Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Обнаружение штамма Wolbachia wAlbB в клеточных линиях Aedes albopictus

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Для выявления внутриклеточной вольбахии использовались четыре метода, которые дополняли друг друга и повышали точность обнаружения инфекции Wolbachia Aedes albopictus Aa23 и Aa23-T, вылеченной от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков.

Abstract

Как материнский эндосимбионт, Wolbachia заражает большую часть популяций насекомых. Недавно в исследованиях сообщалось об успешной регуляции передачи РНК-вируса с использованием комаров, транс инфицированных Wolbachia. Ключевые стратегии борьбы с вирусами включают манипулирование размножением хозяина через цитоплазматическую несовместимость и ингибирование вирусных транскриптов посредством иммунного прайминга и конкуренции за ресурсы, полученные от хозяина. Однако основные механизмы реакций комаров, транс инфицированных Вольбахией, на вирусную инфекцию плохо изучены. В этой статье представлен протокол идентификации in vitro инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белка в клетках Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 для улучшения понимания взаимодействий между Wolbachia и ее насекомыми-переносчиками. Благодаря комбинированному использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной ПЦР, западного блоттинга и иммунологических аналитических методов был описан стандартный морфологический протокол для обнаружения клеток, инфицированных Вольбахией, который является более точным, чем использование одного метода. Этот подход также может быть применен к обнаружению инфекции Wolbachia у других таксонов насекомых.

Introduction

Азиатский тигровый комар Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), который является ключевым переносчиком вируса денге (DENV) в Азии и других частях мира1, является естественным хозяином двух типов внутриклеточных бактерий, Wolbachia (wAlbA и wAlbB), которые распределены по всей зародышевой линии и соматической ткани 2,3. Клеточная линия Aa23, полученная из эмбрионов A. albopictus, состоит, по меньшей мере, из двух морфологических типов клеток, оба из которых поддерживают инфекцию4 и могут быть излечены от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков (Aa23-T). Учитывая, что Aa23 сохраняет только wAlbB, это полезная модель для изучения взаимодействий хозяин-эндосимбионт 4,5,6.

Wolbachia передается через мать и заражает, по оценкам, 65% видов насекомых 8,9 и 28% видов комаров10. Он инфицирует различные ткани и формирует интимные симбиотические отношения с хозяином, обычно вызывая цитоплазматическую несовместимость (CI)11 и популяционную замену путем манипулирования репродуктивной системой хозяина12,13. Эти ответы хозяина наблюдались в естественных популяциях Drosophila simulans14 и у A. aegypti в лабораторной клетке и полевых испытаниях15. Важной нерепродуктивной манипуляцией, вызванной Вольбахией, является индуцированная устойчивость хозяина к различным патогенам, включая DENV, вирус чикунгуньи (CHIKV) и вирус Западного Нила (ВЗН)16,17, которые могут быть опосредованы улучшенной врожденной иммунной системой симбионта18,19, конкуренцией между Wolbachia и вирусами за основные ресурсы хозяина20 и манипулированием путями вирусной защиты хозяина21 .

Этот протокол был разработан для изучения этих основных механизмов противовирусных реакций хозяина, вызванных Вольбахией. В нем используются четыре метода выявления внутриклеточной вольбахской инфекции клеток Aa23. Эти методы обеспечивают прочную теоретическую основу для исследований внутриклеточной инфекции Wolbachia других видов хозяев. Первый метод, ПЦР - мощный метод, позволяющий ферментативную амплификацию определенных областей ДНК без использования обычных процедур клонирования - был использован для обнаружения ДНК Wolbachia и определения наличия /отсутствия инфекции Wolbachia 22. Второй метод измеряет плотность копий ДНК Wolbachia с использованием количественной ПЦР (qPCR) для надежного обнаружения и измерения продуктов, генерируемых во время каждого цикла ПЦР, что прямо пропорционально количеству шаблона до ПЦР23. Третий метод обнаруживает наличие внутриклеточных белков Wolbachia , используя западный блот — один из самых мощных инструментов для обнаружения специфических белков в сложных смесях путем сочетания высокой силы разделения электрофореза, специфичности антител и чувствительности хромогенных ферментативных реакций. Окончательным методом является иммунофлуоресцентный анализ (IFA), который сочетает иммунологию, биохимию и микроскопию для обнаружения поверхностного белка Wolbachia (wsp) через реакцию антиген-антитело для подтверждения клеточного поглощения Wolbachia и определения его клеточной локализации.

В этой статье описываются четыре метода, перечисленные выше для проверки существования Wolbachia в клетках, которые могут быть использованы для определения того, была ли экзогенная Wolbachia успешно трансфектирована и Wolbachia в клетке была очищена. После определения того, присутствует ли Вольбахия в клетках или нет, может быть выполнено множество различных анализов, включая геномику, протеомику или метаболомику. Этот протокол демонстрирует обнаружение Wolbachia через клетки Aa23, но также может быть использован в других клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Материалы и реагенты

  1. Используйте безпирогеновые растворы и среды для клеточной культуры (см. Таблицу материалов).
  2. Используйте сверхчистую воду для приготовления всех растворов.
  3. Будьте осторожны при выборе фетальной бычьей сыворотки (FBS) для клеточной культуры после процесса проверки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лоты FBS могут регулярно изменяться, в этом протоколе невозможно указать соответствующий каталог и номера партий.
  4. Выберите штаммы клеток Aa23, полученные из яиц A. albopictus , соответствующие Aa23-T без Wolbachia.

2. Клеточная культура

  1. Приготовьте колбы с культурой25 см2 с 4 мл среды Шнайдера с 10% FBS.
  2. Инкубируют колбы при 28 °C при 5% CO2 атмосферы в течение 5-7 дней 7,24.
  3. Наблюдайте незапятнанные Aa23 и Aa23-T-клетки в колбах с помощью световой микроскопии при 100-кратном увеличении (рисунок 1).

3. Извлечение ДНК

  1. Культивируйте клетки в течение 5-7 дней до 70-80% слияния на колбу (шаг 2). Собирают клетки с ручным пипетированием из 1 мл повторно суспендированной питательной среды методом центрифугирования в течение 5 мин при 100 × г в микроцентрифуге.
  2. Удалите супернатант путем аспирации и храните полученную ячейку гранулы при -20 °C.
  3. Повторно суспендировать гранулы в 0,40 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), поместить 50 мкл раствора в микроцентрифужную пробирку, добавить 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировать при 55 °C в течение 1 ч. Наконец, нагревайте эти трубки при 99 °C в течение 15 мин, чтобы получить сырую ДНК и сохранить ее при -20 °C.

4. Обнаружение нуклеиновой кислоты Wolbachia

  1. ПЦР-анализ
    1. Выполняют ПЦР в общем реакционном объеме 20 мкл, содержащем 8 мкл ddH2O, 10 мкл taq-полимеразы (см. Таблицу материалов), 1 мкл шаблона ДНК (из стадии 3), 0,5 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') и wsp691R (5' AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, соответственно.
    2. Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 35 циклов денатурации при 94 °C, отжиг при 55 °C и удлинение при 72 °C; затем окончательное расширение при 72 °C в течение 7 мин.
    3. Обнаружение ДНК на 1% агарозном геле (1% мас./об.агарозы в PBS) с помощью гелевого тепловизора.
  2. Анализ qPCR
    1. Проанализируйте копию генома Wolbachia на три биологические реплики (n = 6) из извлеченной ДНК (этап 3) с использованием праймеров wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') и QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, нормализованных рибосомальным белком S6 (RPS6) прямыми и обратными праймерами (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' и 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', соответственно)3.
    2. Создайте стандартную кривую для wAlbB и RPS6.
      1. Извлечение ДНК из PMD-18T (специальный вектор для эффективного клонирования продуктов ПЦР (TA клонирование)) рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагменты генов wsp и rps6 (Дополнительный файл) и измерение концентрации плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов).
      2. Преобразуйте концентрацию плазмидной ДНК в концентрацию числа копий с помощью Eq (1).
        Номер копии плазмиды = Equation 1 (1)
      3. Разбавляют число плазмидных копий от 101 до 108 сверхчистой водой, и устанавливают 3 реплики для каждого градиента концентрации.
      4. Выполните амплификацию qPCR с использованием TB Green и системы ПЦР в режиме реального времени (см. Таблицу материалов) и запишите результаты каждой реакции. Используйте значение Ct для разработки стандартной кривой. Проанализируйте ДНК в общем реакционном объеме 20 мкл, включающем 7 мкл ddH2O, 10,4 мкл TB Green (см. Таблицу материалов), 1 мкл шаблона ДНК (предусмотренного этапом 3) и 0,8 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ). Используйте следующие условия реакции: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с и отжиг при 60 °C в течение 35 с.
      5. Рассчитайте количество копий генов WSP и RPS6 в клетках в соответствии с установленной стандартной кривой и относительной плотностью Wolbachia по числу копий wsp/RPS6. Анализируйте данные с помощью независимых образцов t-теста.
  3. Вестерн-блот-анализ белка Wolbachia
    1. Экстракция белка
      1. Соберите 2 × 107 Aa23 и Aa23-T-клеток из шестилуночной пластины (из стадии 2) в микроцентрифужной трубке, промыть их три раза PBS и центрифугировать их при 100 × г в течение 5 мин при 4 °C.
      2. Готовят 1 мл лизатов с буфером лизиса RIPA (50 мМ Tris (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия [SDS], 2 мМ пирофосфата натрия, 25 мМ β-глицерофосфата, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Na3VO4, 0,5 мкг/мл лейпептина) и PMSF (конечная концентрация 1 мМ).
      3. Добавьте 200 мкл буфера лизиса в гранулу клетки и выдерживайте в течение 30 минут на льду. Центрифугируют лизаты при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант.
    2. Анализ концентрации супернатанта wsp с использованием набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Нагрузите равное количество белка на 15% гель SDS-PAGE [10% дистиллированной воды; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% персульфата аммония), 0,04% TEMED].
    4. Перенесите белок на нитроцеллюлозные мембраны, блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в течение 2 ч 26,27 при комнатной температуре, а затем трижды промывайте мембраны TBST (1 мл Tween 20 в 1 л TBS) (см. Таблицу материалов).
    5. Инкубировать мембраны в течение ночи при 4 °C со 100 мкл поликлонального антитела против wsp (приготовленного собственными силами, см. Дополнительный файл)), приготовленного путем разбавления первичного антитела 5% обезжиренным молоком (1:12 000).
    6. Промыть первичное антитело три раза с помощью TBST.
    7. Инкубируют мембраны в 100 мкл пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированного вторичного антитела на шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре.
    8. Промыть мембраны три раза TBST и смешать 20 мкл раствора A (HRP Substrate Luminol Regent) и 20 мкл раствора B (HRP Substrate Peroxide Reagent) в наборе для детектирования хемилюминесценции в соотношении 1:1. Одновременно погрузите всю мембрану в люминесцентный раствор и наблюдайте за сигналами с помощью многофункциональной системы визуализации.
  4. Иммунофлуоресцентная локализация белка Wolbachia
    1. Инкубировать 5 × 105 Aa23 и Aa23-T-клеток при 28 °C на лазерной конфокальной чашке Петри толщиной 0,17 мм на дне, под 5% атмосферой CO2 в течение 3 - 4 дней 7,24. Подождите, пока клетка не сольется на 60%-70% и трижды промыть клетки PBS.
    2. Фиксируйте клетки в течение 20 мин при 4 °C в 1 мл 4% (мас./об.) параформальдегида в PBS.
    3. Промывайте фиксированные ячейки с помощью PBST (0,2% v/v Triton X-100 в PBS) в течение 5 минут и дважды промывайте ячейки PBS.
    4. Инкубировать слайды в течение 1 ч при 37 °C в 1 мл 3% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS.
    5. Инкубируйте слайды в течение ночи в 100 мкл мышиного анти-wsp поликлонального антитела (приготовленного собственными силами) и мышиной сыворотки (1:1000 разведения в PBS) во влажном ящике (он может поддерживать влажность и предотвращать испарение влаги) при 4 °C.
    6. Извлеките слайды из мокрого ящика и верните их к комнатной температуре; вымойте их три раза с PBS и удалите PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этапа 4.4.7 и далее, все операции должны быть защищены от света.
    7. Инкубируйте слайды со 100 мкл конъюгированного козьего антимышьего антитела Alexa Fluor 488 (разведение 1:2000 в PBS) при 37 °C в течение 30 мин.
    8. Инкубируют образцы слайдами с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI разводят в PBS до 10 мкг/мл, прочно связываются с ДНК) при 37 °C в течение 5 мин, а затем промывают их три раза PBS.
    9. Наблюдайте за иммуноокрашиванием под конфокальным микроскопом.
      1. Включите питание и лазер.
      2. Включите обычную и ртутную лампы микроскопа.
      3. Запустите систему и запустите операционное программное обеспечение. Поместите каплю кедрового масла на слайды образца, поместите слайды образца на ступень микроскопа и переместите сцену в соответствующее положение.
      4. Нажмите кнопку наблюдения ртутной лампы в программном обеспечении, откройте затвор ртутной лампы и наблюдайте за образцом под перевернутым микроскопом для фокусировки.
      5. Используйте ручную панель управления для выбора зеленой и синей флуоресценции для получения флуоресцентных фотографий при 100-кратном увеличении.
      6. Выключите кнопку наблюдения ртутной лампы и начните получать изображения.
      7. Чтобы обеспечить хорошее качество изображения, выполните предварительное сканирование по размеру сканирования (512 пикселей x 512 пикселей). Отрегулируйте размер сканирования для получения четких изображений (1 024 x 1 024 пикселя).
      8. Выполните шумоподавление, если фоновый шум слишком высок.
      9. Остановите сканирование и сохраните изображения.
      10. Выключите ртутную лампу и лазеры.
      11. Протрите объектив 75% спиртом и опустите объектив в самое низкое положение.
      12. Выключите затвор и питание микроскопа.
      13. После того, как инструмент остынет, накройте его пылезащитным чехлом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

До того, как Wolbachia была обнаружена, клетки Aa23 и Aa23-T наблюдались под световым микроскопом, чтобы определить любые морфологические различия между двумя клеточными линиями. Aa23 и Aa23-Т-клетки имеют, по крайней мере, две морфологии клеток, но нет очевидной морфологической разницы между двумя типами клеток (рисунок 1).. Здесь клетки Aa23 были использованы в качестве модельной системы для обнаружения инфекции Wolbachia с использованием четырех методов. Положительная амплификация гена Wolbachiawsp с использованием диагностических праймеров 81F/691R была возможна в клетках Aa23 (полосы 1 и 2), но не в Aa23-Т-клетках (lanes 3 и 4) (рисунок 2A). Анализ плотности Wolbachia в клеточных линиях с использованием qPCR показал соотношение wsp/rps6 2,4 в клетках Aa23, но отсутствие Wolbachia в Aa23-T-клетках (рисунок 2B). Западный анализ белковых экстрактов показал сильный сигнал wsp для Aa23 и отсутствие сигнала для Aa23-T (Рисунок 3A),в то время как косвенный иммунофлуоресцентный анализ обнаружил белок wsp (Рисунок 3B) в клетках Aa23 (зеленый), в то время как только ДНК, окрашенная DAPI (синий), была обнаружена в клетках Aa23-T.

Figure 1
Рисунок 1: Световая микроскопия неокрашенных Aa23 и Aa23-Т-клеток. Гетерогенная морфология указывает на то, что в обеих клеточных линиях присутствует более одного типа клеток, как указано стрелками. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обнаружение инфекции Wolbachia в клетках на уровне нуклеиновых кислот. (A) ПЦР-анализ Aa23 и Aa23-Т-клеток, разрешенных на 1% агарозном геле. Положительная ПЦР-амплификация гена Wolbachiawsp с использованием диагностических праймеров , 81F/691R, наблюдалась в клетках Aa23 (полосы 1 и 2), но не в клетках Aa23-T (полосы 3 и 4). (B) Wolbachia wsp плотность копирования Aa23 и Aa23-Т-клеток. Плотность была выше в клетках Aa23 и неопределяема в Aa23-Т-клетках. Номер копии был нормализован с помощью Aedes albopictus rps6; данные являются средними ± SEM, n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Обнаружение инфекции Wolbachia в клетках на уровне белка. (A) Иммуноблоттинг с антителами wsp в клетках Aa23 (Lane 1), с очевидной полосой около 25 кДа; Aa23-T (Lane 2), который лечили тетрациклином. (B) иммунофлуоресцентная маркировка клеток с указанием локализации Wolbachia (зеленый); клетки исследовали поликлональным анти-wsp антителом (Wolbachia), за которым следовали козьи антимышечные (зеленые) Alexa Fluor 488-конъюгированные антитела, а ядра (синие) окрашивались DAPI. Мышиная сыворотка использовалась в качестве отрицательного контроля, потому что антитело против WSP не было очищено, а поликлональное антитело было получено из мыши. Клетки Aa23 (Aa23-anti-wsp), инфицированные Wolbachia , обозначены белой стрелкой. Шкала стержней = 10 мкм. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; M = маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл: Генерация плазмид и препарат антител против wsp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Обнаружение внутриклеточной инфекции Wolbachia имеет важное значение для изучения взаимодействий Wolbachia-host и подтверждения успешной трансфекции клеток с новыми штаммами. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белков. Эти четыре экспериментальных метода подтвердили и улучшили точность обнаружения инфекции Wolbachia в клетках.

ПЦР была использована для выявления наличия инфекции Wolbachia в клетках на уровне нуклеиновых кислот. Однако, поскольку он не дает количественной оценки уровней инфекции 28,29, qPCR был использован для количественной оценки плотности копирования ДНК28,30. Поскольку на точность методов ПЦР могут влиять низкая эффективность амплификации и ложные срабатывания, важно обеспечить хорошее качество ДНК, особенно для обнаружения qPCR, где реагенты и шаблоны должны быть помещены на лед для предотвращения денатурации, а операции должны проводиться в соответствии со стандартными методами. Низкая эффективность амплификации, как правило, вызвана деградацией реагента в реакционной системе, недостаточными количествами шаблона и/или чрезмерной длиной расширенных фрагментов грунтовки28. Ложноположительные результаты обычно вызваны загрязнением реагентов и шаблонов, высоким уровнем концентрации грунтовки и/или структурами грунтовки димера и шпильки. Поэтому важно следить за тем, чтобы реагенты были высокого качества, грунтовки оптимизировались на основе литературы и соответствующего программного обеспечения, используемого для проектирования грунтовки.

Два метода, описанные выше, обнаруживают внутриклеточную инфекцию Wolbachia на уровне нуклеиновых кислот; два других обнаруживают внутриклеточную инфекцию Wolbachia на уровне белка. Вестерн-блоттинг использовался для определения внутриклеточной инфекции Wolbachia клеток Aa23 и Aa23-T на уровне белка. Проблемы, связанные с этим методом, связаны с пробоподготовкой, инкубацией антител и обнаружением31. Критические этапы в процессе обнаружения вестерн-блоттинга включают использование свежих и полностью лизированных образцов и правильных вторичных антител, которые должны быть проверены и разбавлены в соответствии с инструкциями при разведении 1:12 000. Согласно экспериментальным требованиям, этот метод также можно комбинировать с другими методами иммунизации. Поэтому иммунофлуоресценция использовалась для локализации внутриклеточной инфекции Wolbachia31 , потому что это не обнаруживается непосредственно с помощью ПЦР, qPCR или анализа вестерн-блоттинга. Есть несколько важных шагов, которые следует отметить об иммунофлуоресценции. Во-первых, обеспечьте оптимальное качество образцов клеток и избегайте загрязнения. Загрязнение клеток черным клеевым клопом, который также может быть окрашен, серьезно повлияет на интерпретацию результатов. Во-вторых, плотность клеток в лазерных конфокальных тарелках должна составлять ~60-70%. Наконец, промывка PBS после инкубации образца имеет решающее значение для получения четких флуоресцентных изображений.

Используя относительные и абсолютные количественные и визуальные методы для выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белка, этот протокол является более всеобъемлющим и точным, чем использование любого отдельного метода. Кроме того, построение кривой двойного стандарта (для wsp и RPS6) приводит к менее жестким требованиям к системе ПЦР и эффективности амплификации и частичному устранению экспериментальной ошибки в окончательной обработке данных, что значительно сокращает экспериментальную работу. Однако у этого протокола были некоторые ограничения. Во-первых, анти-wsp антитело готовится собственными силами и еще не коммерциализировано. Во-вторых, хотя не было никаких дополнительных полос из-за неочищенного поликлонального антитела против WSP в западном блоттинге, что указывает на чистоту антител, отрицательная контрольная группа, использующая сыворотку мыши, также имела зеленый фон флуоресценции, что не способствовало интерпретации результатов. В то время как точность методов вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции может быть улучшена путем обеспечения использования очищенных антител или точных флуоресцентных зондов, требуется дальнейшее изучение и анализ эмпирических данных. Таким образом, сообщается о более полном и точном протоколе обнаружения инфекции Wolbachia в клетках Aa23 с использованием четырех методов, используемых в предыдущих исследованиях Wolbachia. Протокол, описанный здесь, применим к обнаружению Wolbachia в других типах клеток и тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Синь-Ру Вана из Университета Миннесоты за проницательные предложения и рекомендации. Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 184
Обнаружение <em>штамма Wolbachia</em> wAlbB в <em>клеточных линиях Aedes albopictus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter