Summary
El chip microfluídico clínico es una importante técnica de análisis biomédico que simplifica el preprocesamiento clínico de las muestras de sangre de los pacientes y tiñe inmunofluorescentemente las células tumorales circulantes (CTC) in situ en el chip, lo que permite la rápida detección e identificación de una sola CTC.
Abstract
Las células tumorales circulantes (CTC, por sus siglas en inglés) son importantes en el pronóstico, el diagnóstico y la terapia contra el cáncer del cáncer. La enumeración de CTC es vital para determinar la enfermedad del paciente, ya que las CTC son raras y heterogéneas. Las CTC se desprenden del tumor primario, entran en el sistema de circulación sanguínea y pueden crecer en sitios distantes, haciendo metástasis en el tumor. Dado que las CTC contienen información similar a la del tumor primario, el aislamiento de CTC y la caracterización posterior pueden ser fundamentales para el seguimiento y el diagnóstico del cáncer. La enumeración, la modificación de la afinidad y la tinción con inmunofluorescencia clínica de CTC raras son métodos eficaces para el aislamiento de CTC porque proporcionan los elementos necesarios con alta sensibilidad. Los chips microfluídicos ofrecen un método de biopsia líquida que no produce ningún dolor para los pacientes. En este trabajo, presentamos una lista de protocolos para chips microfluídicos clínicos, una plataforma versátil de aislamiento de CTC, que incorporan un conjunto de funcionalidades y servicios necesarios para la separación, análisis y diagnóstico precoz de CTC, facilitando así el análisis biomolecular y el tratamiento del cáncer. El programa incluye el recuento de células tumorales raras, el preprocesamiento clínico de la sangre del paciente, que incluye la lisis de glóbulos rojos, y el aislamiento y reconocimiento de CTC in situ en chips microfluídicos. El programa permite la enumeración precisa de células tumorales o CTCs. Además, el programa incluye una herramienta que incorpora el aislamiento de CTC con chips microfluídicos versátiles y la identificación de inmunofluorescencia in situ en los chips, seguida de un análisis biomolecular.
Introduction
Las células tumorales circulantes (CTC, por sus siglas en inglés) son importantes en el pronóstico, el diagnóstico y la terapia contra el cáncer del cáncer. La enumeración de CTC es vital, ya que las CTC son raras y heterogéneas. La enumeración, la modificación de la afinidad y la tinción con inmunofluorescencia clínica de CTC raras son técnicas poderosas para el aislamiento de CTC porque ofrecen los elementos necesarios con alta sensibilidad1. Un número raro de células tumorales mezcladas con sangre normal imita de cerca la sangre real del paciente, ya que 2-3 ml de sangre real del paciente solo contienen 1-10 CTC. Para resolver un problema experimental crítico, en lugar de utilizar un gran número de células tumorales introducidas en PBS o mezcladas con sangre normal, el uso de un número raro de células tumorales nos proporciona un número bajo de células sanguíneas, lo que se acerca más a la realidad a la hora de realizar un experimento.
El cáncer es la primera causa de muerte en el mundo2. Las CTC son células tumorales desprendidas del tumor original que circulan en los sistemas de circulación sanguínea y linfática3. Cuando las CTC se trasladan a un nuevo entorno de supervivencia, crecen como un segundo tumor. Esto se denomina metástasis y es responsable del 90% de las muertes en pacientes con cáncer4. Las CTC son vitales para el pronóstico, el diagnóstico precoz y la comprensión de los mecanismos del cáncer. Sin embargo, las CTC son extremadamente raras y heterogéneas en la sangre de los pacientes 5,6.
Los chips microfluídicos ofrecen una biopsia líquida que no invade el tumor. Tienen la ventaja de ser portátiles, de bajo costo y de tener una báscula adaptada a la celda. El aislamiento de CTC con chips microfluídicos se clasifica principalmente en dos tipos: basado en la afinidad, que se basa en la unión antígeno-anticuerpo 7,8,9 y es el método original y más utilizado de aislamiento de CTC; y los chips de base física, que utilizan las diferencias de tamaño y deformabilidad entre las células tumorales y las células sanguíneas 10,11,12,13,14,15, no tienen etiquetas y son fáciles de operar. La ventaja de los chips microfluídicos sobre las técnicas alternativas es que el enfoque basado en la física de los microfiltros de elipse grande captura firmemente los CTC con una alta eficiencia de captura. La razón de esto es que los micropostes de elipse están organizados en túneles delgados de huecos línea-línea. Los huecos línea-línea son diferentes de los huecos punto-punto tradicionales formados por micropostes, como los micropostes de rombos. La captura de CTC basada en chips de onda combina el aislamiento basado en propiedades físicas y en el aislamiento basado en afinidad. La captura basada en chips de onda involucra 30 matrices en forma de onda con el anticuerpo de anti-EpCAM recubierto en micropostes circulares. Los CTC son capturados por los pequeños huecos, y los grandes huecos se utilizan para acelerar el caudal. Los CTC perdidos tienen que pasar los pequeños huecos en la siguiente matriz y son capturados por el aislamiento basado en la afinidad integrado dentro del chip16.
El objetivo del protocolo es demostrar el recuento de un número raro de células tumorales y el análisis clínico de CTC con chips microfluídicos. El protocolo describe los pasos de aislamiento de CTC, cómo obtener un número bajo de células tumorales, la separación física clínica de los filtros de elipse pequeña, los filtros de elipse grande y los filtros trapezoidales, la modificación de la afinidad y el enriquecimiento17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Las muestras de sangre de los pacientes fueron suministradas por el Hospital Longhua Afiliado a la Universidad Médica de Shanghái.El protocolo sigue las pautas del comité de ética de investigación humana del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para el uso de las muestras con fines de investigación.
1. Pre-experimento para comprobar la eficiencia de captura con células tumorales cultivadas
- Cultive las células tumorales MCF-7, MDA-MB-231 y HeLa para determinar la eficiencia de captura. Diluya la suspensión de células tumorales, cuente el número de células tumorales y repita hasta obtener el número deseado de células en 1 ml de PBS.
- Cultive las células en un matraz de cultivo celular con un número de células inicial de ~ 1 x 105 células en 1 ml del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina al 1%. Incubar en una atmósfera humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2 .
- Cuando las líneas celulares crezcan como monocapas adherentes al 95% de confluencia, separarlas de las placas de cultivo con una solución de tripsina al 0,25% durante 2 min como se describe en Chen et al.16.
- Tiñir las células tumorales con calceína AM. Coloque 3 μL de calceína AM en la placa de cultivo y mantenga la placa en la incubadora durante 30 min. Luego, digiere todas las células con tripsina.
- Contar las células tumorales cultivadas en PBS con una cámara de recuento celular y diluir hasta obtener 100 células tumorales por 1 ml de PBS.
NOTA: Para enumerar con precisión el número de células, tome 50 μL de la suspensión celular obtenida para ver si el número de células tumorales en ella es cinco o no con un microscopio. Decidir el volumen de suspensión celular que se necesita tomar para obtener 100 células tumorales de acuerdo con el número real de células tumorales en 50 μL de suspensión celular.
- Introducir la suspensión celular que contiene 100 células tumorales por 1 ml de PBS en el chip microfluídico utilizando una jeringa con una bomba de jeringa a caudales variables de 0,5 ml/h, 1 ml/h, 2 ml/h, 3 ml/h, 4 ml/h y 5 ml/h. Obtenga la eficiencia de captura para los distintos caudales y determine el caudal óptimo.
- Cuente el número de células tumorales capturadas en el chip y que salen de la salida. Calcule la eficiencia de captura de la siguiente manera:
Eficiencia de captura = Número de celdas capturadas/(Número de celdas capturadas + número de celdas que salen) × 100% - Repita para obtener la eficiencia de captura para diferentes números de células tumorales de 10 a 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
- Cuente el número de células tumorales capturadas en el chip y que salen de la salida. Calcule la eficiencia de captura de la siguiente manera:
- Pruebe y valide el chip microfluídico para detectar un número raro de células tumorales. Inyecte estas 10 suspensiones de muestra en los chips microfluídicos con una aguja hueca hecha con un extractor de micropipetas para aspirar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 células tumorales diluidas en 1 ml de PBS. Detecte y enumere el número de células tumorales para cada muestra después de su captura en el chip.
NOTA: La aguja hueca mide unos 3 cm de longitud con un diámetro exterior de 1 mm. - Realizar pruebas clínicas previas al experimento para detectar células tumorales introducidas en muestras de sangre normales.
- Tiñir las células tumorales con calceína AM y luego enumerar 100 células tumorales en 5 μL de PBS. Coloque estas células en 1 ml de muestras de sangre normal entera. Introduzca estas células en el chip y enumere el número de células tumorales capturadas en el chip con inmunofluorescencia verde. Realice la enumeración in vivo en el chip como se ha descrito anteriormente y calcule la eficiencia de captura después de la captura.
- Repita el paso 1.4.1 para nueve concentraciones adicionales de números de células tumorales de 10 a 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- Enumere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 células tumorales como se describe en el paso 1.3 sin tinción, coloque un pico en 1 ml de sangre normal completa, introduzca estas muestras en el chip microfluídico y capture las células tumorales en el chip.
- Mancha el chip con Hoechst, CK-FITC y CD45-PE. Coloque 3-5 μL de tinte fluorescente en 20-30 μL de PBS y luego introduzca esta solución en el chip microfluídico con una jeringa. Enumere el número de células tumorales capturadas en el chip con inmunofluorescencia azul y verde para determinar la eficiencia de captura.
- Realizar la modificación del chip microfluídico para la captura basada en afinidad de anti-EpCAM.
NOTA: Dado que el chip de onda combina el aislamiento basado en la afinidad y el aislamiento basado en propiedades físicas, modifique el chip con agentes.- Modifique la superficie del chip con 100 μL de 3-mercaptopropil trimetoxisilano al 4% (v/v) en etanol a temperatura ambiente durante 45 min. Introduzca esta solución en la viruta con cuidado y lentamente en caso de que destruya la estructura interna de la viruta, especialmente la unión de la superficie superior y el vidrio del sustrato.
NOTA: La superficie de la viruta se modifica utilizando mercaptosilane. Las interacciones que se producen en el chip están determinadas por enlaces químicos. Se establecen enlaces químicos para realizar la unión del anticuerpo modificado con el antígeno. Varios reactivos se modifican dentro del chip para establecer enlaces químicos que se conectan entre sí. El último reactivo que se modifica es una molécula de adhesión antiepitelial (anti-EpCAM). El antígeno de superficie de las células tumorales de EpCAM se combina con anti-EpCAM dentro del chip para realizar la captura de los CTC. - Lavar con etanol 3 veces. Agregue 100 μL del agente de acoplamiento N-y-éster de succinimida de maleimidobutiriloxi (GMBS, 1 μM) en el chip y deje que interactúe durante 30 minutos.
- Lavar con PBS 3x. Use una jeringa para introducir 1 ml de PBS en el chip a lavar.
- Tratar el chip con 30-40 μL de 10 μg/mL de neutravidina a temperatura ambiente durante 30 min, lo que lleva a la inmovilización de las células en el GMBS, y luego enjuagar con PBS para eliminar el exceso de avidina.
- Modifique el chip con 3 μL de anticuerpo EpCAM antibiotinilado a una concentración de 10 μg/mL en 100 μL de PBS con BSA al 1% (p/v). Mantenga esto durante la noche.
- Modifique la superficie del chip con 100 μL de 3-mercaptopropil trimetoxisilano al 4% (v/v) en etanol a temperatura ambiente durante 45 min. Introduzca esta solución en la viruta con cuidado y lentamente en caso de que destruya la estructura interna de la viruta, especialmente la unión de la superficie superior y el vidrio del sustrato.
2. Experimento clínico en el chip para enumerar las células tumorales circulantes (CTC)
- Procese previamente las muestras de sangre de pacientes con cáncer clínico utilizando una solución de lisis de glóbulos rojos (RBCL), o introduzca 2-3 ml de la muestra de sangre directamente en el chip microfluídico con una jeringa.
- Realice el preprocesamiento, que tarda unos 30 minutos. Recolectar muestras de sangre entera en tubos de anticoagulación. Agregue 6-9 ml de solución de lisis RBS en 2-3 ml de sangre. Centrifugar a 111 x g durante 5-8 min a temperatura ambiente y desechar la capa superior de líquido transparente rojo.
- Capture, tiña, reconozca y enumere las celdas del chip como se describe a continuación.
- Capture las células del chip como se describe en el paso 1.Tiña el chip para las CTC capturadas con Hoechst, CK-FITC y CD45-PE. CK-FITC es una tinción específica para las células tumorales, y CD45-PE es para los glóbulos blancos.
- Añadir 3 μL de CK-FITC a 20 μL de PBS. Introdúzcalo en la jeringa y bombee el CK-FITC diluido sobre el chip. Dejar manchar durante 30 min. Introduzca 300 μL de PBS en el chip para lavarlo.
- Agregue 3 μL de CD45-PE a 20 μL de PBS. Introdúzcalo en la jeringa y bombee el CD45-PE diluido en el chip. Deje reposar durante 30 min. Introduzca 300 μL de PBS en el chip para lavarlo.
- Identifique las CTC con un microscopio de fluorescencia invertida con un aumento de 20x o 40x. Las CTC emiten fluorescencia azul y verde, y los glóbulos blancos (WBC) emiten fluorescencia azul y roja. Identifique los CTC con fluorescencia azul y verde y los glóbulos blancos con fluorescencia azul y roja.
- A partir de las imágenes de inmunofluorescencia, enumere el número de CTC capturadas en el chip. Enumere los CTC como Hoechst+/CK-FITC+/CD45− y los WBC como Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
- Enriquezca los CTC capturados enjuagándolos con PBS a través de la jeringa en la dirección inversa sobre el chip microfluídico para recolectar los CTC capturados en el chip desde la entrada. Utilice una jeringa con 1 ml de PBS, introdúzcala desde la salida para enriquecer los CTC capturados en el chip en 2-3 minutos y recójalos de la entrada. Use 1 ml de PBS para cada paso de lavado y repita 3 veces.
- Tiñe las células tumorales o CTC capturadas en el chip microfluídico como se describe a continuación.
- Tinción con calceína AM. Añadir 5 μL de calceína AM a 20 μL de PBS, teñir las células durante 30 min, luego centrifugar a 111 x g durante 2 min a temperatura ambiente para obtener células tumorales, y suspender en 1 mL de PBS.
- Para identificar los núcleos celulares, agregue 20 μL de solución DAPI (10 μL de reactivo DAPI en 20 μL de PBS) al chip al caudal óptimo de 1 mL/h para microfiltros de elipse grande y 1,5 mL/h para los trapezoidales. Pasar a través de 20 μL de solución madre anti-citoqueratina (3 μL de anticuerpo anti-citoqueratina en 20 μL de PBS) para reaccionar con el chip durante 30 min.
- Tiñe los glóbulos blancos capturados en el chip. Una vez capturadas las CTC en el chip, añadir 25 μL de solución de anticuerpos anti-CD45 (5 μL de solución anti-CD45 en 20 μL de PBS) al chip y dejar teñir durante 30 min. Lavar con PBS e identificar las células epiteliales con fluorescencia azul y verde.
- Realice la identificación de inmunofluorescencia con microscopía de fluorescencia como se describe a continuación.
- Utilice un microscopio de fluorescencia y excite la muestra con el láser azul. Encuentra las células que emiten fluorescencia azul, que son células nucleadas. Utilice uno de los siguientes aumentos: 10x, 20x o 40x. Encuentre un campo despejado para la célula tumoral. Para la fuente láser azul, utilice una longitud de onda de placa de excitación de 420-485 nm y una longitud de onda de placa de emisión de 515 nm.
- Sin mover las muestras, utilice otra fuente láser. Gire el microscopio de fluorescencia y excite la muestra con el láser verde. Encuentra las células que emiten fluorescencia verde, que es indicativa de células tumorales. Tome imágenes del mismo campo con el mismo aumento con esta fuente láser verde. Las células que emiten fluorescencia azul y verde se reconocen como células tumorales. Para la fuente láser verde, utilice una longitud de onda de placa de excitación de 460-550 nm y una longitud de onda de placa de emisión de 590 nm
- Sin mover las muestras, utilice otra fuente láser. Gire el microscopio de fluorescencia y excite la muestra con el láser rojo. Encuentra las células que emiten fluorescencia roja. Tome imágenes del mismo campo con el mismo aumento con esta fuente láser roja. Las células que emiten fluorescencia azul y roja se reconocen como glóbulos blancos.
- Guarde la imagen para obtenerla utilizando cada una de las fuentes láser anteriores. Tome varias imágenes del mismo campo con luces de diferentes colores.
- Utilice luz ultravioleta con una longitud de onda de placa de excitación de 330-400 nm y una longitud de onda de placa de emisión de 425 nm. Utilice luz púrpura con una longitud de onda de placa de excitación de 395-415 nm y una longitud de onda de placa de emisión de 455 nm.
- Calcule la eficiencia de captura como en el paso 1.2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toda la configuración incluye una bomba de jeringa, una jeringa y un chip microfluídico. La suspensión celular en la jeringa se conecta a la bomba de jeringa y la suspensión celular se introduce en el chip microfluídico para capturar las células. La eficiencia de captura de todos los chips microfluídicos utilizados fue de alrededor del 90% o más. Para el chip de onda, diseñamos microestructuras con huecos variados. Los pequeños huecos se utilizan para capturar los CTC, y los grandes huecos se utilizan para acelerar el caudal. La suspensión de la célula fluye rápidamente en las áreas de grandes huecos. Los CTC perdidos tienden a ser capturados por las pequeñas brechas en la matriz subsiguiente16. En el caso de los chips de elipse, diseñamos espacios línea-línea en lugar de espacios punto-punto para formar un túnel delgado para mejorar la captura. Por lo tanto, se logró una alta eficiencia de captura1. Diseñamos una estructura de elipse para evitar bordes y esquinas para mantener la viabilidad. Los filtros trapezoidales tienen dos canales circulares en espiral con barreras trapezoidales y circulares micropostes incrustadas. En el caso de los filtros trapezoidales, las eficiencias de captura para MCF-7, MDA-MB-231 y HeLa fueron del 94%, 95% y 93%, respectivamente18.
La Figura 1 muestra que todas las células tumorales fueron capturadas por el chip de onda. Dado que todas las células tumorales se concentraron alrededor de la matriz de micropostes de onda, esto indica una alta eficiencia de captura para este chip microfluídico, como lo demuestra el número de células tumorales que se capturaron. Por lo tanto, esta configuración hace que sea mucho más fácil capturar células tumorales raras; De hecho, el chip está fabricado para capturar un gran número de células tumorales, así como un número raro de células tumorales. