Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute, Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Abstract

Retina araştırmalarındaki zorluklardan biri, retinal nöronlar, glial hücreler ve vasküler hücreler gibi farklı retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemektir. Retinal nöronların in vitro olarak izole edilmesi, kültürlenmesi ve sürdürülmesinin teknik ve biyolojik sınırlamaları vardır. Retinal eksplantların kültürlenmesi bu sınırlamaların üstesinden gelebilir ve iyi kontrol edilen biyokimyasal parametrelere sahip ve vasküler sistemden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir ex vivo model sunabilir. Ayrıca, retinal eksplantlar, diyabetik retinopati gibi çeşitli retinal vasküler ve nörodejeneratif hastalıklarda yeni farmakolojik müdahaleleri incelemek için etkili bir tarama aracıdır. Burada, retinal eksplantların izolasyonu ve kültürü için uzun bir süre için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Makale ayrıca bu işlem sırasında retinal eksplant kültürünün istenen sonuçlarını ve tekrarlanabilirliğini etkileyebilecek bazı teknik problemleri de sunmaktadır. Retinal damarların, glial hücrelerin ve nöronların immün boyaması, retinal eksplant kültürünün başlangıcından itibaren 2 hafta sonra sağlam retinal kılcal damarları ve nöroglial hücreleri gösterdi. Bu, retinal eksplantları, diyabetik retinopati gibi retinal hastalıkları taklit eden koşullar altında retinal vaskülatür ve nöroglial hücrelerdeki değişiklikleri incelemek için güvenilir bir araç olarak kurar.

Introduction

Retina hastalıklarını incelemek için hem in vivo hem de in vitro modeller de dahil olmak üzere farklı modeller sunulmuştur. Hayvanların araştırmalarda kullanımı hala sürekli bir etik ve çeviri tartışması konusudur1. Fareler veya sıçanlar gibi kemirgenleri içeren hayvan modelleri, retinal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3,4. Bununla birlikte, kemirgenlerde retinanın insanlara kıyasla farklı fizyolojik fonksiyonları nedeniyle, makulanın yokluğu veya renk vizyonundaki farklılıklar gibi klinik kaygılar ortaya çıkmıştır5. Retinal araştırmalar için insan postmortem gözlerinin kullanımı, orijinal örneklerin genetik arka planlarındaki farklılıklar, bağışçıların tıbbi geçmişi ve bağışçıların önceki ortamları veya yaşam tarzları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok soruna sahiptir6. Ayrıca, retinal araştırmalarda in vitro modellerin kullanılmasının da bazı dezavantajları vardır. Retina hastalıklarını incelemek için kullanılan hücre kültürü modelleri, insan kökenli hücre hatlarının, birincil hücrelerin veya kök hücrelerin kullanımını içerir7. Kullanılan hücre kültürü modellerinin kontamine olma, yanlış tanımlanma veya farklılaşmama açısından problemleri olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Son zamanlarda, retinal organoid teknolojisi önemli ilerleme göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak oldukça karmaşık retinaların yapımının birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, retinal organoidler olgun in vivo retinalarla aynı fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere sahip değildir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, retinal organoid teknolojisi, düz kas hücreleri, vaskülatür ve mikroglia12,13,14,15 gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere daha fazla biyolojik ve hücresel özelliği entegre etmelidir.

Organotipik retinal eksplantlar, diyabetik retinopati ve dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için güvenilir bir araç olarak ortaya çıkmıştır16,17,18,19. Mevcut diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, retinal eksplantların kullanımı, aynı biyokimyasal parametreler altında ve sistemik değişkenlerden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir özellik ekleyerek hem in vitro retinal hücre kültürlerini hem de mevcut in vivo hayvan modellerini desteklemektedir. Eksplant kültürleri, farklı retina hücrelerinin aynı ortamda bir arada tutulmasına izin vererek retinal hücreler arası etkileşimlerin korunmasını sağlar20,21,22. Ayrıca, önceki bir çalışma, retinal eksplantların kültürlenmiş retina hücrelerinin morfolojik yapısını ve işlevselliğini koruyabildiğini göstermiştir23. Böylece, retinal eksplantlar çok çeşitli retina hastalıkları için olası terapötik hedefleri araştırmak için iyi bir platform sağlayabilir24,25,26. Retinal eksplant kültürleri kontrol edilebilir bir teknik sağlar ve çok sayıda farmakolojik manipülasyona izin veren ve çeşitli moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilen mevcut güvelerin yerine çok esnek bir alternatiftir27.

Bu makalenin genel amacı, retinal eksplant tekniğini in vitro hücre kültürleri ile in vivo hayvan modelleri arasında makul bir ara model sistem olarak sunmaktır. Bu teknik, retina fonksiyonlarını ayrışmış hücrelerden daha iyi bir şekilde taklit edebilir. Çeşitli retina tabakaları bozulmadan kaldığından, retinal hücreler arası etkileşimler laboratuarda iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullar altında ve vasküler sistemin işleyişinden bağımsız olarak değerlendirilebilir28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Oakland Üniversitesi, Rochester, MI, ABD'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı tarafından oluşturulan yönergeleri izledi.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Hayvanları ışık kontrollü bir ortamda sabit bir sıcaklık altında tutun. Hayvan barınma odası için sıcaklık ayarları, "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" tarafından belirtilen yönergelere uygun olmalıdır. Fareler için sıcaklık aralığı 18 °C ile 26 °C arasındadır. Nem seviyelerini kontrol altında tutun ve yaklaşık% 42'ye ayarlayın.
  2. Bu deney için, 12 haftalıktan daha eski olan erkek C57BL/6J fareleri kullanın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) (bu protokol için yetişkin bir fare kullanılmıştır).
    NOT: Bu protokolde retinayı etkileyen herhangi bir genetik anormallik olmadığı için vahşi tip bir suş kullanılmıştır. Bununla birlikte, retinal eksplant kültürü için genetik olarak manipüle edilmiş suşlar da dahil olmak üzere diğer suşlar kullanılabilir.
  3. Hayvan barınma odalarında aydınlatma kontrolü ile 12 saat aydınlık / karanlık döngüleri sağlayın.
  4. Her hayvanı sağlık ve yeterli yiyecek ve su alımı açısından haftada iki kez, hafta sonları ise günde bir kez kontrol edin. Onlara taze yiyecek ve temiz su sağladığınızdan emin olun.
  5. Yiyecek ve su seviyeleri hafta boyunca düşükse, su şişesini durulayın ve tekrar doldurun. Gerektiğinde taze yiyecekler ekleyin. Kirlenmiş kafesleri günlük olarak veya hayvanların sağlığı için gerektiği gibi değiştirin.
    NOT: Retinadaki fotoreseptörleri ve ışık kaynaklı değişiklikleri incelemek için, fareleri hayvan tesisindeki karanlık bir odada bulunan özel bir karanlık kutuda gece boyunca karanlık bir şekilde uyarlayın.
  6. Bir CO2 odasına bağlı silindirlerde sıkıştırılmış CO 2 gazı kullanarak ev kafeslerindeki hayvanları CO2 inhalasyon doz aşımı ile ötenazileştirin. Servikal çıkık gibi ikincil bir ötenazi yöntemi kullanarak ölüm doğrulaması yapın.
  7. Prosedürü tamamladıktan sonra, hayvan ölümünü kalp ve solunum durmasını doğrulamak veya hayvanın sabit ve genişlemiş gözbebeklerini gözlemlemek gibi uygun bir yöntemle onaylayın.

2. Doku hazırlığı

  1. Hayvan ötenazi yapıldıktan sonra, alanı% 70 etanol ile temizleyin. Ardından, göz kapaklarını bir elinizle açın, böylece göz görünür olur. Dünya çıkıntı yapana kadar kavisli forseps kullanarak karşı elinizle yörüngenin üst ve alt kısımlarına basınç uygulayın.
  2. Gözü enüklee etmek için, gözün arka kısmındaki forsepsleri yavaşça kapatın ve sürekli bir hareketle yükselin. Forseps kullanarak, göz küresini optik sinirden tutun. Tüm adımlar için sterilize diseksiyon aletleri kullandığınızdan ve tam aseptik koşullar altında çalıştığınızdan emin olun.
  3. Her göz küresini, penisilin-streptomisin (10.000 U / mL) ile 1 mL buz gibi soğuk HBSS içeren 1,5 mL'lik bir tüpe batırın. Göz küresini HBSS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  4. Göz küresini tam medya içeren 1.5-2 mL'lik bir tüpe aktarın (% 10 FBS,% 2 B27,% 1 N2,% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin ve streptomisin).

3. Doku diseksiyonu

  1. Retinayı, Şekil 1'de sıralı olarak gösterildiği gibi, bir ameliyat mikroskobu altında dikkatlice inceleyin.
    1. Göz küresini açmak için limbüsün etrafında çevresel bir kesi yapın. Korneanın sınırı ve (limbal) insizyon boyunca dairesel olarak diseke ederek korneayı çıkarın, ardından ön segmenti, lensi ve vitreus gövdesini çıkararak boş bir göz kapağı bırakın.
    2. Optik sinir başının bölgesini ince forsepslerle tutarak, gözün dış kaplamasını nazikçe soyun. Nöral retinaya zarar vermemek ve retinanın tamamen sağlam kalmasını sağlamak için dış kaplamanın çıkarılması sırasında büyük dikkat gösterin.
      NOT: Retina, retina pigment epitelinden (RPE) dikkatlice soyulmalı ve retinayı optik sinirden ayırmak için optik sinir kafasında tek bir kesim yapılmalıdır. Optik sinirin (optik sinir başı) bıraktığı deliği tanımlayarak görsel olarak bunu sağlayın.
    3. Retinayı radyal olarak dört eşit boyutlu parçaya bölün.
  2. Retina kültürünün doğru yönlendirilmesini sağlamak amacıyla retinanın küçük parçalarını işlemek için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Diseksiyon makaslı bir bıçak kullanarak, retina parçasının hemen altında açın (Malzeme Tablosu).
    2. Retina parçasını açık bir makas bıçağının ucuyla yavaşça kaldırın ve yavaşça kültür plakasına aktarın.
  3. İzole edilmiş retinadan türetilen eksplantları, retinal ganglion hücresi (nöroretina) tarafı yukarı bakacak şekilde, her biri 300 μL retinal eksplant ortamı içeren 12 kuyucuklu bir plakadaki hücre kültürü ekzerlerine ayrı ayrı aktarın.
    NOT: Ortamın N2 ve B27 takviyeli DMEM ortamı olduğundan emin olun. Ortama penisilin-streptomisin (10.000 U / mL) de ekleyin (Malzeme Tablosu). Retina, sinapslar yoluyla birbirine bağlanan ve dışarıdan bakıldığında, diseksiyon sırasında çıkarılan siyah tabaka olan retinal pigment epitelinin pigmentli tabakası tarafından desteklenen çok sayıda nöronal hücre katmanından oluşur.
  4. Pigmentli epitelin kalıntılarını çıkarın; Bununla birlikte, bu kalıntılar eksplantın doğru yönünü belirlemede yardımcı olabilir. Pigmentli kısmın aşağı baktığından ve pigmentli olmayan kısmın yukarı baktığından emin olun.
  5. Retinal eksplant kültürünü nemlendirilmiş inkübatörlerde 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  6. Retina yüzeyinin yukarı baktığından emin olun. Retina parçası çevrilirse veya katlanırsa, yavaşça doğru yöne ayarlamaya çalışın.
    NOT: Kültür plakasındaki retinal eksplantın doğru yönlendirilmesine çok dikkat edin. Kültür plakasındaki eksplantın herhangi bir şekilde çevrilmesinden veya katlanmasından kaçının, çünkü bu, retina hücrelerinin kültürde düzgün büyümesinin başarısız olmasına neden olacaktır.

4. Retinal eksplant kültürü

  1. Retinal eksplant kültürlerini (3.2-3.3 adımlarında hazırlanan) nemlendirilmiş inkübatörlerde 37 °C ve% 5 CO2'de tutun.
  2. Medyanın yarısını 2 hafta boyunca her gün her kuyudan değiştirin. Bunu kuyudan 150 μL'yi dikkatlice pipetleyerek yapın. Ardından, kuyucuğa 150 μL taze ortam ekleyin. Medyayı değiştirirken eksplantı çevirmekten kaçının.
  3. Kültür plakasını tekrar inkübatöre koymadan önce eksplantı mikroskop altında dikkatlice kontrol edin. Hücrelerin bütünlüğünü ve retina mimarisini parlak alan mikroskobu altında inceleyin. Explant'ın hala doğru yönlendirildiğinden emin olun. Explant'ı incelemek için hem 4x hem de 20x objektif lensleri kullanın.
    NOT: Eksplantın ortama tamamen daldırılmasından kaçının.

5. İmmünohistokimya

  1. 2 hafta sonra, medyayı çıkararak retinal eksplantı sabitleyin. Bunu, önce 200 μL 1x PBS ile bir kez yıkayarak ve daha sonra eksplantı içeren kuyuya 0.1 M PBS, pH 7.4'te 300 μL% 4 paraformaldehit ekleyerek ve gece boyunca bırakarak yapın.
    NOT: Bu adım, kültür eklerini plakadan çıkarmadan yapılabilir. Eksplantlar ayrıca 500 μL'lik bir konik tüpe aktarılabilir ve yıkama ve sabitleme tüpün içinde yapılabilir.
  2. Eksplantı, yıkama için 300 μL 1x PBS-%2,5 Triton X içeren 500 μL konik bir tüpe aktarın.
  3. Sabit eksplantları tüpteki üç kez, bir çalkalayıcı (25 rpm) üzerinde orta hız kullanarak her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
  4. Antikor inkübasyonundan önce oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.02 thimerosal içeren 300 μL 1x bloke tamponu ile eksplantı inkübe ederek beklenen spesifik olmayan reaksiyonları bloke edin.
  5. Sabit eksplantları, bir çalkalayıcı üzerinde orta hız kullanarak 4 ° C'de gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edin.
    NOT: Sabit eksplanttaki retinal endotel hücrelerini GSL I, BSL I antikoru (lektin) ile boyayarak tespit edin (7:1,000). Tavşan glial fibriler asidik protein (GFAP) antikoru ile boyanarak retinal eksplantlardaki glial hücreleri tespit edin (1:250). Eksplantı tavşan NeuN antikoru ile boyayarak retinal nöronları tespit edin (1:250)29,30. S{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome eksplantlarını lektin, NeuN kombinasyonu ile inkübe edin ve diğerlerini lektin, GFAP kombinasyonu ile inkübe edin.
  6. Ertesi gün, birincil antikoru tüplerden bir pipetle aspirasyon yoluyla çıkarın. Eksplantları 1x PBS-%2,5 Triton X ile çalkalayıcıda orta hızda her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  7. İkincil antikorları ekleyin: Keçi anti-Tavşan IgG (1:500) (GFAP ve NeuN için ikincil) ve Texas Red (7:1,000) (lektin için). Bir çalkalayıcı üzerinde orta hız kullanarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlıdır, bu nedenle tüpü alüminyum folyo ile örtün.
  8. İkincil antikorları aspirasyonla çıkarın ve ardından her biri 5 dakika boyunca 1x PBS-2.5% Triton X ile üç kez yıkayın.
  9. Bir transfer pipeti kullanarak eksplantı tüpten cam bir slayda aktarın. Slayttaki fazla sıvıyı çıkarın ve ardından slayda DAPI içeren bir damla montaj ortamı ekleyin.
  10. Dokuyu bir örtü ile örtün. Kapak kayması ile doku arasında hava kabarcıklarına izin vermeyin.
  11. Lekeli slaytları floresan mikroskobuna götürün ve görüntüleri çekmeye başlayın. Floresan boyama ışığa duyarlı olduğu için lekeli slaytları bir slayt kutusu kullanarak örtmek önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Retinal eksplantın nöronal ve vasküler retinal hücrelerinin kültür medyasında ex vivo olarak uzun süre hayatta kalması
Protokolümüzü kullanarak retinal bir eksplantı kültüre alarak, 2 haftaya kadar canlı olan farklı retina hücrelerini korumada başarılı olduk. Farklı retina hücrelerinin varlığını doğrulamak için, nöronal hücre belirteci (NeuN), glial hücre belirteci (GFAP) ve vasküler belirteç (izolektin-B4) kullanılarak retinal eksplantın immünofloresan boyaması yapıldı (Şekil 2). Boyama iyi organize olmuş ve iyi gelişmiş retinal nöronlar ve glial hücreler gösterdi. Ek olarak, retinal kan damarları, izolektin-B4 boyaması ile belirtildiği gibi yapısal olarak sağlamdı. Retinal eksplantın morfolojik bütünlüğü, immün boyama ile gösterildiği gibi, retinal eksplant kültürünün, deneysel olarak bir model olarak kullanılabilecek canlı retinal hücrelerin korunmasında başarılı olduğunu göstermiştir. Explant kullanılarak incelenecek farklı deneysel koşullar, ImageJ yazılımı kullanılarak çoklu hücresel belirteçler için immünofloresan boyama ile değerlendirilebilir ve analiz edilebilir. İmmün boyama, çeşitli deney grupları arasında her bir hücresel belirtecin immünoreaktivite seviyelerinin ve retinal gangliyon hücrelerinin veya fotoreseptörlerin sayısı gibi spesifik hücrelerin sayısının ölçülmesine izin verir.

Kültür plakasındaki retinal eksplantın doğru yönlendirilmesinin deneysel sonuçlar için önemi
Retinal eksplantın kültür plakasındaki doğru oryantasyonu, nöroretinanın yukarı bakacak şekilde inkübe edilmesiyle sağlanır. Öte yandan, retinal eksplantın başarısızlığı, retina dokusunun ters çevrilmesi veya katlanmasından kaynaklanabilir ve bu da nöroretinanın aşağı bakmasına neden olur. Önceki deneyde (NeuN, GFAP ve izolektin-B4) farklı retinal belirteçler kullanılarak 2 hafta sonra kültürlenmiş retinal eksplantın immünofloresan boyanması, uygun eksplant oryantasyonunun başarısızlığının nörovasküler elemanın uygun gelişiminin başarısızlığına neden olduğunu göstermiştir (Şekil 3).

Figure 1
Şekil 1: Retinal eksplantı oluşturmak için göz küresini diseke etme adımları . (a) Enüklee edilmiş göz küresi, hayvandan çıkarıldıktan hemen sonra ortama daldırılır. (b) Göz küresini açmak için limbüs boyunca çevresel bir kesi yapılır. (c) Kornea limbal insizyon boyunca diseksiyon yapılarak çıkarılır. (d) Optik sinir ince forseps ile tutularak, gözün dış tabakası nazikçe soyulur. (e) Lens, vitreus ve siliyer gövde çıkarılır. (F) Geride sadece nöral retina kalır. (g) Bir sonraki adımda kesilmesini kolaylaştırmak için retinada dört radyal kesi yapılır. (h) Retina iki veya dört parçaya bölünebilir ve daha sonra kesici ucu ve ortamı içeren hücre kültürü plakasına aktarılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Korunmuş retinal yapıya sahip başarılı retinal eksplant kültürü. 2 hafta boyunca kültürde kalan retinal eksplantların immünofloresan boyaması. Eksplantlar sabitlendi ve (a) retinal nöronlar için NeuN (yeşil) ve kan damarları için izolektin-B4 (kırmızı) ve (b) glial hücreler için GFAP (yeşil) ve kan damarları için izolektin-B4 (kırmızı) ile boyandı. Boyama iyi gelişmiş retina hücreleri ve retina damarları gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kusurlu, az gelişmiş retina hücreleri ile başarısız retinal eksplant kültürü. İki hafta boyunca kültürde kalan retinal eksplantların immünofloresan boyaması. Eksplantlar glial hücreler için GFAP (yeşil) ve kan damarları için izolektin-B4 (kırmızı) ile sabitlendi ve boyandı. Görüntüler kusurlu boyama ve az gelişmiş retina hücrelerini ve retina damarlarını göstermektedir. Retinal eksplant katlandı ve kültür plakasında doğru yönlendirilmedi. Retina yukarı bakacak şekilde eksplantın doğru yönlendirilmesini sağlamak için büyük dikkat gösterilmelidir. Retinal eksplantın doğru yöne yerleştirilmemesi, eksplantın uygun şekilde geliştirilememesine neden olacaktır. Ölçek çubuğu = 100 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Laboratuvarımız31,32,33,34,35,36 yıldır retinal mikrovasküler disfonksiyonu destekleyen patofizyolojik değişiklikleri incelemektedir. Retinal eksplantlar, diyabetik retinopati veya dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanılması çok değerli olabilecek tekniklerden biridir. Tedavi edilen grup veya gruplarla aynı tek retina veya hayvandan türetilmiş bir kontrol grubuna sahip olmak, farklı deney koşullarının daha güvenilir karşılaştırmalarını sağlamak açısından bu tekniğe büyük avantaj sağlar.

Retinal eksplant hazırlığı sırasındaki en büyük zorluklardan biri, retinal yüzey aşağıya bakacak şekilde eksplantın katlanması veya kültür plakasında yanlış yönlendirilmesidir. Diğer araştırmacılar, retinanın plaka37'de doğru yönde olması için retinayı transfer pipetinin içinde yukarı ve aşağı pipetlemeyi önerdi. Bununla birlikte, protokollerinde tüm retinayı tek bir eksplant için kullandılar, ancak bu protokolde tek bir retina iki ila dört parçaya bölündü, yani parçalar daha küçüktür ve bu manevrayı doğru yönlendirme için yapmak zordur. Tek bir retinayı iki ila dört parçaya bölmek, bir deney için kullanılabilecek aynı hayvandan dört ila sekiz retina parçasının elde edilmesini sağlar. Bu, kontrol grubunun ve deney gruplarının aynı hayvandan türetildiği deneylere izin verir.

Bununla birlikte, retinayı küçük parçalara ayırmak, kullanımını daha zor hale getirir. Bu nedenle, retina kültürünün doğru yönlendirilmesini sağlamak için bu küçük retina parçalarını işlemek için bir teknik geliştirdik. Bunu yapmak için, açık diseksiyon makaslı bıçak, retina yüzeyi yukarı bakacak şekilde retina parçasının hemen altına yerleştirilir. Retina parçası çevrilirse veya katlanırsa, doğru yöne nazikçe ayarlanır. Yavaşça, retinal parça açık bir makas bıçağının ucu ile yükseltilir ve yavaşça kültür plakasına konur. Bu basit teknik, retina yukarı bakacak şekilde her retina parçasının doğru yönde olmasını sağlar ve retina damarlarını ve nöroglial hücreleri incelemek için daha iyi sonuçlar verir (Şekil 2). Retinal eksplantın nöroretina yukarı bakacak şekilde doğru yönde yerleştirilmemesi, Şekil 3'te gösterildiği gibi, retina hücrelerinin kültürde uygun şekilde büyümemesine neden olacaktır. Bu teknik hatayı önlemek için uygun eğitim şiddetle tavsiye edilir.

Bu protokol, yetişkin bir fare retinasının organotipik retinal eksplantını tanımlar; Bununla birlikte, teknik daha önce hem olgunlaşmamış fare retinaları37 hem de insan retinaları38 için de tanımlanmıştır. Önceki bir çalışmada, endotel fonksiyon manipülasyonunun ex vivo27 uygulanabilir hale getirildiği vasküler gelişimi incelemek için retinal eksplant kültürleri tanımlanmıştır. Bir retinal eksplantın morfolojik değerlendirmesine bir örnek olarak, retinal eksplant 2 hafta boyunca kültürde bırakıldı ve daha sonra NeuN (nöronal hücre belirteci), GFAP (glial hücre belirteci) ve izolektin-B4 (vasküler belirteç) kullanılarak immün boyama yapıldı. Boyama retina hücrelerinin ve kan damarlarının eksplantta iyi gelişmiş ve iyi korunmuş olduğunu göstermiştir (Şekil 2). Bununla birlikte, eksplanttaki diğer retinal hücrelerin yaşayabilirliğini ve işlevselliğini kontrol etmek için daha fazla immünohistokimya boyama verisi elde edilebilir.

