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Immunology and Infection

Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.

Abstract

Come endosimbionte materno, Wolbachia infetta grandi proporzioni di popolazioni di insetti. Gli studi hanno recentemente riportato il successo della regolazione della trasmissione del virus a RNA utilizzando zanzare trasfettate da Wolbachia. Le strategie chiave per controllare i virus includono la manipolazione della riproduzione dell'ospite attraverso l'incompatibilità citoplasmatica e l'inibizione dei trascritti virali attraverso l'innesco immunitario e la competizione per le risorse derivate dall'ospite. Tuttavia, i meccanismi alla base delle risposte delle zanzare trasfettate da Wolbachia all'infezione virale sono poco compresi. Questo documento presenta un protocollo per l'identificazione in vitro dell'infezione da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine nelle cellule Aa23 di Aedes albopictus (Ditteri: Culicidae) per migliorare la comprensione delle interazioni tra Wolbachia e i suoi insetti vettori. Attraverso l'uso combinato di reazione a catena della polimerasi (PCR), PCR quantitativa, western blot e metodi analitici immunologici, è stato descritto un protocollo morfologico standard per il rilevamento di cellule infette da Wolbachia che è più accurato dell'uso di un singolo metodo. Questo approccio può anche essere applicato alla rilevazione dell'infezione da Wolbachia in altri taxa di insetti.

Introduction

La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo1, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico 2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l'infezione4 e possono essere curate dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici (Aa23-T). Dato che Aa23 conserva solo wAlbB, è un modello utile per lo studio delle interazioni ospite-endosimbionte 4,5,6.

Wolbachia è trasmesso per via materna e infetta circa il 65% delle specie di insetti 8,9 e il 28% delle specie di zanzare10. Infetta una varietà di tessuti e forma un'intima relazione simbiotica con l'ospite, di solito inducendo incompatibilità citoplasmatica (CI)11 e sostituzione della popolazione manipolando il sistema riproduttivo dell'ospite12,13. Queste risposte dell'ospite sono state osservate in popolazioni naturali di Drosophila simulans14 e in A. aegypti in una gabbia di laboratorio e in una prova sul campo15. Un'importante manipolazione non riproduttiva suscitata da Wolbachia è la resistenza indotta dell'ospite a una varietà di agenti patogeni, tra cui DENV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus del Nilo occidentale (WNV)16,17, che può essere mediata da un sistema immunitario innato migliorato del simbionte18,19, competizione tra Wolbachia e virus per le risorse essenziali dell'ospite20 e manipolazione delle vie di difesa virale dell'ospite21 .

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare questi meccanismi alla base delle risposte antivirali dell'ospite indotte da Wolbachia. Utilizza quattro metodi di rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23. Questi metodi forniscono una solida base teorica per gli studi sull'infezione intracellulare da Wolbachia di altre specie ospiti. Il primo metodo, la PCR, una potente tecnica che consente l'amplificazione enzimatica di specifiche regioni del DNA senza utilizzare procedure di clonazione convenzionali, è stato utilizzato per rilevare il DNA di Wolbachia e determinare la presenza / assenza di infezione da Wolbachia 22. Il secondo metodo misura la densità di copia del DNA di Wolbachia utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) per il rilevamento e la misurazione affidabili dei prodotti generati durante ogni ciclo PCR che è direttamente proporzionale alla quantità di modello prima della PCR23. Il terzo metodo rileva la presenza di proteine Wolbachia intracellulari , utilizzando western blot, uno degli strumenti più potenti per rilevare proteine specifiche in miscele complesse combinando l'elevato potere di separazione dell'elettroforesi, la specificità degli anticorpi e la sensibilità delle reazioni enzimatiche cromogeniche. Il metodo finale è un test di immunofluorescenza (IFA) che combina immunologia, biochimica e microscopia per rilevare la proteina di superficie wolbachia (wsp) attraverso una reazione antigene-anticorpo per confermare l'assorbimento cellulare di Wolbachia e determinarne la localizzazione cellulare.

Questo documento descrive i quattro metodi sopra elencati per verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che possono essere utilizzati per rilevare se la Wolbachia esogena è stata trasfetta con successo e la Wolbachia nella cellula è stata eliminata. Dopo aver determinato se Wolbachia è presente nelle cellule o meno, è possibile eseguire una varietà di analisi diverse, tra cui genomica, proteomica o metabolomica. Questo protocollo dimostra il rilevamento di Wolbachia attraverso le cellule Aa23, ma può essere utilizzato anche in altre cellule.

