Summary
Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.
Abstract
Pulldown is een eenvoudige en veelgebruikte eiwit-eiwit interactie assay. Het heeft echter beperkingen bij het bestuderen van eiwitcomplexen die niet effectief in vitro assembleren. Dergelijke complexen kunnen co-translationele assemblage en de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes vereisen; ofwel vormen ze stabiele oligomeren die in vitro niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren, ofwel zijn ze instabiel zonder bindende partner. Om deze problemen te overwinnen, is het mogelijk om een methode te gebruiken die is gebaseerd op de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren gevolgd door de conventionele pulldown-technieken. De workflow is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown omdat het de tijdrovende stappen van afzonderlijke zuivering van interagerende eiwitten en hun daaropvolgende incubatie mist. Een ander voordeel is een hogere reproduceerbaarheid door een aanzienlijk kleiner aantal stappen en een kortere periode waarin eiwitten die in de in vitro omgeving voorkomen worden blootgesteld aan proteolyse en oxidatie. De methode werd met succes toegepast voor het bestuderen van een aantal eiwit-eiwitinteracties wanneer andere in vitro technieken ongeschikt bleken te zijn. De methode kan worden gebruikt voor het batchgewijs testen van eiwit-eiwitinteracties. Representatieve resultaten worden getoond voor studies van interacties tussen BTB-domein en intrinsiek ongeordende eiwitten, en van heterodimeren van zinkvinger-geassocieerde domeinen.
Introduction
Conventionele pulldown wordt veel gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen1. Gezuiverde eiwitten interageren echter vaak niet effectief in vitro2,3, en sommige zijn onoplosbaar zonder hun bindingspartner 4,5. Dergelijke eiwitten kunnen co-translationele assemblage of de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes 5,6,7,8,9 vereisen. Een andere beperking van conventionele pulldown is het testen van mogelijke heteromultimerisatieactiviteit tussen domeinen die kunnen bestaan als stabiele homo-oligomeren die co-translationeel zijn geassembleerd 8,10, omdat velen van hen niet in vitro kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens de incubatietijd. Co-expressie bleek nuttig te zijn bij het overwinnen van dergelijke problemen 3,11. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren in bacteriën werd met succes gebruikt om grote multi-subunit macromoleculaire complexen te zuiveren, waaronder polycomb repressief complex PRC212, RNA polymerase II mediator head module13, bacteriofaag T4 basisplaat 14, SAGA complex deubiquitinylase module 15,16 en ferritine 17. Replicatiebronnen die vaak worden gebruikt voor co-expressie zijn ColE1, p15A18, CloDF1319 en RSF20. In het in de handel verkrijgbare Duet-expressiesysteem worden deze oorsprongen gecombineerd met verschillende antibioticaresistentiegenen en handige meerdere kloonsites om polycistronische vectoren te produceren, waardoor de expressie van maximaal acht eiwitten mogelijk is. Deze oorsprongen hebben verschillende kopienummers en kunnen in verschillende combinaties worden gebruikt om evenwichtige expressieniveaus van doeleiwittente bereiken 21. Om eiwit-eiwitinteracties te testen, worden verschillende affiniteitstags gebruikt; de meest voorkomende zijn 6xHistidine, glutathion-S-transferase (GST) en maltose-bindend eiwit (MBP), die elk een specifieke affiniteit hebben met de overeenkomstige hars. GST en MBP verbeteren ook de oplosbaarheid en stabiliteit van gelabelde eiwitten22.
Er zijn ook een aantal methoden ontwikkeld waarbij eiwitten co-expressie in eukaryote cellen gebruiken, waarvan de meest prominente gist twee-hybride assay (Y2H)23 is. Y2H-test is goedkoop, gemakkelijk en maakt het testen van meerdere interacties mogelijk; De workflow duurt echter meer dan 1 week om te voltooien. Er zijn ook een paar minder vaak gebruikte zoogdiercel-gebaseerde assays, bijvoorbeeld fluorescent two-hybrid assay (F2H)24 en cell array protein-protein interaction assay (CAPPIA)25. F2H-assay is relatief snel, waardoor eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving kunnen worden waargenomen, maar omvat het gebruik van dure beeldvormingsapparatuur. Al deze methoden hebben een voordeel ten opzichte van prokaryote expressie die de oorspronkelijke eukaryote vertaal- en vouwomgeving biedt; Ze detecteren echter indirect interactie, hetzij door transcriptionele activering of door fluorescerende energieoverdracht, die vaak artefacten produceert. Ook kunnen eukaryote cellen andere interactiepartners van eiwitten van belang bevatten, die het testen van binaire interacties tussen eiwitten van hogere eukaryoten kunnen verstoren.
De huidige studie beschrijft een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten gevolgd door conventionele pulldown-technieken. De methode maakt het mogelijk om interacties tussen doeleiwitten te bestuderen die co-expressie vereisen. Het is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown, waardoor batchtests van meerdere doelen mogelijk zijn, waardoor het in de meeste gevallen voordelig is. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren is handiger dan polycistronische co-expressie, omdat het geen moeizame kloonstap vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De schematische weergave van de methodeworkflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Co-transformatie van E. coli
- Bereid expressievectoren voor doeleiwitten voor met behulp van standaard kloonmethoden.
OPMERKING: Doorgaans is een goed uitgangspunt om conventionele pGEX / pMAL-vectoren te gebruiken met een ampicillineresistentiegen en ColE1-oorsprong voor de expressie van GST / MBP-gelabelde eiwitten en een compatibele vector met p15A- of RSF-oorsprong en kanamycineresistentie om 6xHis-gelabelde eiwitten tot expressie te brengen, in sommige gevallen gecombineerd met Thioredoxine of SUMO-tag om de oplosbaarheid te verhogen. Meestal moeten voorafgaand aan het experiment verschillende combinaties van tags worden getest. De beschreven methode zelf is handig voor het batchgewijs testen van de expressiecondities van doeleiwitten. Het is belangrijk op te merken dat de meeste Rosetta-stammen al het plasmide met p15A-oorsprong bevatten voor het tot expressie brengen van de tRNA's voor zeldzaam codon; dus als het gebruik van dergelijke stammen een mogelijke optie is, moeten de p15A-plasmiden worden vermeden. Zie de materiaaltabel voor meer informatie.- Kweek bacteriën van een geschikte stam in Luria-Bertani (LB) media bij 37 °C tot een optische dichtheid (OD) van 0,1-0,2. BL21(DE3) stam werd gebruikt voor voorbeelden in deze studie.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vers bereide competente cellen te gebruiken om efficiënte co-transformatie met twee vectoren te bereiken. Als meer dan twee vectoren gezamenlijk moeten worden getransformeerd, is het beter om ze sequentieel te transformeren om een goede transformatie-efficiëntie te bereiken. Elektroporatie is een goed alternatief. - Centrifugeer 1,0 ml van de bacteriële suspensie gedurende 1 minuut bij 9.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Voeg 0,5 ml ijskoude buffertransformatiebuffer (TB) toe (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 en 15 mM CaCl2) en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Centrifugeer gedurende 30 s bij 8.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Voeg 100 μL TB-buffer toe, voeg 100 ng van elke vector toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Transformeer afzonderlijke vectoren afzonderlijk om eiwitgedrag te bestuderen zonder co-expressie. Bovendien co-transformeert u expressievectoren in paren met lege co-expressievectoren voor niet-specifieke bindingsbesturingselementen.
OPMERKING: In de voorbeelden in deze studie werden pGEX/pMAL-vectoren met overeenkomstige cDNA's gefuseerd tot GST/MBP cDNA's gebruikt in combinatie met compatibele pACYC-afgeleide vectoren met cDNA-coderende partnereiwitdomeinen gefuseerd met Thioredoxine cDNA. - Verwarm op 42 °C gedurende 150 s en koel vervolgens gedurende 1 minuut op ijs.
- Voeg 1 ml vloeibare LB-media zonder antibiotica toe en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C. Plaat op LB-agarplaten met 0,5% glucose en bijbehorende antibiotica (veel voorkomende concentraties zijn: 50 mg/L ampicilline; 20 mg/L kanamycine; 50 mg/L streptomycine; 35 mg/L chlooramfenicol). Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
- Kweek bacteriën van een geschikte stam in Luria-Bertani (LB) media bij 37 °C tot een optische dichtheid (OD) van 0,1-0,2. BL21(DE3) stam werd gebruikt voor voorbeelden in deze studie.
2. Expressie
- Spoel de cellen van de plaat met 2 ml vloeibare LB-media in 50 ml LB-media met bijbehorende antibiotica (veel voorkomende concentraties zijn: 50 mg / L ampicilline; 20 mg / L kanamycine; 50 mg / L streptomycine; 35 mg / L chlooramfenicol). Voeg metaalionen of andere bekende co-factoren toe (in de voorbeelden in deze studie werd 0,2 mM ZnCl2 aan de media toegevoegd). Bewaar een aliquot met 20% glycerol bij -70 °C voor een volgende herhaling van het experiment.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om verschillende kolonies rechtstreeks van de plaat te spoelen om de mogelijkheid van slechte expressie in een enkele geïsoleerde kloon uit te sluiten als gevolg van incidentele recombinatiegebeurtenissen tussen twee plasmiden. - Kweek de cellen met een constante rotatie van 220 rpm bij 37 °C tot een OD van 0,5-0,7, koel af tot kamertemperatuur (RT) en voeg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan 1 mM. Bewaar een aliquot van 20 μL celsuspensie als controle van het niet-geïnduceerde monster.
- Incubeer de cellen met een constante rotatie van 220 rpm bij 18 °C gedurende een nacht.
OPMERKING: De optimale tijd en temperatuur van incubatie kan variëren; 18 °C 's nachts werkt het beste voor de meeste eiwitten en wordt geadviseerd om standaard te proberen. Verminder de incubatietijd tot 2-3 uur als een sterke niet-specifieke binding wordt waargenomen. - Verdeel de bacteriële suspensie in twee delen (of meer als meer dan twee verschillende tags werden gebruikt) en bewaar een aliquot van 20 μL van de celsuspensie om de eiwitexpressie te bevestigen. Centrifugeer op 4.000 x g gedurende 15 min.
OPMERKING: Pauzepunt: bacteriële pellets kunnen minstens 6 maanden bij -70 °C worden bewaard.
3. Pulldown assay
OPMERKING: De gedetailleerde procedures worden beschreven voor eiwitten die zijn gelabeld met 6xHis of MBP / GST. Alle procedures worden uitgevoerd bij 4°C.
- Resuspendeer de bacteriële pellets in 1 ml ijskoude lysisbuffer met proteaseremmers en reductiemiddelen (zie hieronder) die onmiddellijk voorafgaand aan het experiment zijn toegevoegd. Vermijd dithiotreitol (DTT) bij het gebruik van metaalchelaatharsen, omdat het metaalionen verwijdert. Pas de buffersamenstelling aan voor de geteste eiwitten. De meest voorkomende recepten van lysisbuffers die geschikt zijn bevonden voor de meeste eiwitten zijn:
- 6xHis-pulldown: Meng 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazool, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM beta-mercaptoethanol, 1 mM fenylmethylsfulfonylfluoride (PMSF) en een 1:1.000 verdunning van de proteaseremmercocktail (zie materiaaltabel).
- GST- of MBP-pulldown: Meng 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF en een 1:1.000 verdunning van de proteaseremmercocktail (zie materiaaltabel).
- Verstoor de cellen door ultrasoonapparaat op ijs. Bewaar een aliquot van 20 μl voor elektroforese.
OPMERKING: Doorgaans zijn 20-25 pulsen van 5 s met intervallen van 15 s met een uitgangsvermogen van 20 W per monster vereist. Het juiste ultrasoonapparaatvermogen moet voor elk instrument worden aangepast om oververhitting te voorkomen en totale celverstoring te garanderen. Om betere prestaties te bereiken, wordt het sterk aanbevolen om multi-tip sonicatorsondes met hoge doorvoer te gebruiken. - Centrifugeer op 20.000 x g gedurende 30 min. Verzamel 20 μL van het geklaarde lysaat voor daaropvolgende SDS-PAGE-analyse.
- Breng de hars (50 μL voor elk monster) in evenwicht met 1 ml ijskoude lysisbuffer gedurende 10 minuten, centrifugeer gedurende 30 s op 2.000 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg cellysaten (totale eiwitconcentratie: 20-50 mg / ml) toe aan de hars, incubeer gedurende 10 minuten bij een constante rotatie van 15 tpm, centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg. Verzamel 20 μL van de ongebonden fractie voor een latere SDS-PAGE-analyse.
- Voeg 1 ml ijskoude wasbuffer toe en incubeer gedurende 1 minuut. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg. De meest voorkomende recepten voor wasbuffers zijn:
- 6xHis-pulldown: Meng 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazool, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol en 5 mM beta-mercaptoethanol.
- GST- of MBP-pulldown: Mix 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol en 5 mM DTT.
- Voer twee lange wasbeurten uit: voeg 1 ml ijskoude wasbuffer toe, incubeer gedurende 10-30 minuten met een constante rotatie van 15 tpm, centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 ml ijskoude wasbuffer toe, incubeer gedurende 1 minuut, centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg.
- Elueer de gebonden eiwitten met 50 μL van de elutiebuffer in een shaker bij 1.200 tpm gedurende 10 min. De meest voorkomende recepten van elutiebuffers zijn:
- 6xHis-pulldown: Meng 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazool en 5 mM beta-mercaptoethanol.
- GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathion (aangepast tot pH 7,5 met basistris) en 5 mM DTT.
- MBP-pulldown: Mix 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltose en 5 mM DTT.
- Analyseer de geëlueerde eiwitten met SDS-PAGE.
OPMERKING: Het percentage acrylamide moet worden aangepast aan de grootte van de eiwitten. In de voorbeelden in deze studie werden 12% acrylamidegels gebruikt, draaiend in tris-glycine-SDS-buffer (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) bij een constante spanning van 180 V. Gels werden gekleurd door koken in 0,2% Coomassieblauw R250, 10% azijnzuur en 30% isopropanol, en ontkleurd door koken in 10% azijnzuur. De hoeveelheid geladen eiwit mag niet gelijk zijn, omdat verschillende hoeveelheden interagerende eiwitten in verschillende experimenten naar beneden kunnen worden getrokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven methode werd routinematig gebruikt met veel verschillende doelen. Hier worden enkele representatieve resultaten gepresenteerd die waarschijnlijk niet kunnen worden verkregen met behulp van conventionele pulldown-technieken. De eerste is de studie van specifieke ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisatie11. ZAD's vormen stabiele en specifieke dimeren, waarbij heterodimeren alleen mogelijk zijn tussen nauw verwante domeinen binnen paraloge groepen. De dimeren gevormd door deze domeinen zijn stabiel en dissociëren niet gedurende ten minste een paar dagen; het mengen van gezuiverde ZAD's levert dus geen detecteerbare binding op. Tegelijkertijd vertoont de co-expressie van MBP en Thioredoxine-6xHis-gefuseerde ZAD's een goede en reproduceerbare homo-dimerisatieactiviteit (figuur 2A), die als een extra band verschijnt in de SDS-PAGE-resultaten van de MBP-pulldown-assay. Een klein deel van de heterodimeren kan worden gezien met M1BP samen uitgedrukt met een ander domein; deze interactie werd niet bevestigd met Y2A en is hoogstwaarschijnlijk een gevolg van niet-specifieke associatie als gevolg van een hoge eiwitconcentratie, aangezien deze domeinen cysteïnerijk en extreem aggregatiegevoelig zijn. Met name in dit geval is 6xHis-pulldown ongepast omdat ZAD's metaalcoördinerende domeinen zijn die niet-specifiek binden aan de metaalchelaathars. Dergelijke activiteiten moeten zorgvuldig worden onderzocht in een parallel experiment.
Een ander voorbeeld is de competitietest tussen het ENY2-eiwit en zijn bindingspartners Sgf11 (1-83aa) en het zinkvingerdomein (460-631 aa) van het CTCF-eiwit26. Wanneer het alleen tot expressie komt, vormt het ENY2-eiwit dimeren die voorkomen dat het interageert met zijn oorspronkelijke bindingspartners. Vermoedelijk binden zowel de Sgf11- als de CTCF-eiwitten aan hetzelfde moleculaire oppervlak van ENY2, waardoor hun interactie elkaar uitsluit. In de co-expressietest interageerde 6xHis-tagged ENY2 zowel met GST-gelabelde Sgf11 als MBP-CTCF, maar er was geen GST-Sgf11 aanwezig in MBP-pulldowns en vice versa (Figuur 2B). Deze resultaten suggereren dat er geen drievoudig complex kan worden gevormd en dat interacties elkaar uitsluiten. Deze gegevens werden onafhankelijk bevestigd met andere testen en ondersteunen de verschillende functionele rollen van ENY2 in deze complexen. Er moet worden gewezen op het feit dat grote affiniteitstags op zichzelf sterische belemmeringen kunnen opleggen, waardoor complexe vorming wordt voorkomen; Daarom mag de conclusie niet uitsluitend gebaseerd zijn op co-expressiegegevens.
Een stapsgewijze vergelijking van de workflows van conventionele en gekoppelde co-expressie pulldowns wordt getoond in figuur 3A. Co-expressie gekoppelde pulldown is minstens twee keer tijdsefficiënter, zelfs met een klein aantal samples, en maakt een goede schaalbaarheid mogelijk. De resultaten van het gebruik van beide technieken om dezelfde interactie tussen het BTB-domein van het CP190-eiwit (1-126aa) en het GST-gelabelde C-terminale domein (610-818aa) van Drosophila CTCF-eiwit (dCTCF) te bestuderen, worden weergegeven in figuur 3B. Beide methoden vertonen een goede efficiëntie en reproduceerbaarheid (testen werden uitgevoerd in drie replicaties); voor dit geval vertoonde co-expressie gekoppelde pulldown een lagere niet-specifieke binding, zoals te zien is in de controlemonsters met alleen GST-eiwit.
Figuur 1: De schematische weergave van het protocol. Het schema toont de methodeworkflow die in dit onderzoek is gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten . (A) Studie van de Zinc-finger associated domain (ZAD) homodimerisatie in MBP- en 6xHis-pulldown assays. ZAD's gefuseerd met MBP (40 kDa) of met 6xHis-Thioredoxine (20 kDa) werden co-uitgedrukt in bacteriecellen en affiniteit gezuiverd met amylosehars (bindt MBP-gelabelde eiwitten) of met Ni-NTA-hars (bindt 6xHis-gelabelde eiwitten). Co-gezuiverde eiwitten werden gevisualiseerd met SDS-PAGE gevolgd door Coomassie-kleuring. MBP-pulldown-resultaten worden weergegeven in de bovenste panelen, 6xHis-pulldown-resultaten bevinden zich in de onderste panelen (alleen gebruikt als eiwitexpressiecontrole, omdat veel ZAD's niet-specifiek aan Ni-NTA binden). (B) Studie van wederzijds uitsluitende interacties tussen ENY2- en Sgf11/CTCF-eiwitten. GST-gelabelde Sgf11 (1-81aa), MBP-gelabeld CTCF zinkvingerdomein (460-631aa) en 6xHis-gelabelde ENY2-eiwitten werden co-uitgedrukt in verschillende combinaties en affiniteit gezuiverd met amylosehars, glutathionhars (bindt GST-gelabelde eiwitten) of met Ni-NTA-hars. Co-gezuiverde eiwitten werden gevisualiseerd met SDS-PAGE gevolgd door Coomassie-kleuring. De figuur in panelen A en B zijn met toestemming van Bonchuk et al.11 en Bonchuk et al.26 aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van workflows van conventionele en gekoppelde co-expressie pulldown assays. (A) Stapsgewijze vergelijking van vereiste tijdsintervallen in de workflow van de conventionele pulldown-test in vergelijking met pulldown gekoppeld aan co-expressie. (B) Vergelijking van twee verschillende pulldown-technieken bij het bestuderen van de interactie tussen het dCTCF C-terminale domein (610-818aa) en het BTB-domein van het CP190-eiwit (1-126aa) in GST-pulldown-assays. dCTCF (610-818aa) gefuseerd met GST (25kDa) of GST alleen werden ofwel co-uitgedrukt in bacteriecellen of in vitro geïncubeerd met Thioredoxine-6xHis-gelabelde CP190 BTB en affiniteit gezuiverd met glutathionhars. Drie onafhankelijke replica's van elke test worden getoond. Co-gezuiverde eiwitten werden gevisualiseerd met SDS-PAGE gevolgd door Coomassie-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven methode maakt het testen van eiwit-eiwitinteracties mogelijk die niet efficiënt in vitro kunnen worden geassembleerd en co-expressie vereisen. De methode is een van de weinige geschikte benaderingen voor het bestuderen van heterodimeriserende eiwitten, die ook in staat zijn tot homodimerisatie, omdat dergelijke eiwitten, wanneer ze afzonderlijk worden gezuiverd, stabiele homodimeren vormen die meestal niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens het experiment 3,11.
De workflow van de beschreven methode is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown omdat het de tijdrovende stappen van afzonderlijke zuivering van interagerende eiwitten en hun daaropvolgende incubatie mist. Een ander voordeel is een hogere reproduceerbaarheid, vanwege een aanzienlijk kleiner aantal stappen en een kortere periode waarin eiwitten bestaan in een kunstmatige in vitro omgeving terwijl ze worden blootgesteld aan proteolyse en oxidatie. De methode werd met succes toegepast voor het bestuderen van verschillende eiwit-eiwitinteracties wanneer andere in vitro technieken ongeschikt bleken te zijn 3,11,27. Parallelle co-precipitatie met verschillende affiniteitstags zorgt voor controle van het eiwitexpressieniveau. Omdat de methode eenvoudiger en sneller is dan conventionele pulldown, kan deze in plaats daarvan worden gebruikt, zelfs als co-expressie niet absoluut vereist is. De snelheid van celverstoring is een niet-voor de hand liggend knelpunt dat de totale tijd aanzienlijk kan verlengen en kan leiden tot een afwijking van de resultaten, vanwege de verschillende hoeveelheid tijd tussen de blootstelling van het eerste en het laatste monster aan in vitro omstandigheden en proteolyse. Daarom wordt het gebruik van multi-tip sonicatorsondes met hoge doorvoer sterk aanbevolen; zie de Materiaalopgave voor voorbeelden.
Het gebruik van magnetische kralen kan de niet-specifieke binding verminderen en de methode verder versnellen, waardoor de tijd die nodig is voor wasstappen wordt verkort. Het gebruik van vectoren met compatibele oorsprong heeft een voordeel ten opzichte van polycistronische expressie, omdat ze een handige combinatorische benadering bieden om meerdere eiwitinteracties met hetzelfde doel te testen en niet vereisen dat voor elke combinatie een nieuwe vector wordt geproduceerd.
Een nadeel van de methode is de relatief grote kans op fout-positieve resultaten, omdat eiwitten in hoge concentraties tot expressie komen in bacteriën. Onverwachte interacties die door deze methode worden ontdekt, moeten dus met voorzichtigheid worden behandeld en getest met een onafhankelijke test, zoals de Y2A- of cellulaire technieken24, die ook co-expressie 3,11,28 gebruikt. Bio-informaticabenaderingen met hoge doorvoer kunnen ook worden gebruikt om complexe eiwit-eiwitinteractienetwerken te analyseren en te valideren29. Een ander eigenaardig obstakel is dat eiwitcomplexen totaal andere biochemische eigenschappen kunnen hebben dan afzonderlijke eiwitten; Het complex kan onoplosbaar zijn terwijl de componenten in de oplossing aanwezig zijn. Dit probleem kan meestal worden opgelost door de eiwitten te fuseren met het juiste oplosbaarheidslabel. MBP is het meest effectief, terwijl NusA een ander goed allround alternatiefis 22. GST-tag bleek efficiënt te zijn met veel zinkcoördinerende domeinen, hoewel het, omdat het dimere is, moet worden vermeden bij het werken met oligomere domeinen. Integendeel, kleine monomere domeinen zoals Thioredoxine en SUMO werken goed met multimere eiwitdomeinen.
Kritieke stappen van de beschreven methode zijn de juiste tijd van eiwitexpressie (een kortere tijd is vereist als niet-specifieke binding wordt waargenomen, terwijl langere incubatietijden nodig kunnen zijn om slechte eiwitexpressie te verbeteren), snelle celverstoring, juiste keuze van buffers en het handhaven van de constante temperatuur tijdens het protocol. Overmatige incubatietijden na inductie kunnen leiden tot eiwitaggregatie in bacteriën, wat leidt tot vals-positieve resultaten. Aan de andere kant hebben sommige eiwitten meer tijd nodig om in voldoende hoeveelheden tot expressie te komen. Temperatuurschommelingen tijdens de ultrasoonapparaat- en wasstappen kunnen leiden tot veranderingen in buffer-pH en eiwitprecipitatie. Onjuiste bufferkeuze kan ook leiden tot niet-specifieke eiwitaggregatie.
In het geval van slechte eiwitexpressie moeten verschillende oplosbaarheidslabels worden geprobeerd, evenals een verhoogde incubatietijd na inductie. Als een sterke niet-specifieke associatie wordt waargenomen, moeten alle noodzakelijke negatieve controles worden uitgevoerd om de mogelijke niet-specifieke associatie van eiwitten met hars of het affiniteitslabel te bepalen. Als de besturingselementen niet werken, moeten verschillende combinaties van affiniteitstags worden geprobeerd en verschillende buffers worden gebruikt. Veel eiwitten hebben de neiging om niet-specifiek te binden aan de metaalchelerende harsachtige ZAD's die in dit artikel worden genoemd; in dergelijke gevallen zou MBP/GST-pulldown in het algemeen voldoende zijn zonder een wederkerig experiment dat alleen kan worden gebruikt voor eiwitexpressiecontrole. Als negatieve controles goed werken, moet de eiwitexpressietijd worden verminderd en moeten het buffersysteem en het reductiemiddel worden gewijzigd of de concentratie van het reductiemiddel worden verhoogd, vooral bij het werken met cysteïnerijke eiwitten. In het geval van slechte reproduceerbaarheid van de resultaten, moet aandacht worden besteed aan de celverstoringsstap, die snel maar zonder oververhitting moet worden uitgevoerd. De temperatuur moet gedurende het hele experiment worden gecontroleerd.
Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om multiproteïnecomplexen of ribonucleoproteïnen te bestuderen. Een andere mogelijke toepassing is het batchtesten van eiwitcomplexexpressie- en zuiveringscondities voor latere studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de projecten 19-74-30026 (methodeontwikkeling en -validatie) en 19-74-10099 (eiwit-eiwitinteractietests); en door het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie-subsidie 075-15-2019-1661 (analyse van representatieve eiwit-eiwitinteracties).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S.
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G.
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al.
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
