Summary
Detta protokoll presenterar och beskriver steg för isolering, dissektion, odling och färgning av retinala explanter erhållna från en vuxen mus. Denna metod är fördelaktig som en ex vivo-modell för att studera olika retinala neurovaskulära sjukdomar såsom diabetisk retinopati.
Abstract
En av utmaningarna inom näthinneforskningen är att studera korssamtalet mellan olika näthinneceller som retinala nervceller, gliaceller och kärlceller. Isolerande, odling och upprätthållande av retinala neuroner in vitro har tekniska och biologiska begränsningar. Odling av retinala explanter kan övervinna dessa begränsningar och erbjuda en unik ex vivo-modell för att studera korssamtalet mellan olika retinala celler med välkontrollerade biokemiska parametrar och oberoende av kärlsystemet. Dessutom är retinala explanter ett effektivt screeningverktyg för att studera nya farmakologiska ingrepp i olika retinala vaskulära och neurodegenerativa sjukdomar som diabetisk retinopati. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för retinala explanters isolering och odling under en längre period. Manuskriptet presenterar också några av de tekniska problemen under denna procedur som kan påverka de önskade resultaten och reproducerbarheten av retinal explantkultur. Immunfärgningen av retinalkärlen, gliacellerna och neuronerna visade intakta retinala kapillärer och neuroglialceller efter 2 veckor från början av retinal explantkulturen. Detta etablerar retinala explants som ett pålitligt verktyg för att studera förändringar i retinal vaskulatur och neuroglialceller under förhållanden som efterliknar retinala sjukdomar som diabetisk retinopati.
Introduction
Olika modeller har presenterats för att studera näthinnesjukdomar, inklusive både in vivo- och in vitro-modeller. Användningen av djur i forskning är fortfarande en fråga om kontinuerlig etisk och translationell debatt1. Djurmodeller som involverar gnagare som möss eller råttor används ofta i näthinneforskning 2,3,4. Kliniska problem har emellertid uppstått på grund av näthinnans olika fysiologiska funktioner hos gnagare jämfört med människor, såsom frånvaron av makula eller skillnader i färgvision5. Användningen av mänskliga postmortemögon för näthinneforskning har också många problem, inklusive men inte begränsat till skillnader i den genetiska bakgrunden för de ursprungliga proverna, givarnas medicinska historia och givarnas tidigare miljöer eller livsstilar6. Dessutom har användningen av in vitro-modeller i retinal forskning också vissa nackdelar. Cellodlingsmodeller som används för att studera näthinnesjukdomar inkluderar användning av cellinjer av mänskligt ursprung, primära celler eller stamceller7. De cellodlingsmodeller som används har visat sig ha problem när det gäller att vara förorenade, felidentifierade eller dedifferentierade 8,9,10,11. Nyligen har retinal organoidteknik visat betydande framsteg. Konstruktionen av mycket komplexa näthinnor in vitro har emellertid flera begränsningar. Till exempel har retinala organoider inte samma fysiologiska och biokemiska egenskaper som mogna in vivo näthinnor. För att övervinna denna begränsning måste retinal organoidteknik integrera mer biologiska och cellulära egenskaper, inklusive glattmuskelceller, vaskulatur och immunceller som microglia12,13,14,15.
Organotypiska retinala explanter har framstått som ett pålitligt verktyg för att studera näthinnesjukdomar som diabetisk retinopati och degenerativa näthinnesjukdomar16,17,18,19. Jämfört med andra befintliga tekniker stöder användningen av retinala explanter både in vitro-retinala cellkulturer och även nuvarande in vivo-djurmodeller genom att lägga till en unik funktion för att studera korssamtalet mellan olika retinala celler under samma biokemiska parametrar och oberoende av systemiska variabler. Explantkulturerna tillåter att olika retinala celler hålls ihop i samma miljö, vilket möjliggör bevarande av retinala intercellulära interaktioner20,21,22. Dessutom visade en tidigare studie att retinala explanter kunde bevara den morfologiska strukturen och funktionaliteten hos de odlade retinala cellerna23. Således kan retinala explanter ge en anständig plattform för att undersöka möjliga terapeutiska mål för en mängd olika näthinnesjukdomar24,25,26. Retinala explantkulturer ger en kontrollerbar teknik och är mycket flexibla substitut för befintliga mothods som tillåter många farmakologiska manipuleringar och kan avslöja flera molekylära mekanismer27.
Det övergripande målet med denna uppsats är att presentera retinal explant-tekniken som ett rimligt mellanliggande modellsystem mellan in vitro-cellkulturer och in vivo-djurmodeller . Denna teknik kan efterlikna retinala funktioner på ett bättre sätt än dissocierade celler. Eftersom olika näthinneskikt förblir intakta kan de retinala intercellulära interaktionerna bedömas i laboratoriet under välkontrollerade biokemiska förhållanden och oberoende av kärlsystemets funktion28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Oakland University, Rochester, MI, USA och följde de riktlinjer som fastställts av Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
1. Beredning av djur
- Håll djuren inrymda under en konstant temperatur i en ljuskontrollerad miljö. Temperaturinställningarna för djurhållningsrummet bör följa riktlinjerna i "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". Temperaturintervallet för möss är mellan 18 °C och 26 °C. Håll luftfuktigheten kontrollerad och inställd på cirka 42%.
- För detta experiment, använd manliga C57BL / 6J-möss (kontrollera materialtabellen för detaljer) som är mer än 12 veckors ålder (en vuxen mus användes för detta protokoll).
OBS: En vildtypstam användes i detta protokoll för demonstrationen, eftersom den inte hade några genetiska avvikelser som påverkade näthinnan. Man kan dock använda andra stammar, inklusive genetiskt manipulerade stammar, för retinal explantkultur. - Ge 12 timmars ljus/mörker cykler via belysningsstyrning i djurstallarna.
- Inspektera varje djur för hälsa och adekvat mat- och vattenintag två gånger per dag under veckan och en gång per dag på helgerna. Se till att ge dem färsk mat och rent vatten.
- Om mat- och vattennivåerna är låga under veckan, skölj vattenflaskan och fyll på den. Lägg till färsk mat när det behövs. Byt smutsiga burar dagligen eller efter behov för djurens hälsa.
OBS: För att studera fotoreceptorerna och ljusinducerade förändringar i näthinnan, mörkanpassa mössen över natten i en speciell mörk låda i ett mörkt rum i djuranläggningen. - Avliva djuren i deras hembur genom co 2-inandningsöverdos med komprimerad CO 2-gas i cylindrar anslutna till en CO 2-kammare. Utför dödsbekräftelse med hjälp av en sekundär metod för eutanasi som cervikal dislokation.
- Efter avslutad procedur, bekräfta djurdöden med en lämplig metod, såsom att bekräfta hjärt- och andningsstopp eller observera fasta och dilaterade pupiller hos djuret.
2. Vävnadsberedning
- När djuret har avlivats, rengör området med 70% etanol. Öppna sedan ögonlocken med en hand så att ögat syns. Applicera tryck på de överlägsna och underlägsna delarna av banan med motsatt hand med hjälp av böjda pincett tills jordklotet sticker ut.
- För att enukcleate ögat, stäng försiktigt pincetten på den bakre delen av ögat och höj i en kontinuerlig rörelse. Använd pincett och håll ögongloben från optisk nerv. Se till att använda steriliserade dissektionsverktyg för alla steg och att arbeta under fullständiga aseptiska förhållanden.
- Sänk ner varje ögonglob i ett 1,5 ml rör som innehåller 1 ml iskall HBSS med penicillin-streptomycin (10 000 U/ml). Tvätta ögongloben i HBSS två gånger i 5 min vardera.
- Överför ögongloben till ett 1,5-2 ml rör som innehåller komplett media (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamin och 1% penicillin och streptomycin).
3. Vävnadsdissektion
- Dissekera ut näthinnan noggrant under ett operationsmikroskop, vilket illustreras sekventiellt i figur 1.
- Gör ett omkretssnitt runt limbus för att öppna ögongloben. Ta bort hornhinnan genom att cirkulärt dissekera längs hornhinnans kant och det (limbala) snittet, följt av att ta bort det främre segmentet, linsen och glaskroppen och lämna en tom ögonkopp.
- Genom att hålla området för det optiska nervhuvudet med fina pincett, dra försiktigt av ögonlocket. Var mycket uppmärksam under avlägsnandet av ytterrocken för att inte skada den neurala näthinnan och för att säkerställa att näthinnan förblir helt intakt.
OBS: Näthinnan måste försiktigt skalas bort från retinalpigmentepitelet (RPE), och ett enda snitt vid synnervhuvudet måste utföras för att lossa näthinnan från synnerven. Visuellt säkerställa detta genom att identifiera hålet som lämnas av synnerven (det optiska nervhuvudet). - Dissekera näthinnan radiellt i fyra lika stora bitar.
- Följ stegen nedan för att hantera de små bitarna av näthinnan för att säkerställa korrekt orientering av retinalkulturen.
- Använd ett dissekerande saxblad, öppna precis under näthinnebiten (Materialtabell).
- Lyft långsamt näthinnestycket med spetsen på ett öppet saxblad och överför det försiktigt till odlingsplattan.
- Överför explanterna som härrör från den isolerade näthinnan separat till cellodlingsinsatser i en 12-brunnsplatta, var och en innehållande 300 μL retinal explantmedia, med retinal ganglioncellsidan (neuroretina) uppåt.
OBS: Se till att mediet är DMEM-media med N2- och B27-tillskott. Tillsätt penicillin-streptomycin (10 000 U/ml) till mediet också (materialtabell). Näthinnan bildas av flera lager av neuronala celler sammankopplade via synapser och stöds från utsidan av det pigmenterade skiktet av retinalt pigmentepitel, vilket är det svarta skiktet som avlägsnades under dissektionen. - Ta bort eventuella rester av det pigmenterade epitelet; Dessa rester kan dock hjälpa till att identifiera den korrekta orienteringen av explanten. Se till att den pigmenterade delen är vänd nedåt och att den icke-pigmenterade delen är vänd uppåt.
- Inkubera retinal explantkultur i fuktade inkubatorer vid 37 °C och 5%CO2.
- Se till att näthinnans yta är vänd uppåt. Om näthinnestycket är vänt eller vikt, försök att justera det försiktigt till rätt orientering.
OBS: Var mycket uppmärksam på den korrekta orienteringen av retinal explant i odlingsplattan. Undvik vändning eller vikning av explanten i odlingsplattan eftersom detta kommer att resultera i misslyckande av korrekt tillväxt av näthinnecellerna i odling.
4. Retinal explantkultur
- Behåll retinala explantkulturer (beredda i steg 3.2-3.3) i fuktade inkubatorer vid 37 °C och 5%CO2.
- Byt hälften av media från varje brunn varannan dag i 2 veckor. Gör detta genom att pipettera 150 μL från brunnen noggrant. Tillsätt sedan 150 μl färskt media tillbaka i brunnen. Undvik att vända explanten när du byter media.
- Kontrollera explanten noggrant under mikroskopet innan du sätter tillbaka odlingsplattan i inkubatorn. Undersök cellernas integritet och retinalarkitekturen under ett ljusfältmikroskop. Se till att explanten fortfarande är korrekt orienterad. Använd både 4x och 20x objektivlinser för att undersöka explanten.
OBS: Undvik fullständig nedsänkning av explanten i media.
5. Immunhistokemi
- Efter 2 veckor, fixa retinal explant genom att ta bort media. Gör detta genom att först tvätta en gång med 200 μL 1x PBS och sedan tillsätta 300 μL 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS, pH 7,4, till brunnen som innehåller explanten och lämna den över natten.
OBS: Detta steg kan göras utan att ta bort odlingsinsatserna från plattan. Explanterna kan också överföras till ett 500 μL koniskt rör, och tvätt och fixering kan göras inuti röret. - Överför explanten till ett 500 μL koniskt rör innehållande 300 μL 1x PBS-2,5% Triton X för tvätt.
- Tvätta de fasta explanterna i röret tre gånger i 5 minuter vardera med medelhastighet på en skakapparat (25 rpm).