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Protocol

1. Materiali e reagenti

  1. Utilizzare soluzioni e mezzi privi di pirogeni per la coltura cellulare (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Utilizzare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni.
  3. Fare attenzione nella selezione del siero bovino fetale (FBS) per la coltura cellulare, seguendo un processo di controllo dei lotti.
    NOTA: poiché i lotti FBS sono soggetti a modifiche regolari, è impossibile indicare il catalogo e i numeri di lotto pertinenti in questo protocollo.
  4. Selezionare ceppi cellulari Aa23 derivati da uova di A. albopictus , corrispondenti ad Aa23-T senza Wolbachia.

2. Coltura cellulare

  1. Preparare palloni di coltura cellulareda 25 cm 2 con 4 mL di terreno di Schneider con il 10% di FBS.
  2. Incubare i palloni a 28 °C in atmosfera al 5% di CO2 per 5-7 giorni 7,24.
  3. Osservare le cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate nei palloni utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 100x (Figura 1).

3. Estrazione del DNA

  1. Coltivare le cellule per 5-7 giorni fino al 70-80% di confluenza per pallone (fase 2). Raccogliere le cellule con pipettaggio manuale da 1 mL di terreno di coltura risospeso mediante centrifugazione per 5 minuti a 100 × g in una microcentrifuga.
  2. Rimuovere il surnatante per aspirazione e conservare il pellet cellulare risultante a -20 °C.
  3. Risospesare il pellet in 0,40 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), posizionare 50 μL della soluzione in un tubo microcentrifuga, aggiungere 5 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare a 55 °C per 1 ora. Infine, riscaldare questi tubi a 99 °C per 15 minuti per ottenere il DNA grezzo e conservarlo a -20 °C.

4. Rilevazione dell'acido nucleico Wolbachia

  1. Analisi PCR
    1. Eseguire la PCR in un volume di reazione totale di 20 μL, contenente 8 μL di ddH2O, 10 μL di Taq polimerasi (vedere la tabella dei materiali), 1 μL di modello di DNA (dalla fase 3), 0,5 μL di primer avanti e indietro (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') e wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, rispettivamente.
    2. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 °C, ricottura a 55 °C ed estensione a 72 °C; poi, un'estensione finale a 72 °C per 7 min.
    3. Rileva il DNA su un gel di agarosio all'1% (1% p/v di agarosio in PBS) utilizzando un imager gel.
  2. Analisi qPCR
    1. Analizzare la copia del genoma di Wolbachia per tre repliche biologiche (n = 6) dal DNA estratto (fase 3) utilizzando i primer wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') e QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalizzati con primer ribosomiali S6 (RPS6) in avanti e inverso (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' e 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', rispettivamente)3.
    2. Generare una curva standard per wAlbB e RPS6.
      1. Estrarre il DNA dal plasmide ricombinante PMD-18T (un vettore speciale per la clonazione efficiente di prodotti PCR (clonazione TA)) contenente frammenti di geni wsp e rps6 (file supplementare) e misurare la concentrazione di DNA plasmidico (vedere la tabella dei materiali).
      2. Convertire la concentrazione di DNA plasmidico in concentrazione di numero di copie utilizzando Eq (1).
        Numero di copia del plasmide = Equation 1 (1)
      3. Diluire il numero di copie del plasmide da 101 a 108 con acqua ultrapura e impostare 3 repliche per ogni gradiente di concentrazione.
      4. Eseguire l'amplificazione qPCR utilizzando TB Green e un sistema PCR in tempo reale (vedere la Tabella dei materiali) e registrare i risultati di ogni reazione. Utilizzate il valore Ct per sviluppare una curva standard. Analizzare il DNA in un volume di reazione totale di 20 μL, comprendente 7 μL di ddH2O, 10,4 μL di TB Green (vedere la Tabella dei materiali), 1 μL di modello di DNA (fornito dalla fase 3) e 0,8 μL di primer avanti e indietro (10 μM). Utilizzare le seguenti condizioni di reazione: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s e ricottura a 60 °C per 35 s.
      5. Calcola i numeri di copia del gene WSP e RPS6 nelle cellule secondo la curva standard stabilita e la densità relativa di Wolbachia dal numero di copie di wsp / RPS6. Analizzare i dati utilizzando un t-test di campioni indipendenti.
  3. Analisi Western blot della proteina Wolbachia
    1. Estrazione di proteine
      1. Raccogliere 2 × 107 cellule Aa23 e Aa23-T dalla piastra a sei pozzetti (dal punto 2) in un tubo microcentrifuga, lavarle tre volte con PBS e centrifugarle a 100 × g per 5 minuti a 4 °C.
      2. Preparare 1 mL di lisati con tampone di lisi RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desossicolato di sodio, 0,1% sodio dodecil solfato [SDS], 2 mM pirofosfato di sodio, 25 mM β-glicerofosfato, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/mL leupeptina) e PMSF (concentrazione finale 1 mM).
      3. Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al pellet cellulare e mantenere per 30 minuti sul ghiaccio. Centrifugare i lisati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
    2. Analizzare la concentrazione di wsp del surnatante utilizzando un kit di analisi proteica dell'acido bicinchoninico (BCA) (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Caricare quantità uguali di proteine su un gel SDS-PAGE al 15% [10% acqua distillata; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% persolfato di ammonio), 0,04% TEMED].
    4. Trasferire la proteina alle membrane nitrocellulose, bloccare le membrane con il 5% di latte scremato per 2 ore26,27 a temperatura ambiente, quindi lavare le membrane tre volte con TBST (1 mL di Tween 20 in 1 L di TBS) (vedere la Tabella dei materiali).
    5. Incubare le membrane durante la notte a 4 °C con 100 μL di anticorpo policlonale anti-wsp (preparato internamente, vedere File supplementare)), preparato diluendo l'anticorpo primario con il 5% di latte scremato (1:12.000).
    6. Lavare l'anticorpo primario tre volte con TBST.
    7. Incubare le membrane in 100 μL di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) su uno shaker per 1 ora a temperatura ambiente.
    8. Lavare le membrane tre volte con TBST e miscelare 20 μL di soluzione A (HRP Substrate Luminol Reagent) e 20 μL di soluzione B (HRP Substrate Peroxide Reagent) nel kit di rilevamento della chemiluminescenza con un rapporto di 1:1. Immergere contemporaneamente l'intera membrana nella soluzione di luminescenza e osservare i segnali utilizzando un sistema di imaging multifunzionale.
  4. Localizzazione in immunofluorescenza della proteina Wolbachia
    1. Incubare 5 × 105 cellule Aa23 e Aa23-T a 28 °C su una capsula di Petri confocale laser con uno spessore di 0,17 mm nella parte inferiore, sotto un'atmosfera di CO2 al 5% per 3-4 giorni 7,24. Attendere che la cella abbia una confluenza del 60%-70% e lavare le cellule tre volte con PBS.
    2. Fissare le celle per 20 minuti a 4 °C in 1 mL di paraformaldeide al 4% (p/v) in PBS.
    3. Lavare le celle fisse utilizzando PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) per 5 minuti e lavare nuovamente le celle due volte con PBS.
    4. Incubare i vetrini per 1 ora a 37 °C in 1 mL di albumina sierica bovina al 3% (p/v) in PBS.
    5. Incubare i vetrini durante la notte in 100 μL di anticorpo policlonale anti-wsp di topo (preparato internamente) e siero di topo (diluizione 1:1.000 in PBS) in una scatola bagnata (può mantenere l'umidità e impedire l'evaporazione dell'umidità) a 4 °C.
    6. Rimuovere le diapositive dalla scatola bagnata e riportarle a temperatura ambiente; lavarli tre volte con PBS e rimuovere il PBS.
      NOTA: dal passaggio 4.4.7 in poi, tutte le operazioni devono essere protette dalla luce.
    7. Incubare i vetrini con 100 μL di un anticorpo anti-topo di capra coniugato Alexa Fluor 488 (diluizione 1:2.000 in PBS) a 37 °C per 30 min.
    8. Incubare i vetrini campione con 50 μL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI diluito in PBS a 10 μg/mL, si lega fortemente al DNA) a 37 °C per 5 minuti e poi lavarli tre volte con PBS.
    9. Osservare l'immunocolorazione al microscopio confocale.
      1. Accendi l'alimentazione e il laser.
      2. Accendere le normali lampade al mercurio del microscopio.
      3. Avviare il sistema ed eseguire il software operativo. Metti una goccia di olio di cedro sui vetrini del campione, posiziona i vetrini del campione sul palco del microscopio e sposta il palco nella posizione appropriata.
      4. Fare clic sul pulsante di osservazione della lampada al mercurio nel software, aprire l'otturatore della lampada al mercurio e osservare il campione al microscopio invertito per mettere a fuoco.
      5. Utilizzare il pannello di controllo manuale per selezionare la fluorescenza verde e blu per scattare foto a fluorescenza con ingrandimento 100x.
      6. Spegni il pulsante di osservazione della lampada al mercurio e inizia ad acquisire immagini.
      7. Per garantire una buona qualità dell'immagine, eseguire la scansione preliminare in base alle dimensioni della scansione (512 pixel x 512 pixel). Regolare le dimensioni della scansione per ottenere immagini chiare (1.024 pixel x 1.024 pixel).
      8. Eseguire la riduzione del rumore se il rumore di fondo è troppo alto.
      9. Interrompere la scansione e salvare le immagini.
      10. Spegnere la lampada al mercurio e i laser.
      11. Pulire l'obiettivo con il 75% di alcol e abbassare l'obiettivo alla posizione più bassa.
      12. Spegnere l'otturatore e l'alimentazione del microscopio.
      13. Dopo che lo strumento si è raffreddato, coprirlo con il coperchio antipolvere.

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Representative Results

Prima che Wolbachia fosse rilevata , le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare eventuali differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e Aa23-T hanno almeno due morfologie cellulari ma nessuna evidente differenza morfologica tra i due tipi di cellule (Figura 1). Qui, le cellule Aa23 sono state utilizzate come sistema modello per rilevare l'infezione da Wolbachia utilizzando quattro metodi. L'amplificazione positiva del gene Wolbachiawsp utilizzando i primer diagnostici 81F/691R è stata possibile nelle cellule Aa23 (corsie 1 e 2) ma non nelle cellule Aa23-T (corsie 3 e 4) (Figura 2A).. L'analisi della densità di Wolbachia nelle linee cellulari utilizzando qPCR ha mostrato un rapporto wsp/rps6 di 2,4 nelle cellule Aa23 ma nessun Wolbachia nelle cellule Aa23-T (Figura 2B). L'analisi Western blot degli estratti proteici ha mostrato un forte segnale wsp per Aa23 e nessun segnale per Aa23-T (Figura 3A), mentre il test di immunofluorescenza indiretta ha rilevato la proteina wsp (Figura 3B) nelle cellule Aa23 (verde), mentre solo il DNA colorato con DAPI (blu) è stato rilevato nelle cellule Aa23-T.

Figure 1
Figura 1: Microscopia ottica di cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate. La morfologia eterogenea indica che più di un tipo di cellula è presente in entrambe le linee cellulari, come indicato dalle frecce. Barra della scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rilevazione dell'infezione da Wolbachia nelle cellule a livello di acido nucleico. (A) Analisi PCR delle cellule Aa23 e Aa23-T risolta su un gel di agarosio all'1%. Amplificazione PCR positiva del gene Wolbachiawsp utilizzando i primer diagnostici, 81F/691R, osservata nelle cellule Aa23 (Corsie 1 e 2) ma non nelle Cellule Aa23-T (Corsie 3 e 4). (B) Densità di copia di Wolbachia wsp delle cellule Aa23 e Aa23-T. La densità era maggiore nelle cellule Aa23 e non rilevabile nelle cellule Aa23-T. Il numero di copia è stato normalizzato utilizzando Aedes albopictus rps6; i dati sono medi ± SEM, n = 6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rilevazione dell'infezione da Wolbachia nelle cellule a livello proteico. (A) Immunoblotting con anticorpo wsp in cellule Aa23 (Lane 1), con una banda evidente vicina a 25 kDa; Aa23-T (Lane 2), che è stato trattato con tetraciclina. (B) Etichettatura immunofluorescenza delle cellule che mostrano la localizzazione di Wolbachia (verde); le cellule sono state sondate con anticorpi policlonali anti-wsp (Wolbachia), seguiti da anticorpi coniugati Alexa Fluor 488-coniugati anti-topo di capra (verde) e i nuclei (blu) sono colorati con DAPI. Il siero di topo è stato usato come controllo negativo perché l'anticorpo anti-wsp non è stato purificato e l'anticorpo policlonale è stato derivato dal topo. Le cellule Aa23 (Aa23-anti-wsp) infettate da Wolbachia sono indicate con una freccia bianca. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazione: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; M = marcatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare: generazione di plasmidi e preparazione di anticorpi anti-wsp. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia è essenziale per lo studio delle interazioni Wolbachia-ospite e la conferma del successo della trasfezione di cellule con nuovi ceppi. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine. Questi quattro metodi sperimentali hanno corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule da Wolbachia .

La PCR è stata utilizzata per rilevare la presenza di infezione da Wolbachia delle cellule a livello di acido nucleico. Tuttavia, poiché non quantifica i livelli di infezione28,29, la qPCR è stata utilizzata per quantificare la densità di copia del DNA28,30. Poiché l'accuratezza dei metodi PCR può essere influenzata dalla bassa efficienza di amplificazione e dai falsi positivi, è importante garantire una buona qualità del DNA, in particolare per il rilevamento della qPCR, dove i reagenti e i modelli devono essere posizionati sul ghiaccio per prevenire la denaturazione e le operazioni devono essere eseguite secondo metodi standard. La bassa efficienza di amplificazione tende ad essere causata dalla degradazione del reagente nel sistema di reazione, da quantità insufficienti di template e/o da una lunghezza eccessiva di frammenti di primer estesi28. I falsi positivi sono solitamente causati dalla contaminazione di reagenti e modelli, alti livelli di concentrazione di primer e / o strutture di primer a dimero e forcina. Pertanto, è importante assicurarsi che i reagenti siano di alta qualità, che i primer siano ottimizzati in base alla letteratura e che venga utilizzato un software appropriato per la progettazione del primer.

Due metodi sopra descritti rilevano l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico; gli altri due rilevano l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello proteico. Il Western blotting è stato utilizzato per determinare l'infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23 e Aa23-T a livello proteico. I problemi associati a questo metodo sono legati alla preparazione del campione, all'incubazione degli anticorpi e al rilevamento31. I passaggi critici nel processo di rilevamento del western blotting includono l'utilizzo di campioni freschi e completamente lisati e anticorpi secondari corretti, che devono essere convalidati e diluiti secondo le istruzioni a una diluizione di 1:12.000. Secondo i requisiti sperimentali, questo metodo può anche essere combinato con altri metodi di immunizzazione. Pertanto, l'immunofluorescenza è stata utilizzata per localizzare l'infezione intracellulare da Wolbachia31 , perché questo non viene rilevato direttamente utilizzando pcr, qPCR o analisi western blot. Ci sono alcuni passaggi critici da notare sull'immunofluorescenza. In primo luogo, garantire la qualità ottimale dei campioni di cellule ed evitare la contaminazione. La contaminazione delle cellule da bug di colla nera, che può anche essere macchiato, influenzerà seriamente l'interpretazione dei risultati. In secondo luogo, la densità cellulare nelle piastre confocali laser deve essere ~ 60-70%. Infine, il lavaggio con PBS dopo l'incubazione del campione è fondamentale per ottenere immagini di fluorescenza chiare.

Utilizzando metodi quantitativi e visivi relativi e assoluti per rilevare l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine, questo protocollo è più completo e accurato rispetto all'uso di qualsiasi singolo metodo. Inoltre, la costruzione di una curva a doppio standard (per wsp e RPS6) comporta requisiti meno rigorosi per il sistema PCR e l'efficienza di amplificazione e la parziale eliminazione dell'errore sperimentale nell'elaborazione dei dati finali, che riduce notevolmente il lavoro sperimentale. Tuttavia, c'erano alcune limitazioni a questo protocollo. In primo luogo, l'anticorpo anti-wsp è preparato internamente e non è ancora stato commercializzato. In secondo luogo, sebbene non ci fossero bande extra a causa dell'anticorpo policlonale anti-wsp non purificato nel western blotting, che indica la purezza degli anticorpi, il gruppo di controllo negativo che utilizzava il siero di topo aveva anche uno sfondo di fluorescenza verde, che non era favorevole all'interpretazione dei risultati. Mentre l'accuratezza dei metodi western blot e immunofluorescenza può essere migliorata garantendo l'uso di anticorpi purificati o sonde fluorescenti accurate, sono necessari ulteriori studi e analisi di dati empirici. In sintesi, viene riportato un protocollo più completo e accurato per il rilevamento dell'infezione da Wolbachia nelle cellule Aa23 utilizzando quattro metodi utilizzati in precedenti studi su Wolbachia. Il protocollo qui descritto è applicabile alla rilevazione di Wolbachia in altri tipi di cellule e tessuti.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Xin-Ru Wang dell'Università del Minnesota per suggerimenti e indicazioni approfondite. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

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References

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Immunologia e infezione Numero 184
Rilevamento del ceppo <em>Wolbachia</em> wAlbB nelle linee <em>cellulari Aedes albopictus</em>
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Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

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