, एन = 6 ± मतलब है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन स्तर पर कोशिकाओं में वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाना। (ए) एए 23 कोशिकाओं (लेन 1) में डब्ल्यूएसपी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लॉटिंग, 25 केडीए के पास एक स्पष्ट बैंड के साथ; एए 23-टी (लेन 2), जिसे टेट्रासाइक्लिन के साथ इलाज किया गया था। (बी) वोल्बाचिया (हरा) के स्थानीयकरण को दिखाते हुए कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग; कोशिकाओं को पॉलीक्लोनल एंटी-डब्ल्यूएसपी एंटीबॉडी (वोल्बाचिया) के साथ जांच की गई थी, इसके बाद बकरी एंटी-माउस (हरा) एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित एंटीबॉडी, और नाभिक (नीला) डीएपीआई के साथ दाग दिया जाता है। माउस सीरम का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था क्योंकि एंटी-डब्ल्यूएसपी एंटीबॉडी को शुद्ध नहीं किया गया था, और पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी माउस-व्युत्पन्न था। वोल्बाचिया से संक्रमित एए 23 कोशिकाओं (एए 23-एंटी-डब्ल्यूएसपी) को एक सफेद तीर के साथ इंगित किया जाता है। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्त नाम: डीएपीआई = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; एम = मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल: प्लास्मिड पीढ़ी और एंटी-डब्ल्यूएसपी एंटीबॉडी तैयारी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वोल्बाचिया-होस्ट इंटरैक्शन के अध्ययन और उपन्यास उपभेदों के साथ कोशिकाओं के सफल अभिकर्मक की पुष्टि के लिए इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के स्तर पर इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का सफलतापूर्वक पता लगाने के लिए चार तरीकों का उपयोग किया गया था। इन चार प्रयोगात्मक तरीकों ने कोशिकाओं के वोल्बाचिया संक्रमण की पहचान सटीकता की पुष्टि और सुधार किया।

पीसीआर का उपयोग न्यूक्लिक एसिड स्तर पर कोशिकाओं के वोल्बाचिया संक्रमण की उपस्थिति का पता लगाने के लिए किया गया था। हालांकि, चूंकि यह संक्रमण28,29 के स्तर को निर्धारित नहीं करता है, क्यूपीसीआर का उपयोग डीएनए कॉपी घनत्व28,30 को मापने के लिए किया गया था। चूंकि पीसीआर विधियों की सटीकता कम प्रवर्धन दक्षता और झूठी सकारात्मकता से प्रभावित हो सकती है, इसलिए डीएनए की अच्छी गुणवत्ता सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से क्यूपीसीआर का पता लगाने के लिए, जहां अभिकर्मकों और टेम्पलेट्स को विकृतीकरण को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और संचालन मानक विधियों के अनुसार किया जाना चाहिए। कम प्रवर्धन दक्षता प्रतिक्रिया प्रणाली में अभिकर्मक गिरावट, अपर्याप्त टेम्पलेट मात्रा, और / या विस्तारित प्राइमर टुकड़ों की अत्यधिक लंबाई के कारण होती है28. झूठी सकारात्मक आमतौर पर अभिकर्मकों और टेम्पलेट्स के संदूषण, प्राइमर एकाग्रता के उच्च स्तर और / या डिमर और हेयरपिन प्राइमर संरचनाओं के कारण होती है। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अभिकर्मक उच्च गुणवत्ता के हैं, प्राइमरों को साहित्य के आधार पर अनुकूलित किया जाता है, और प्राइमर डिजाइन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त सॉफ़्टवेयर।

ऊपर वर्णित दो विधियां न्यूक्लिक एसिड स्तर पर इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाती हैं; अन्य दो प्रोटीन स्तर पर इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाते हैं। पश्चिमी सोख्ता का उपयोग प्रोटीन स्तर पर एए 23 और एए 23-टी कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इस पद्धति से जुड़ी समस्याएं नमूना तैयार करने, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और पहचान31 से संबंधित हैं। पश्चिमी सोख्ता का पता लगाने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों में ताजा और पूरी तरह से लाइज्ड नमूनों और सही माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना शामिल है, जिसे 1: 12,000 के कमजोर पड़ने पर निर्देशों के अनुसार मान्य और पतला किया जाना चाहिए। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार, इस विधि को अन्य टीकाकरण विधियों के साथ भी जोड़ा जा सकता है। इसलिए, वोल्बाचिया31 द्वारा इंट्रासेल्युलर संक्रमण को स्थानीयकृत करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग किया गया था, क्योंकि यह पीसीआर, क्यूपीसीआर या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके सीधे पता नहीं लगाया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बारे में ध्यान देने योग्य कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, सेल नमूनों की इष्टतम गुणवत्ता सुनिश्चित करें और संदूषण से बचें। काले गोंद बग द्वारा कोशिकाओं का संदूषण, जिसे दाग भी दिया जा सकता है, परिणामों की व्याख्या को गंभीरता से प्रभावित करेगा। दूसरा, लेजर कन्फोकल व्यंजनों में सेल घनत्व ~ 60-70% होना चाहिए। अंत में, नमूना इनक्यूबेशन के बाद पीबीएस के साथ धोना स्पष्ट प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के स्तर पर इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के लिए सापेक्ष और पूर्ण मात्रात्मक और दृश्य विधियों का उपयोग करना, यह प्रोटोकॉल किसी भी एकल विधि के उपयोग की तुलना में अधिक व्यापक और सटीक है। इसके अलावा, एक डबल मानक वक्र (डब्ल्यूएसपी और आरपीएस 6 के लिए) का निर्माण पीसीआर प्रणाली और प्रवर्धन दक्षता और अंतिम डेटा प्रोसेसिंग में प्रयोगात्मक त्रुटि के आंशिक उन्मूलन के लिए कम कठोर आवश्यकताओं में परिणाम देता है, जो प्रयोगात्मक कार्य को बहुत कम कर देता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं थीं। सबसे पहले, एंटी-डब्ल्यूएसपी एंटीबॉडी को घर में तैयार किया जाता है और अभी तक व्यावसायीकरण नहीं किया गया है। दूसरा, हालांकि पश्चिमी सोख्ता में अशुद्ध पॉलीक्लोनल एंटी-डब्ल्यूएसपी एंटीबॉडी के कारण कोई अतिरिक्त बैंड नहीं थे, एंटीबॉडी शुद्धता का संकेत देते हुए, माउस सीरम का उपयोग करने वाले नकारात्मक नियंत्रण समूह में एक हरी प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि भी थी, जो परिणामों की व्याख्या के लिए अनुकूल नहीं थी। जबकि शुद्ध एंटीबॉडी या सटीक फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग को सुनिश्चित करके पश्चिमी धब्बा और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधियों की सटीकता में सुधार किया जा सकता है, अनुभवजन्य डेटा के आगे के अध्ययन और विश्लेषण की आवश्यकता है। संक्षेप में, वोल्बाचिया के पिछले अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले चार तरीकों का उपयोग करके एए 23 कोशिकाओं में वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के लिए एक अधिक व्यापक और सटीक प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल अन्य प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों में वोल्बाचिया का पता लगाने के लिए लागू होता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम व्यावहारिक सुझावों और मार्गदर्शन के लिए मिनेसोटा विश्वविद्यालय के डॉ शिन-रू वांग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81760374) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

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References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 184
<em>एडीज अल्बोपिक्टस सेल लाइन्स</em> में <em>वोल्बाचिया</em> स्ट्रेन डब्ल्यूएएलबीबी का पता लगाना
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Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

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