- Blockera de förväntade ospecifika reaktionerna genom att inkubera explanten med 300 μL 1x blockerande buffert innehållande 0,02% tiomerosal i 1 timme vid rumstemperatur före antikroppsinkubationen.
- Inkubera de fasta explanterna med de primära antikropparna över natten vid 4 °C med medelhastighet på en skakapparat.
OBS: Upptäck näthinnans endotelceller i den fasta explanten genom färgning med GSL I, BSL I antikropp (lektin) (7: 1,000). Upptäck gliacellerna i retinala explanter genom färgning med kanin glial fibrillär surt protein (GFAP) antikropp (1:250). Upptäck näthinnans nervceller genom att färga explanten med kanin NeuN-antikropp (1:250)29,30. Inkubera s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explanterar med lektin, NeuN-kombinationen, och inkubera andra med lektin, GFAP-kombinationen. - Nästa dag, ta bort den primära antikroppen från rören genom aspiration med en pipett. Tvätta explanterna med 1x PBS-2,5% Triton X tre gånger i 5 min vardera med medelhastighet på en shaker.
- Lägg till de sekundära antikropparna: Get anti-Rabbit IgG (1:500) (sekundär för GFAP och NeuN) och Texas Red (7:1,000) (för lektin). Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med medelhastighet på en shaker.
OBS: De sekundära antikropparna är ljuskänsliga, så täck röret med aluminiumfolie. - Ta bort de sekundära antikropparna genom aspiration och tvätta sedan tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS-2,5% Triton X.
- Överför explanten från röret till en glasskiva med en överföringspipett. Ta bort eventuell överskottsvätska på bilden och tillsätt sedan en droppe monteringsmedia med DAPI till bilden.
- Täck vävnaden med en täckglas. Låt inga luftbubblor mellan täckglaset och vävnaden.
- Ta de färgade bilderna till fluorescensmikroskopet och börja ta bilderna. Det är viktigt att täcka de färgade bilderna med en glidlåda eftersom fluorescensfärgningen är ljuskänslig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överlevnad av de neuronala och vaskulära näthinnecellerna i retinal explanta i odlingsmedier ex vivo under en längre tid
Genom att odla en retinal explant med hjälp av vårt protokoll lyckades vi upprätthålla olika retinala celler som var livskraftiga i upp till 2 veckor. För att verifiera närvaron av olika retinala celler utfördes immunofluorescensfärgning av retinal explant med hjälp av en neuronal cellmarkör (NeuN), glialcellmarkör (GFAP) och vaskulär markör (isolektin-B4) (Figur 2). Färgningen visade välorganiserade och välutvecklade retinala neuroner och glialceller. Dessutom var retinala blodkärl strukturellt intakta, vilket indikeras av isolektin-B4-färgningen. Den morfologiska integriteten hos retinal explant, vilket demonstrerades av immunfärgningen, indikerade att retinal explantkulturen var framgångsrik för att upprätthålla livskraftiga retinala celler som experimentellt kunde användas som modell. De olika experimentella betingelserna som ska studeras med hjälp av explanten kan utvärderas och analyseras genom immunofluorescensfärgning för flera cellulära markörer med hjälp av ImageJ-programvaran. Immunostaining möjliggör mätning av nivåerna av immunreaktivitet hos varje cellulär markör och av antalet specifika celler, såsom antalet retinala ganglionceller eller fotoreceptorer, bland olika experimentella grupper.
Betydelsen av korrekt orientering av retinal explant i odlingsplattan för de experimentella resultaten
Den korrekta orienteringen av retinal explant i odlingsplattan uppnås genom att inkubera neuroretina uppåt. Å andra sidan kan misslyckande av retinal explant bero på att vända eller vika näthinnevävnaden, vilket får neuroretina att vända nedåt. Immunofluorescensfärgningen av den odlade retinala explanten efter 2 veckor med användning av olika retinala markörer som det tidigare experimentet (NeuN, GFAP och isolectin-B4) visade att misslyckandet med korrekt explantorientering resulterar i misslyckandet av korrekt utveckling av det neurovaskulära elementet (Figur 3).
Figur 1: Steg för att dissekera ögongloben för att skapa retinal explant . (a) Den enucleated ögongloben nedsänks i mediet omedelbart efter att ha tagits bort från djuret. (b) Ett omkretssnitt görs längs limbus för att öppna ögongloben. c) Hornhinnan avlägsnas genom dissekering längs det limbala snittet. (d) Genom att hålla synnerven med fina tångar skalas ögats yttre skikt försiktigt av. e) Linsen, glaskroppen och den ciliära kroppen avlägsnas. (F) Endast den neurala näthinnan är kvar. (g) Fyra radiella snitt görs i näthinnan för att underlätta att den skärs i nästa steg. h) Näthinnan kan skäras i två eller fyra delar och sedan överföras till cellodlingsplattan som innehåller insatsen och mediet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Framgångsrik retinal explantkultur med bevarad retinal struktur. Immunofluorescensfärgning av retinala explanter som hade stannat i kulturen i 2 veckor. Explanterna fixerades och färgades med (a) NeuN för retinala neuroner (grön) och isolektin-B4 för blodkärl (röd) och (b) GFAP för gliaceller (grön) och isolektin-B4 för blodkärl (röd). Färgningen visade välutvecklade retinala celler och retinala kärl. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Misslyckad retinal explantkultur med defekta, underutvecklade retinala celler. Immunofluorescensfärgning av retinala explanter som hade stannat i kulturen i två veckor. Explanterna fixerades och färgades med GFAP för gliaceller (grön) och isolektin-B4 för blodkärl (röd). Bilderna visar defekt färgning och underutvecklade näthinneceller och näthinnekärl. Retinal explanten var vikad och var inte orienterad korrekt i odlingsplattan. Stor uppmärksamhet bör ägnas åt att säkerställa korrekt orientering av explanten med näthinnan uppåt. Underlåtenhet att sätta retinal explant i rätt riktning kommer att leda till misslyckande av den korrekta utvecklingen av explanten. Skalstreck = 100 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt laboratorium har studerat de patofysiologiska förändringarna som främjar retinal mikrovaskulär dysfunktion i år 31,32,33,34,35,36. Retinala explanter är en av de tekniker som kan vara av stort värde att använda som modell för att studera näthinnesjukdomar som diabetisk retinopati eller degenerativa näthinnesjukdomar. Att ha en kontrollgrupp härledd från samma enda näthinna eller djur som den behandlade gruppen eller grupperna ger denna teknik en stor fördel när det gäller att ge mer tillförlitliga jämförelser av olika experimentella förhållanden.
En av de största utmaningarna under retinal explantberedning är vikningen av explanten eller fel orientering i odlingsplattan med näthinneytan nedåt. Andra forskare föreslog att pipettera näthinnan upp och ner i den överförande pipetten för att ha den i rätt riktning i plattan37. Men i sitt protokoll använde de hela näthinnan för en enda explant, men i detta protokoll skars en enda näthinna i två till fyra bitar, vilket innebär att bitarna är mindre och det är svårt att göra denna manöver för rätt orientering. Att skära en enda näthinna i två till fyra bitar gör att fyra till åtta retinala bitar kan erhållas från samma djur som kan användas för ett experiment. Detta möjliggör experiment där kontrollgruppen och experimentgrupperna härrör från samma djur.
Att skära näthinnan i små bitar gör dock hanteringen av den mer utmanande. Därför utvecklade vi en teknik för att hantera dessa små näthinnebitar för att säkerställa korrekt orientering av näthinnekulturen. För att göra detta placeras det öppna dissekerande saxbladet strax under näthinnestycket, med näthinneytan uppåt. Om näthinnestycket vänds eller viks, justeras det försiktigt till rätt riktning. Långsamt höjs näthinnestycket med spetsen på ett öppet saxblad och läggs försiktigt i odlingsplattan. Denna enkla teknik säkerställer att varje retinal bit är i rätt riktning med näthinnan uppåt och främjar bättre resultat för att studera retinala kärl och neuroglialceller (figur 2). Underlåtenhet att placera retinal explanten i rätt riktning med neuroretina uppåt kommer att resultera i misslyckande av korrekt tillväxt av retinalcellerna i odling, som visas i figur 3. Korrekt utbildning rekommenderas starkt för att undvika detta tekniska fel.
Detta protokoll beskriver en organotypisk retinal explant av en vuxen mus näthinna; Men tekniken har också tidigare beskrivits för både omogna musnäthinnor37 och mänskliga näthinnor38. I en tidigare studie beskrevs retinala explantkulturer för att studera vaskulär utveckling, där endotelfunktionsmanipulation möjliggjordes ex vivo27. Som ett exempel på den morfologiska bedömningen av en retinal explant lämnades retinal explant i odling i 2 veckor, och sedan utfördes immunfärgning med användning av NeuN (neuronal cellmarkör), GFAP (glialcellmarkör) och isolectin-B4 (vaskulär markör). Färgningen visade att näthinnecellerna och blodkärlen var välutvecklade och välbevarade i explanten (figur 2). Emellertid, mer immunohistokemi färgningsdata kan erhållas för att kontrollera livskraften och funktionaliteten hos andra retinala celler i explanten också.
Själva explantkulturen kan vara stressande för näthinnecellerna. Cellerna kunde emellertid inkuberas under relativt normala förhållanden så att de morfologiska förändringar som inträffade under olika experimentella förhållanden, såsom hyperglykemi eller hypoxi, kunde jämföras med baslinjetillståndet. Explanten representerar således ett bra verktyg för att utvärdera olika retinala celler och testa deras svar på olika farmakologiska medel eller terapeutiska mål samtidigt i en mängd olika retinala sjukdomar.
Retinal neovaskularisering är ett kardinalt tecken på ischemisk retinopati, såsom i retinopati av prematuritet och diabetisk retinopati. Vi (figur 2) och andra 27,39,40,41,42 kunde observera intakt retinal vaskulatur i odlade explanter i upp till 2 veckor. Således har retinal explant använts för att studera patofysiologin för både normal och patologisk retinal neovaskularisering 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Intressant nog registrerade en forskargrupp VEGF-inducerad vaskulär spridning i musretinala explanter medan de undersökte de proangiogena faktorerna som är förhöjda i proliferativ diabetisk retinopati43. Dessutom har retinala explanter varit inbäddade i en tredimensionell gel, vilket möjliggör studier av spridning av retinala endotelceller i en mer detaljerad spatiotemporal orientering45,46,47.
Förutom morfologiska studier används retinala explanter också i viss utsträckning för att utvärdera retinala funktioner50,51,52,53. Ex vivo elektroretinogram (ERG) avbildning har utförts på isolerade mus retinala explanter, vilket möjliggör studier av de olika funktionerna hos en mängd olika retinala celler, inklusive både stav- och konfotoreceptorer54,55,56,57. rapporterade att, som svar på hög glukosbehandling, retinala explantkulturer härledda från antingen möss eller råttor visade en alltmer minskad tjocklek på näthinneskikten58. Retinala bipolära celler, som är bland de tidigaste känsliga cellerna för diabetiska tillstånd, behöll emellertid inte bara sin morfologi utan också sina elektrofysiologiska egenskaper i odling i upp till 2 veckor58. Sammanfattningsvis tror vi att detta protokoll kan vara en bas eller en utgångspunkt för ytterligare framtida studier för att optimera fördelarna med explantanvändning i ögonforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka National Institute of Health (NIH) finansieringsbidrag till National Eye Institute (R01 EY030054) till Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Vi vill tacka Kathy Wolosiewicz för att hon hjälpte oss med videoberättelsen. Vi vill tacka Dr. Ken Mitton från Eye Research Institute's Pediatric Retinal Research lab, Oakland University, för hans hjälp under användningen av det kirurgiska mikroskopet och inspelningen. Den här videon redigerades och regisserades av Dr. Khaled Elmasry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
References
- Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
- Fletcher, E. L., et al.
- Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
- Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
- Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
- Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
- Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
- Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
- Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
- Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
- Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
- Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
- Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
- Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
- Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
- Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
- Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
- Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
- Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
- Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
- Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
- Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
- Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
- Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
- Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
- Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
- Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
- Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
- Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
- Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
- Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
- Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).