Explant kültürünün kendisi retina hücreleri için stresli olabilir. Bununla birlikte, hücreler nispeten normal koşullar altında inkübe edilebilir, böylece hiperglisemi veya hipoksi gibi çeşitli deneysel koşullar altında meydana gelen morfolojik değişiklikler temel durumla karşılaştırılabilir. Bu nedenle eksplant, çeşitli retina hücrelerini değerlendirmek ve çok çeşitli retina hastalıklarında aynı anda farklı farmakolojik ajanlara veya terapötik hedeflere tepkilerini test etmek için iyi bir araçtır.

Retinal neovaskülarizasyon, prematüre retinopatisi ve diyabetik retinopati gibi iskemik retinopatinin kardinal bir belirtisidir. Biz (Şekil 2) ve diğerleri 27,39,40,41,42 kültürlü eksplantlarda bozulmamış retinal vaskülatürü 2 haftaya kadar gözlemleyebildik. Bu nedenle, retinal eksplant, hem normal hem de patolojik retinal neovaskülarizasyonun patofizyolojisini incelemek için kullanılmıştır 41,42,43,44,45,46,47,48,49. İlginç bir şekilde, bir araştırma grubu, proliferatif diyabetik retinopati43'te yükselen proanjiyojenik faktörleri araştırırken, fare retinal eksplantlarında VEGF kaynaklı vasküler filizlenmeyi kaydetti. Ayrıca, retinal eksplantlar üç boyutlu bir jel içine gömülmüştür ve retinal endotel hücrelerinin filizlenmesinin daha ayrıntılı bir uzaysal zamansal yönelimdeincelenmesine izin vermiştir 45,46,47.

Morfolojik çalışmalara ek olarak, retinal eksplantlar da retinal fonksiyonları değerlendirmek için bir dereceye kadar kullanılmaktadır50,51,52,53. Ex vivo elektroretinogram (ERG) görüntüleme, izole fare retinal eksplantları üzerinde gerçekleştirilmiştir ve hem çubuk hem de koni fotoreseptörleri54,55,56,57 dahil olmak üzere çeşitli retinal hücrelerin farklı fonksiyonlarının incelenmesine izin vermektedir. İlginç bir şekilde, Calbiague ve ark., yüksek glikoz tedavisine yanıt olarak, farelerden veya sıçanlardan türetilen retinal eksplant kültürlerinin, retina katmanlarının kalınlığının giderek azaldığını gösterdiğini bildirmiştir58. Ancak diyabetik koşullara en erken duyarlı hücreler arasında yer alan retinal bipolar hücreler sadece morfolojilerini değil, elektrofizyolojik özelliklerini de kültürde 2 hafta58'e kadar korumuşlardır. Özetle, bu protokolün göz araştırmalarında eksplant kullanımının faydalarını optimize etmek için gelecekteki ek çalışmalar için bir temel veya başlangıç noktası olabileceğine inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Ulusal Göz Enstitüsü'ne (R01 EY030054) Dr. Mohamed Al-Shabrawey'e Finansman Hibesi olarak teşekkür ederiz. Video anlatımında bize yardımcı olduğu için Kathy Wolosiewicz'e teşekkür ederiz. Oakland Üniversitesi Göz Araştırma Enstitüsü'nün Pediatrik Retinal Araştırma Laboratuvarı'ndan Dr. Ken Mitton'a cerrahi mikroskop kullanımı ve kayıt sırasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu video Dr. Khaled Elmasry tarafından düzenlenmiş ve yönetilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Tags

Tıp Sayı 190
Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için <em>Ex Vivo</em> Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elmasry, K., Moustafa, M.,… More

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter