Summary
השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.
Abstract
תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית בקביעת מחלת המטופל מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. CTCs מנותקים מהגידול הראשוני, נכנסים למערכת זרימת הדם, ועלולים לגדול באתרים מרוחקים, ובכך לשלוח גרורות לגידול. מכיוון ש- CTCs נושאים מידע דומה לגידול הראשוני, בידוד CTC ואפיון לאחר מכן יכולים להיות קריטיים בניטור ואבחון סרטן. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן שיטות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מספקות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה. שבבים מיקרופלואידים מציעים שיטת ביופסיה נוזלית ללא כל כאב עבור החולים. בעבודה זו, אנו מציגים רשימה של פרוטוקולים עבור שבבים מיקרופלואידים קליניים, פלטפורמת בידוד CTC רב-תכליתית, המשלבים מערך של פונקציות ושירותים הדרושים להפרדה, ניתוח ואבחון מוקדם של CTC, ובכך מאפשרים ניתוח ביומולקולרי וטיפול בסרטן. התוכנית כוללת ספירת תאי גידול נדירים, עיבוד מקדים קליני של דם המטופל, הכולל ליזה של תאי דם אדומים, ובידוד והכרה של CTCs באתרם על שבבים מיקרופלואידים. התוכנית מאפשרת ספירה מדויקת של תאי גידול או CTCs. בנוסף, התוכנית כוללת כלי המשלב בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים רב-תכליתיים וזיהוי אימונופלואורסצנטי באתרו על השבבים, ולאחר מכן אנליזה ביומולקולרית.
Introduction
תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן טכניקות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מציעות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה1. מספר נדיר של תאי גידול מעורבבים עם דם נורמלי מחקה באופן הדוק דם חולה אמיתי מאז 2-3 מ"ל של דם חולה אמיתי מכיל רק 1-10 CTCs. כדי לפתור בעיה ניסיונית קריטית, במקום להשתמש במספר גדול של תאי גידול שהוכנסו ל-PBS או מעורבבים עם דם רגיל, השימוש במספר נדיר של תאי גידול מספק לנו מספר נמוך של תאי דם, שהוא קרוב יותר למציאות בעת ביצוע ניסוי.
סרטן הוא סיבת המוות המובילה בעולם2. CTCs הם תאי גידול שנשפכים מהגידול המקורי ומסתובבים במערכת הדם והלימפה3. כאשר CTCs עוברים לסביבה חדשה הניתנת לשרידות, הם גדלים כגידול שני. זה נקרא גרורות והוא אחראי ל 90% ממקרי המוות בחולי סרטן4. CTCs חיוניים לפרוגנוזה, לאבחון מוקדם ולהבנת מנגנוני הסרטן. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם המטופל 5,6.
שבבים מיקרופלואידים מציעים ביופסיה נוזלית שאינה פולשת לגידול. יש להם את היתרון של היותם ניידים, בעלות נמוכה ובעלי קנה מידה תואם תאים. הבידוד של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים מסווג בעיקר לשני סוגים: מבוסס זיקה, המסתמך על אנטיגן-נוגדנים קושרים 7,8,9 והיא השיטה המקורית והנפוצה ביותר לבידוד CTC; ושבבים פיזיים, המנצלים את הבדלי הגודל והעיוות בין תאי הגידול לתאי הדם 10,11,12,13,14,15, הם נטולי תוויות וקלים לתפעול. היתרון של שבבים מיקרופלואידים על פני טכניקות חלופיות הוא שהגישה המבוססת פיזית של מיקרו-פילטרים בעלי אליפסה גדולה לוכדת היטב CTCs ביעילות לכידה גבוהה. הסיבה לכך היא שמיקרו-עמודי אליפסה מאורגנים במנהרות דקות של רווחי קו. מרווחי הקו שונים מהמרווחים המסורתיים בין נקודות נקודתיות שנוצרו על ידי מיקרו-פוסטים כגון מיקרו-פוסטים של מעוין. לכידה מבוססת שבב גל של CTCs משלבת הן בידוד מבוסס רכוש פיזי והן בידוד מבוסס אהדה. לכידה מבוססת שבב גל כוללת 30 מערכים בצורת גל עם נוגדן של אנטי-EpCAM מצופה על מיקרופוסטים עגולים. ה-CTCs נלכדים על ידי הפערים הקטנים, והפערים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה. ה-CTCs המוחמצים צריכים לעבור את הפערים הקטנים במערך הבא ונלכדים על ידי בידוד מבוסס זיקה המשולב בתוך השבב16.
מטרת הפרוטוקול היא להדגים ספירה של מספרים נדירים של תאי גידול ואת הניתוח הקליני של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים. הפרוטוקול מתאר את שלבי הבידוד של CTC, כיצד להשיג מספר נמוך של תאי גידול, ההפרדה הפיזית הקלינית של מסנני אליפסה קטנים, מסנני אליפסה גדולה ומסנני טרפז, שינוי זיקה והעשרה17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות דם של מטופלים סופקו על ידי בית החולים Longhua המסונף לאוניברסיטה הרפואית של שנחאי.הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים לשימוש בדגימות למטרות מחקר.
1. ניסוי מקדים לבדיקת יעילות הלכידה עם תאי גידול בתרבית
- תרבית את תאי הגידול MCF-7, MDA-MB-231 ו-HeLa לקביעת יעילות הלכידה. לדלל את תרחיף תאי הגידול, לספור את מספר תאי הגידול ולחזור על הפעולה עד לקבלת מספר התאים הרצוי ב 1 מ"ל של PBS.
- תרבית את התאים בבקבוק תרבית תאים עם מספר תא התחלתי של ~ 1 x 105 תאים ב 1 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco שונה (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה באטמוספירה לחה ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO2 אטמוספירה.
- כאשר קווי התאים גדלים כחד-שכבות נצמדות למפגש של 95%, נתקו אותם מתרבית התרבית עם תמיסת טריפסין 0.25% למשך 2 דקות כמתואר ב-Chen et al.16.
- מכתימים את תאי הגידול עם calcein AM. שים 3 μL של calcein AM בצלחת התרבית, ולשמור את המנה באינקובטור במשך 30 דקות. לאחר מכן,לעכל את כל התאים עם טריפסין.
- לספור את תאי הגידול בתרבית PBS עם תא ספירת תאים, ולדלל עד 100 תאים סרטניים לכל 1 מ"ל של PBS מתקבלים.
הערה: על מנת לספור במדויק את מספר התא, קח 50 μL של תרחיף התא המתקבל כדי לראות אם מספר תאי הגידול בו הוא חמישה או לא עם מיקרוסקופ. להחליט את נפח תרחיף התא שיש לקחת כדי לקבל 100 תאים סרטניים על פי המספר בפועל של תאי הגידול ב 50 μL של השעיית תאים.
- הכנס את תרחיף התא המכיל 100 תאי גידול לכל 1 מ"ל PBS לתוך השבב המיקרופלואידי באמצעות מזרק עם משאבת מזרק בקצבי זרימה מגוונים של 0.5 מ"ל/שעה, 1 מ"ל/שעה, 2 מ"ל/שעה, 3 מ"ל/שעה, 4 מ"ל/שעה ו-5 מ"ל/שעה. השג את יעילות הלכידה עבור קצבי הזרימה השונים, וקבע את קצב הזרימה האופטימלי.
- ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה כמפורט להלן:
יעילות לכידה = מספר התאים שנלכדו/(מספר התאים שנלכדו + מספר התאים הזורמים החוצה) × 100% - חזור על הפעולה כדי להשיג את יעילות הלכידה עבור מספר שונה של תאי גידול מ 10 עד 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
- ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה כמפורט להלן:
- בדוק ותקף את השבב המיקרופלואידי עבור מספר נדיר של תאים סרטניים. הזריקו את 10 המתלים לדוגמה אלה לתוך השבבים המיקרופלואידים באמצעות מחט חלולה העשויה עם מושך מיקרופיפטה כדי לשאוף 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול מדוללים ב -1 מ"ל של PBS. לזהות ולמנות את מספר תאי הגידול עבור כל דגימה לאחר לכידתם על השבב.
הערה: אורך המחט החלולה הוא כ-3 ס"מ וקוטר חיצוני של 1 מ"מ. - לבצע בדיקות קליניות לפני הניסוי עבור תאים סרטניים שהוקפצו לדגימות דם רגילות.
- לצבוע את תאי הגידול עם calcein AM, ולאחר מכן למנות 100 תאים סרטניים ב 5 μL של PBS. ספייק תאים אלה לתוך 1 מ"ל של דגימות דם נורמליות שלמות. הכנס תאים אלה לתוך השבב, ולמנות את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence ירוק. בצע ספירת in vivo על השבב כמתואר לעיל, וחשב את יעילות הלכידה לאחר הלכידה.
- חזור על שלב 1.4.1 עבור תשעה ריכוזים נוספים של מספרי תאי גידול מ-10 עד 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- מנה 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול כמתואר בשלב 1.3 ללא צביעה, ספייק לתוך 1 מ"ל של דם נורמלי שלם, להכניס דגימות אלה לתוך השבב microfluidic, וללכוד את תאי הגידול על השבב.
- כתם על השבב עם Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. שים 3-5 μL של צבע פלואורסצנטי לתוך 20-30 μL של PBS, ולאחר מכן להציג פתרון זה על שבב microfluidic עם מזרק. מנה את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence כחול וירוק כדי לקבוע את יעילות לכידה.
- בצע שינוי של השבב המיקרופלואידי ללכידה מבוססת זיקה של אנטי-EpCAM.
הערה: מכיוון ששבב הגל משלב בידוד מבוסס זיקה ובידוד מבוסס מאפיינים פיזיים, שנה את השבב עם סוכנים.- שנה את פני השטח של השבב עם 100 μL של 4% (v/v) 3-mercaptopropyl trimethoxysilane באתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. הציגו פתרון זה לתוך השבב בזהירות ובאיטיות במקרה שהוא הורס את המבנה הפנימי של השבב, במיוחד את מליטה של המשטח העליון ואת זכוכית המצע.
הערה: משטח השבב משתנה באמצעות מרקפטוסילן. האינטראקציות המתרחשות על השבב נקבעות על ידי קשרים כימיים. קשרים כימיים נקבעים כדי לממש את הקשר של הנוגדן שונה עם האנטיגן. ריאגנטים שונים משתנים בתוך השבב כדי ליצור קשרים כימיים המתחברים זה לזה. המגיב האחרון שיש לשנות הוא מולקולת הידבקות אנטי-אפיתל (anti-EpCAM). האנטיגן של פני השטח של תאי הגידול של EpCAM משתלב עם אנטי-EpCAM בתוך השבב כדי לממש את לכידת ה-CTCs. - לשטוף עם אתנול 3x. הוסף 100 μL של חומר הצימוד N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS, 1 μM) על השבב, ולאפשר לו אינטראקציה במשך 30 דקות.
- יש לשטוף עם PBS 3x. השתמש מזרק כדי להציג 1 מ"ל של PBS על השבב כדי לשטוף.
- טפלו בשבב עם 30-40 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל נויטרווידין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמוביל לשיתוק התאים על GMBS, ולאחר מכן שטפו עם PBS כדי להסיר עודפי אבידין.
- שנה את השבב עם 3 μL של נוגדן EpCAM אנטי-ביוטינילציה בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-100 מיקרוליטר של PBS עם 1% (w/v) BSA. שמור את זה למשך הלילה.
- שנה את פני השטח של השבב עם 100 μL של 4% (v/v) 3-mercaptopropyl trimethoxysilane באתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. הציגו פתרון זה לתוך השבב בזהירות ובאיטיות במקרה שהוא הורס את המבנה הפנימי של השבב, במיוחד את מליטה של המשטח העליון ואת זכוכית המצע.
2. ניסוי קליני על השבב לספירת תאי הגידול במחזור הדם (CTCs)
- טרום תהליך קליני דגימות דם לחולי סרטן באמצעות תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (RBCL), או החדרת 2-3 מ"ל של דגימת הדם ישירות על השבב המיקרופלואידי באמצעות מזרק.
- בצע עיבוד מקדים, שאורך כ-30 דקות. לאסוף דגימות דם שלמות צינורות נוגדי קרישה. הוסף 6-9 מ"ל של תמיסת ליזה RBS לתוך 2-3 מ"ל של דם. צנטריפוגה ב 111 x גרם במשך 5-8 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את השכבה העליונה של נוזל אדום שקוף.
- ללכוד, להכתים, לזהות ולמנות את התאים על השבב כמתואר להלן.
- לכוד את התאים על השבב כמתואר בשלב 1.הכתים את השבב עבור CTCs שנלכדו באמצעות Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. CK-FITC הוא כתם ספציפי לתאי גידול, ו- CD45-PE מיועד לתאי דם לבנים.
- הוסף 3 μL של CK-FITC ל- 20 μL של PBS. הכנס את זה לתוך מזרק, ולשאוב את CK-FITC מדולל על השבב. מניחים לכתם למשך 30 דקות. הכנס 300 μL של PBS על השבב כדי לשטוף את השבב.
- הוסף 3 μL של CD45-PE ל 20 μL של PBS. הכנס את זה לתוך המזרק, ולשאוב את CD45-PE מדולל על השבב. אפשר לעמוד במשך 30 דקות. הכנס 300 μL של PBS על השבב כדי לשטוף את השבב.
- זהה את CTCs עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 20 או 40. CTCs פולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה, ותאי דם לבנים (WBCs) פולטים פלואורסצנטיות כחולה ואדומה. זהה את ה- CTCs עם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה ואת ה- WBCs עם פלואורסצנטיות כחולה ואדומה.
- מתוך תמונות immunofluorescence, למנות את מספר CTCs לכוד על השבב. מנה את CTCs כ- Hoechst+/CK-FITC+/CD45− ואת ה- WBCs כ- Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
- העשירו את ה-CTCs שנלכדו על ידי שטיפה עם PBS דרך המזרק בכיוון ההפוך אל השבב המיקרופלואידי כדי לאסוף את ה-CTCs שנלכדו על השבב מהמפרצון. השתמש מזרק עם 1 מ"ל של PBS, להציג אותו מן השקע כדי להעשיר את CTCs נתפס על השבב בתוך 2-3 דקות, ולאסוף אותם מן המפרצון. יש להשתמש ב-1 מ"ל PBS לכל שלב כביסה, ולחזור על הפעולה 3x.
- הכתימו את תאי הגידול או CTCs שנלכדו על השבב המיקרופלואידי כמתואר להלן.
- מכתים באמצעות calcein AM. הוסף 5 μL של calcein AM ל 20 μL של PBS, להכתים את התאים במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 111 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל תאים סרטניים, והשהה ב 1 מ"ל של PBS.
- כדי לזהות את גרעיני התא, הוסף 20 μL של תמיסת DAPI (10 μL של מגיב DAPI ב- 20 μL של PBS) לשבב בקצב זרימה אופטימלי של 1 מ"ל/שעה עבור מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה ו- 1.5 מ"ל/שעה עבור טרפזים. לעבור דרך 20 μL של תמיסת מלאי אנטי cytokeratin (3 μL של נוגדן anti-cytokeratin ב 20 μL של PBS) כדי להגיב עם השבב במשך 30 דקות.
- הכתימו את ה-WBCs שנתפסו על השבב. לאחר שה-CTCs נלכדו על השבב, הוסף 25 μL של תמיסת נוגדנים נגד CD45 (5 μL של תמיסת anti-CD45 ב-20 μL של PBS) לשבב, ואפשר להכתים למשך 30 דקות. לשטוף עם PBS, ולזהות את תאי אפיתל עם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה.
- לבצע זיהוי immunofluorescence עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמתואר להלן.
- השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ועורר את הדגימה עם הלייזר הכחול. מצא את התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה, שהם תאי גרעין. השתמש באחת מההגדלות הבאות: 10x, 20x או 40x. מצא שדה ברור לתא הגידול. עבור מקור הלייזר הכחול, השתמש באורך גל של לוחית עירור של 420-485 ננומטר ובאורך גל של צלחת פליטה של 515 ננומטר.
- מבלי להזיז את הדגימות, השתמש במקור לייזר אחר. סובב את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והלהיב את הדגימה עם הלייזר הירוק. מצא את התאים פולטים פלואורסצנטיות ירוקה, המעידה על תאים סרטניים. צלם תמונות של אותו שדה עם אותה הגדלה עם מקור לייזר ירוק זה. התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה מוכרים כתאי גידול. עבור מקור הלייזר הירוק, השתמש באורך גל של לוחית עירור של 460-550 ננומטר ובאורך גל של צלחת פליטה של 590 ננומטר
- מבלי להזיז את הדגימות, השתמש במקור לייזר אחר. סובב את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והרגש את הדגימה עם הלייזר האדום. מצא את התאים הפולטים פלואורסצנטיות אדומה. צלם תמונות של אותו שדה עם אותה הגדלה עם מקור לייזר אדום זה. התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה ואדומה מוכרים כתאי דם לבנים.
- שמור את התמונה המתקבלת באמצעות כל אחד ממקורות הלייזר לעיל. צלם מספר תמונות של אותו שדה עם אורות בצבעים שונים.
- השתמש באור אולטרה סגול עם אורך גל של צלחת עירור של 330-400 ננומטר ואורך גל של צלחת פליטה של 425 ננומטר. השתמש באור סגול עם אורך גל של לוחית עירור של 395-415 ננומטר ואורך גל של צלחת פליטה של 455 ננומטר.
- חשב את יעילות הלכידה כמו בשלב 1.2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההתקנה כולה כוללת משאבת מזרק, מזרק ושבב מיקרופלואידי. תרחיף התא במזרק מחובר למשאבת המזרק, ותרחיף התא מוכנס לשבב המיקרופלואיד כדי ללכוד את התאים. יעילות הלכידה של כל השבבים המיקרופלואידים שנוצלו הייתה בסביבות 90% ומעלה. עבור שבב הגל, תכננו מיקרו-מבנים עם פערים מגוונים. המרווחים הקטנים משמשים ללכידת CTCs, והמרווחים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה. מתלה התא זורם במהירות באזורי הפער הגדול. ההחמצות נוטות להיתפס על ידי הפערים הקטנים במערך16 שלאחר מכן. עבור שבבי אליפסה, תכננו רווחי קו במקום רווחי נקודה כדי ליצור מנהרה דקה כדי לשפר את הלכידה. לכן, יעילות לכידה גבוהה הושגה1. תכננו מבנה אליפסה כדי למנוע קצוות ופינות כדי לשמור על כדאיות. לפילטרים הטרפזיים שתי תעלות ספירליות מעגליות עם מחסומי טרפז מוטבע ומחסומי מיקרופוסט מעגליים. עבור מסנני טרפז, יעילות הלכידה עבור MCF-7, MDA-MB-231 ו-HeLa הייתה 94%, 95% ו-93%, בהתאמה18.
איור 1 מראה שכל תאי הגידול נלכדו על-ידי שבב הגל. מכיוון שכל תאי הגידול היו מרוכזים סביב מערך המיקרופוסט של הגל, הדבר מצביע על יעילות לכידה גבוהה עבור שבב מיקרופלואידי זה, כפי שמודגם על ידי מספר תאי הגידול שנלכדו. לכן, הגדרה זו עושה את זה הרבה יותר קל ללכוד תאים סרטניים נדירים; ואכן, השבב מיוצר כדי ללכוד מספר רב של תאים סרטניים, כמו גם מספר נדיר של תאים סרטניים. לדוגמה, אם השבב מוצק או ניתן לשחזור מספיק כדי ללכוד 10,000 תאים סרטניים, קל לשבב ללכוד 10-100 תאים. סרטון 1 מראה כיצד התקבל מספר נדיר של תאי גידול עבור טרום הניסוי. מחט חלולה שיוצרה באמצעות מושך מיקרופיפטה שימשה לשאיפת 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו-10 תאי גידול מצלחת תרבית עם תאי גידול מדוללים מוכתמים בקלצין AM ב-PBS. התאים נספגו בצינור ג'ל הסיליקה המחובר למחט החלולה. תא גידול עם אימונופלואורסנציה ירוקה נשאב לתוך המחט החלולה. נשיפה לתוך הצינור החלול הובילה לכך שתא הגידול בתוך המחט החלולה נפלט לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה1. זהו הליך להשגת תאי גידול נדירים. איור 2 מראה CTCs מחולה סרטן קיבה שנלכד באמצעות מיקרו-מסננים בעלי אליפסה קטנה. איור 3 מראה CTCs מחולה סרטן המעי הגס שנלכד באמצעות מיקרו-מסננים טרפזיים ופולט פלואורסצנטיות כחולה וירוקה. איור 4 מראה תאים סרטניים שגדלו על השבב לאחר לכידתם, אשר מוכנים לטיפול בתרופות אנטי-סרטניות. ממצאים אלה ממחישים כי למיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה אין השפעות שליליות על יכולת הקיום של התא.
איור 5 מראה את הניתוח הקליני של CTCs במעי הגס שנלכדו על השבב המיקרופלואידי. אלה נראים בשדה בהיר ומוכתמים בצביעת Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. ה-CTCs זוהו כ-DAPI+/CK+/CD45-, וה-WBCs זוהו כ-DAPI+/CK−/CD45+. איור 6 מראה תאי גידול במעי הגס שגודלו בתרבית על שבב האליפסה הגדולה לאחר לכידתם. איור 7 מראה תאי גידול במעי הגס שנלכדו במיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה. מבחינה קלינית, CTCs בדם המטופל נלכדו על ידי שבבי גל, מיקרו-מסננים טרפזיים ומיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה, מה שמצביע על כך ששלושת השבבים הללו מצליחים ללכוד CTCs. באופן פוטנציאלי, הם יכולים להיות מיושמים במוצרי CTC, כגון מוצרי בידוד CTC, ביעילות גבוהה.
איור 1: לכידת שבב גל. כל תאי הגידול של MCF-7 נלכדו סביב מערך שבב הגל ללא תאים חסרים. מכיוון שלא היו תאי גידול בשום אזור אחר מלבד המערך, הדבר מצביע על יעילות הלכידה הגבוהה של השבב. מספר רב של תאי גידול נלכדו. לכן, תאים סרטניים נדירים יכולים גם להילכד בקלות. תאי הגידול של MCF-7 נלכדו על ידי שבב גל ו-(A) הוכתמו ב-Hoechst ו-(B) הוכתמו בקלצין AM. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דגימה קלינית עבור CTCs שנלכדו על-ידי מיקרו-מסננים בעלי אליפסה קטנה. CTCs קליניים של חולה סרטן קיבה שנלכדו על ידי מיקרו-מסננים אליפסה קטנים. ה-CTCs זוהו בשדה בהיר ועם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה. העיגול הכחול ב-(A) מציין CTC של חולה סרטן קיבה שנלכד בתוך השבב. מהתמונות שצולמו, ניתן לראות כי לא היו תאים אחרים באזורים אחרים, מה שמצביע על כך שטוהר הלכידה היה גבוה עבור שבב זה. תאי הגידול של MCF-7 נלכדו על ידי מיקרו-מסננים בעלי אליפסה קטנה ונצפו ב-(A) שדה בהיר, (B) מוכתמים ב-Hoechst, ו-(C) מוכתמים ב-CK-FITC. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דגימה קלינית של CTCs שנלכדו על-ידי מיקרו-מסננים טרפזיים. CTCs קליניים מחולה סרטן המעי הגס נלכדו על ידי מיקרו-פילטרים טרפזיים. בתמונות אלה ניתן לראות כי שישה CTCs נלכדו, מה שמעיד על כך שיעילות הלכידה הייתה גבוהה בשדה הקטן. בנוסף, לא הופיעו תאים אחרים, מה שמצביע על כך שטוהר הלכידה היה גבוה ביותר עבור שבב זה. תאי הגידול של MCF-7 נלכדו על ידי מיקרו-מסננים טרפזיים ונצפו ב-(A) שדה בהיר, (B) מוכתמים ב-Hoechst ו-(C) מוכתמים ב-CK-FITC. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תרבית של CTCs שנלכדו על-ידי מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה. תאי הגידול של MCF-7 נלכדו על ידי מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה מול מערך מיקרופוסט של אליפסה גדולה. אף תא גידול לא עבר דרך המערך, מה שמעיד על יעילות לכידה גבוהה עבור שבב זה. לאחר הלכידה, תאי הגידול גדלו במשך 24-48 שעות. זה מצביע על כך שגם יעילות הלכידה וגם הכדאיות היו גבוהות מאוד עבור מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה. תאי הגידול בתרבית של MCF-7 נלכדו על ידי מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה ונצפו ב-(A) 0 שעות לאחר הלכידה, (B) 24 שעות לאחר הלכידה ו-(C) 48 שעות לאחר הלכידה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמה לדגימה קלינית המשמשת ללכידת CTC על-ידי מיקרו-מסננים טרפזיים. CTCs קליניים מחולה סרטן המעי הגס נלכדו על ידי מיקרו-פילטרים טרפזיים. בתמונות אלה, ניתן לראות כי שני CTCs נלכדו, מה שמצביע על יעילות לכידה גבוהה. לא הייתה הפרעה אחרת בתאים מלבד שאריות של RBCs בשבב. לכן, עבור עיבוד מוקדם קליני של לכידת CTC, עדיף לא להשתמש בליזה של תאי דם אדומים. CTCs של סרטן המעי הגס נלכדו על ידי מיקרו-מסננים טרפזיים ונצפו ב-(A) שדה בהיר, (B) מוכתמים ב-Hoechst, (C) מוכתמים ב-CK-FITC ו-(D) נראו בתמונות ממוזגות. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמה של CTCs מתורבתים שנלכדו על-ידי שבב אליפסה גדול. תרביות תאי גידול של תאי MCF-7 לפני מערך המיקרופוסט של האליפסה הגדולה ומאחורי המיקרו-מסננים של האליפסה הגדולה. תאי הגידול המוכתמים בקלצין AM פולט פלואורסצנטיות ירוקה גדלו כרצונם, מה שמעיד על כך שהכדאיות התאית לשבב זה הייתה גבוהה מאוד. בסך הכל היו 15 מערכים, עם מרווחים מגוונים לכל מערך שאורגן על ידי מיקרו-פוסטים של אליפסות גדולות. תאי גידול MCF-7 גודלו בתרבית על שבב האליפסה הגדולה לאחר לכידה (A) במערך אחד ו-(B) במערך אחר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: דוגמה לדגימה קלינית המשמשת ללכידת CTC על-ידי מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה. CTCs קליניים מחולה סרטן המעי הגס נלכדו על ידי מיקרו-מסננים גדולים של אליפסה. מן התמונות, ניתן לראות כי היה זיהום RBC. זה מצביע על כך שכל דגימת הדם של המטופל חייבת להיות מדוללת וכי השבב צריך להיות סמוק לאחר לכידה. CTCs של דגימות דם קליניות של חולי סרטן המעי הגס נלכדו על שבב האליפסה הגדולה ונצפו ב-(A) שדה בהיר, (B) מוכתמים ב-Hoechst, ו-(C) מוכתמים ב-CK-FITC. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לפרוגנוזה ולאבחון מוקדם של סרטן יש השפעה משמעותית על הטיפול בסרטן1. בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים מציע ביופסיה נוזלית ללא פלישה. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם1, מה שהופך את זה למאתגר לבודד CTCs. CTCs יש תכונות דומות למקורות הגידול המקוריים שממנו הם מגיעים. לפיכך, CTCs ממלאים תפקיד חיוני בגרורות סרטניות1.
הפרוטוקול המוצע מאפשר ניתוח מלא של בידוד CTC עם השבב המיקרופלואידי. הפרוטוקול כולל את כל נהלי המפתח הקשורים לבידוד CTC. לדוגמה, פרוטוקול זה כולל ניתוחי RBCL, אשר נרשמים בקפידה ומאורגנים באריזות שונות, רכישת תאי גידול נדירים, קביעת קצב זרימה אופטימלי, יעילות לכידה, אפיון קליני וספירה. הניהול הזהיר של הפעולות מקל על עיבוד הדגימה של המטופל הקליני. הפרוטוקול מאפשר עיבוד מקדים ועיבוד של דגימות קליניות של מטופלים ומציע שירותים חיוניים לרופאים.
עבור בידוד CTC, עיבוד מראש של תאים סרטניים נדירים קשה מאוד לבצע. קושי זה נפתר על ידי שימוש במחט חלולה שנמשכה דרך מושך מחטים כדי למצוץ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול לפי הצורך. לאחר מכן, הוכנה דגימת דם קלינית קרובה לאמיתית של המטופל עם המספר הרצוי של תאי גידול מעורבבים בדם רגיל, תוך חיקוי דגימת דם של מטופל. עם דגימות דם מלאכותיות אלה של המטופלים, בוצע ניסוי כמעט אמיתי. שיטה זו פתרה בעיה קשה שבדרך כלל פוגשים בבידוד CTC לניסויים מקדימים. גישה זו אינה קלה לביצוע ומעולם לא דווחה במקומות אחרים; עם זאת, זוהי גישה שימושית לפני ביצוע ניסוי קליני אמיתי.
בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים מסווג לשלושה סוגים: מבוסס אהדה, מבוסס פיזית ומבוסס אימונומגנטית. עבור בידוד מבוסס אהדה, יש לשנות את השבב המיקרופלואידי. נהלי השינוי הספציפיים נכללו לצורך שינוי עם anti-EpCAM. ה-CTCs זוהו באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית עם Hoechst, CK-FITC ו-CD45-PE. מאחר שתאי גידול רבים מבטאים EpCAM, אנטי-EpCAM הוא נוגדן חשוב ללכידת CTCs בדם החולה. עם זאת, אנטי-EpCAM יקר מאוד; לכן, aptamers רבים פותחו כדי לפתור בעיה זו. אנו משתמשים בעיקר בשבבים מיקרופלואידים מבוססי פיזיקה כגון מיקרו-פילטרים אליפסים קטנים ומיקרו-מסננים טרפזיים כדי ללכוד CTCs מכיוון שהם פשוטים, קלים לתפעול ויעילים.
היתרון של טכניקה זו על פני טכניקות חלופיות הוא שהשבב מבוסס הפיזיקה של מיקרו-מסננים גדולים באליפסה לוכד בחוזקה CTCs ביעילות לכידה גבוהה. הסיבה לכך היא שיש מנהרות דקות של פערי קווים. שבבי גל לוכדים CTCs על ידי שילוב של בידוד מבוסס רכוש פיזי ובידוד מבוסס אהדה. ה-CTCs נלכדים על ידי הפערים הקטנים, וניתן להשתמש בפערים הגדולים כדי להאיץ את קצב הזרימה. ה-CTCs שהוחמצו צריכים לעבור דרך המרווחים הקטנים במערכים הבאים ונלכדים גם על ידי בידוד מבוסס זיקה.
הפרוטוקול פתר מספר בעיות עיקריות בבידוד CTC, במיוחד עבור ניסויים קליניים. עם זאת, אי אפשר לכלול כל שלב מפורט בבידוד CTC, כגון לגבי תפקידם של ננו-חלקיקים וננו-מבנים ושינוי אפטמר. היבטים אלה גם ממלאים תפקיד חיוני בבידוד CTC. עם זאת, הם אינם קריטיים בפתרון בעיות כגון שיפור יעילות הלכידה. במקום זאת, היבטים אלה מעשירים את בידוד CTC עם תוכן חדש.
עבודה זו מתרכזת בבידוד קליני של CTCs עם שבב microfluidic מתוכנן. רוב השבבים המיקרופלואידים המשמשים הם בעיקר מבוססי פיזיקה, כגון מסנני אליפסה גדולים ומסנני אליפסה קטנים. שבבי גל מיוצרים על ידי שילוב תכונות שבב מבוססות זיקה ותכונות שבב מבוססות פיזית1. המיקרו-עמודים של מסנני אליפסה גדולים תוכננו להיות קצרים יותר כדי לשפר את טוהר הלכידה בעבודה זו. ניתן לשפר את מסנני האליפסה הקטנים גם על ידי עיצובם עם גדלי מיקרופוסט מגוונים עבור מערכים שונים. ניתן לתכנן טוב יותר שבבי גל על ידי הוספת מערכים נוספים לשיפור הלכידה.
מסנני אליפסה גדולים מאורגנים עם מיקרו-עמודים אליפטיים ארוכים ליצירת מנהרות קו קו המשיגות יעילות לכידה גבוהה. עם זאת, המגבלה של לכידה זו היא שטוהר הלכידה אינו גבוה מספיק או טוהר לכידה גבוה אינו מושג בקלות. עבור שבב גל, המרווחים הקטנים משמשים ללכידת CTCs, וה- CTCs שהוחמצו נלכדים על ידי המערכים הבאים. המרווחים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה ולביטול הפרעות מ-RBCs, ובכך משפרים את טוהר הלכידה; עם זאת, יעילות הלכידה מוצקה מעל 90% והיא ניתנת לשחזור.
אימות קליני משמעותי בבידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים. עבודה זו מציגה את הבידוד הקליני של CTCs מחולי מעי גס עם מסנני אליפסה גדולים, מסנני אליפסה קטנים ושבבי גל. מטרת השבבים המיקרופלואידים המתוכננים היא למנות קלינית CTCs. עבור השיטות הקיימות של מערכות או פלטפורמות אחרות, יעילות הלכידה נמוכה, או שיעילות הלכידה אינה גבוהה מספיק כדי שהשיטה תשמש ביעילות ביישומים קליניים.
בהתבסס על הביצועים הקליניים של שלושת השבבים המיקרופלואידים הללו, בעלי יעילות לכידה גבוהה, הם יכולים להיות מיושמים במוצרי CTC, במיוחד לאחר שינוי. כוחו של הפרוטוקול שלנו הוא בכך שהוא מדגים ספירה של מספר נדיר של תאי גידול כדי לחקות דגימות קליניות אמיתיות. בנוסף, ההליך הניסויי הקליני אפשרי ומעשי. שיטה זו יכולה להפריד CTCs מדם שלם של המטופל. לכן, השיטה מתאימה ליישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודת מחקר זו נתמכה על ידי קרן Anhui למדעי הטבע של סין (1908085MF197, 1908085QB66), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21904003), פרויקט המחקר המדעי של ועדת החינוך של טיאנג'ין (2018KJ154), תוכנית המחקר המחוזית למדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה במחוז אנחווי (KJ2020A0239), ומעבדת המפתח של שנחאי לעיבוד מידע רב-ממדי, מעבדת המפתח של מזרח סין למידע רב-ממדי עיבוד, אוניברסיטת מזרח סין הרגילה (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
