Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.
Retina araştırmalarındaki zorluklardan biri, retinal nöronlar, glial hücreler ve vasküler hücreler gibi farklı retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemektir. Retinal nöronların in vitro olarak izole edilmesi, kültürlenmesi ve sürdürülmesinin teknik ve biyolojik sınırlamaları vardır. Retinal eksplantların kültürlenmesi bu sınırlamaların üstesinden gelebilir ve iyi kontrol edilen biyokimyasal parametrelere sahip ve vasküler sistemden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir ex vivo model sunabilir. Ayrıca, retinal eksplantlar, diyabetik retinopati gibi çeşitli retinal vasküler ve nörodejeneratif hastalıklarda yeni farmakolojik müdahaleleri incelemek için etkili bir tarama aracıdır. Burada, retinal eksplantların izolasyonu ve kültürü için uzun bir süre için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Makale ayrıca bu işlem sırasında retinal eksplant kültürünün istenen sonuçlarını ve tekrarlanabilirliğini etkileyebilecek bazı teknik problemleri de sunmaktadır. Retinal damarların, glial hücrelerin ve nöronların immün boyaması, retinal eksplant kültürünün başlangıcından itibaren 2 hafta sonra sağlam retinal kılcal damarları ve nöroglial hücreleri gösterdi. Bu, retinal eksplantları, diyabetik retinopati gibi retinal hastalıkları taklit eden koşullar altında retinal vaskülatür ve nöroglial hücrelerdeki değişiklikleri incelemek için güvenilir bir araç olarak kurar.
Retina hastalıklarını incelemek için hem in vivo hem de in vitro modeller de dahil olmak üzere farklı modeller sunulmuştur. Hayvanların araştırmalarda kullanımı hala sürekli bir etik ve çeviri tartışması konusudur1. Fareler veya sıçanlar gibi kemirgenleri içeren hayvan modelleri, retinal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3,4. Bununla birlikte, kemirgenlerde retinanın insanlara kıyasla farklı fizyolojik fonksiyonları nedeniyle, makulanın yokluğu veya renk vizyonundaki farklılıklar gibi klinik kaygılar ortaya çıkmıştır5. Retinal araştırmalar için insan postmortem gözlerinin kullanımı, orijinal örneklerin genetik arka planlarındaki farklılıklar, bağışçıların tıbbi geçmişi ve bağışçıların önceki ortamları veya yaşam tarzları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok soruna sahiptir6. Ayrıca, retinal araştırmalarda in vitro modellerin kullanılmasının da bazı dezavantajları vardır. Retina hastalıklarını incelemek için kullanılan hücre kültürü modelleri, insan kökenli hücre hatlarının, birincil hücrelerin veya kök hücrelerin kullanımını içerir7. Kullanılan hücre kültürü modellerinin kontamine olma, yanlış tanımlanma veya farklılaşmama açısından problemleri olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Son zamanlarda, retinal organoid teknolojisi önemli ilerleme göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak oldukça karmaşık retinaların yapımının birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, retinal organoidler olgun in vivo retinalarla aynı fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere sahip değildir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, retinal organoid teknolojisi, düz kas hücreleri, vaskülatür ve mikroglia12,13,14,15 gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere daha fazla biyolojik ve hücresel özelliği entegre etmelidir.
Organotipik retinal eksplantlar, diyabetik retinopati ve dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için güvenilir bir araç olarak ortaya çıkmıştır16,17,18,19. Mevcut diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, retinal eksplantların kullanımı, aynı biyokimyasal parametreler altında ve sistemik değişkenlerden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir özellik ekleyerek hem in vitro retinal hücre kültürlerini hem de mevcut in vivo hayvan modellerini desteklemektedir. Eksplant kültürleri, farklı retina hücrelerinin aynı ortamda bir arada tutulmasına izin vererek retinal hücreler arası etkileşimlerin korunmasını sağlar20,21,22. Ayrıca, önceki bir çalışma, retinal eksplantların kültürlenmiş retina hücrelerinin morfolojik yapısını ve işlevselliğini koruyabildiğini göstermiştir23. Böylece, retinal eksplantlar çok çeşitli retina hastalıkları için olası terapötik hedefleri araştırmak için iyi bir platform sağlayabilir24,25,26. Retinal eksplant kültürleri kontrol edilebilir bir teknik sağlar ve çok sayıda farmakolojik manipülasyona izin veren ve çeşitli moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilen mevcut güvelerin yerine çok esnek bir alternatiftir27.
Bu makalenin genel amacı, retinal eksplant tekniğini in vitro hücre kültürleri ile in vivo hayvan modelleri arasında makul bir ara model sistem olarak sunmaktır. Bu teknik, retina fonksiyonlarını ayrışmış hücrelerden daha iyi bir şekilde taklit edebilir. Çeşitli retina tabakaları bozulmadan kaldığından, retinal hücreler arası etkileşimler laboratuarda iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullar altında ve vasküler sistemin işleyişinden bağımsız olarak değerlendirilebilir28.
Laboratuvarımız31,32,33,34,35,36 yıldır retinal mikrovasküler disfonksiyonu destekleyen patofizyolojik değişiklikleri incelemektedir. Retinal eksplantlar, diyabetik retinopati veya dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanılması çok değerli olabilecek t…
The authors have nothing to disclose.
Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Ulusal Göz Enstitüsü’ne (R01 EY030054) Dr. Mohamed Al-Shabrawey’e Finansman Hibesi olarak teşekkür ederiz. Video anlatımında bize yardımcı olduğu için Kathy Wolosiewicz’e teşekkür ederiz. Oakland Üniversitesi Göz Araştırma Enstitüsü’nün Pediatrik Retinal Araştırma Laboratuvarı’ndan Dr. Ken Mitton’a cerrahi mikroskop kullanımı ve kayıt sırasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu video Dr. Khaled Elmasry tarafından düzenlenmiş ve yönetilmiştir.
Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |