Summary

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Abstract

Retina araştırmalarındaki zorluklardan biri, retinal nöronlar, glial hücreler ve vasküler hücreler gibi farklı retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemektir. Retinal nöronların in vitro olarak izole edilmesi, kültürlenmesi ve sürdürülmesinin teknik ve biyolojik sınırlamaları vardır. Retinal eksplantların kültürlenmesi bu sınırlamaların üstesinden gelebilir ve iyi kontrol edilen biyokimyasal parametrelere sahip ve vasküler sistemden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir ex vivo model sunabilir. Ayrıca, retinal eksplantlar, diyabetik retinopati gibi çeşitli retinal vasküler ve nörodejeneratif hastalıklarda yeni farmakolojik müdahaleleri incelemek için etkili bir tarama aracıdır. Burada, retinal eksplantların izolasyonu ve kültürü için uzun bir süre için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Makale ayrıca bu işlem sırasında retinal eksplant kültürünün istenen sonuçlarını ve tekrarlanabilirliğini etkileyebilecek bazı teknik problemleri de sunmaktadır. Retinal damarların, glial hücrelerin ve nöronların immün boyaması, retinal eksplant kültürünün başlangıcından itibaren 2 hafta sonra sağlam retinal kılcal damarları ve nöroglial hücreleri gösterdi. Bu, retinal eksplantları, diyabetik retinopati gibi retinal hastalıkları taklit eden koşullar altında retinal vaskülatür ve nöroglial hücrelerdeki değişiklikleri incelemek için güvenilir bir araç olarak kurar.

Introduction

Retina hastalıklarını incelemek için hem in vivo hem de in vitro modeller de dahil olmak üzere farklı modeller sunulmuştur. Hayvanların araştırmalarda kullanımı hala sürekli bir etik ve çeviri tartışması konusudur1. Fareler veya sıçanlar gibi kemirgenleri içeren hayvan modelleri, retinal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3,4. Bununla birlikte, kemirgenlerde retinanın insanlara kıyasla farklı fizyolojik fonksiyonları nedeniyle, makulanın yokluğu veya renk vizyonundaki farklılıklar gibi klinik kaygılar ortaya çıkmıştır5. Retinal araştırmalar için insan postmortem gözlerinin kullanımı, orijinal örneklerin genetik arka planlarındaki farklılıklar, bağışçıların tıbbi geçmişi ve bağışçıların önceki ortamları veya yaşam tarzları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok soruna sahiptir6. Ayrıca, retinal araştırmalarda in vitro modellerin kullanılmasının da bazı dezavantajları vardır. Retina hastalıklarını incelemek için kullanılan hücre kültürü modelleri, insan kökenli hücre hatlarının, birincil hücrelerin veya kök hücrelerin kullanımını içerir7. Kullanılan hücre kültürü modellerinin kontamine olma, yanlış tanımlanma veya farklılaşmama açısından problemleri olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Son zamanlarda, retinal organoid teknolojisi önemli ilerleme göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak oldukça karmaşık retinaların yapımının birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, retinal organoidler olgun in vivo retinalarla aynı fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere sahip değildir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, retinal organoid teknolojisi, düz kas hücreleri, vaskülatür ve mikroglia12,13,14,15 gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere daha fazla biyolojik ve hücresel özelliği entegre etmelidir.

Organotipik retinal eksplantlar, diyabetik retinopati ve dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için güvenilir bir araç olarak ortaya çıkmıştır16,17,18,19. Mevcut diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, retinal eksplantların kullanımı, aynı biyokimyasal parametreler altında ve sistemik değişkenlerden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir özellik ekleyerek hem in vitro retinal hücre kültürlerini hem de mevcut in vivo hayvan modellerini desteklemektedir. Eksplant kültürleri, farklı retina hücrelerinin aynı ortamda bir arada tutulmasına izin vererek retinal hücreler arası etkileşimlerin korunmasını sağlar20,21,22. Ayrıca, önceki bir çalışma, retinal eksplantların kültürlenmiş retina hücrelerinin morfolojik yapısını ve işlevselliğini koruyabildiğini göstermiştir23. Böylece, retinal eksplantlar çok çeşitli retina hastalıkları için olası terapötik hedefleri araştırmak için iyi bir platform sağlayabilir24,25,26. Retinal eksplant kültürleri kontrol edilebilir bir teknik sağlar ve çok sayıda farmakolojik manipülasyona izin veren ve çeşitli moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilen mevcut güvelerin yerine çok esnek bir alternatiftir27.

Bu makalenin genel amacı, retinal eksplant tekniğini in vitro hücre kültürleri ile in vivo hayvan modelleri arasında makul bir ara model sistem olarak sunmaktır. Bu teknik, retina fonksiyonlarını ayrışmış hücrelerden daha iyi bir şekilde taklit edebilir. Çeşitli retina tabakaları bozulmadan kaldığından, retinal hücreler arası etkileşimler laboratuarda iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullar altında ve vasküler sistemin işleyişinden bağımsız olarak değerlendirilebilir28.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Oakland Üniversitesi, Rochester, MI, ABD’deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı tarafından oluşturulan yönergeleri izledi. 1. Hayvan hazırlığı Hayvanları ışık kontrollü bir ortamda sabit bir sıcaklık altında tutun. Hayvan barınma odası için sıcaklık a…

Representative Results

Retinal eksplantın nöronal ve vasküler retinal hücrelerinin kültür medyasında ex vivo olarak uzun süre hayatta kalmasıProtokolümüzü kullanarak retinal bir eksplantı kültüre alarak, 2 haftaya kadar canlı olan farklı retina hücrelerini korumada başarılı olduk. Farklı retina hücrelerinin varlığını doğrulamak için, nöronal hücre belirteci (NeuN), glial hücre belirteci (GFAP) ve vasküler belirteç (izolektin-B4) kullanılarak reti…

Discussion

Laboratuvarımız31,32,33,34,35,36 yıldır retinal mikrovasküler disfonksiyonu destekleyen patofizyolojik değişiklikleri incelemektedir. Retinal eksplantlar, diyabetik retinopati veya dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanılması çok değerli olabilecek t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Ulusal Göz Enstitüsü’ne (R01 EY030054) Dr. Mohamed Al-Shabrawey’e Finansman Hibesi olarak teşekkür ederiz. Video anlatımında bize yardımcı olduğu için Kathy Wolosiewicz’e teşekkür ederiz. Oakland Üniversitesi Göz Araştırma Enstitüsü’nün Pediatrik Retinal Araştırma Laboratuvarı’ndan Dr. Ken Mitton’a cerrahi mikroskop kullanımı ve kayıt sırasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu video Dr. Khaled Elmasry tarafından düzenlenmiş ve yönetilmiştir.

Materials

Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Play Video

Cite This Article
Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

View Video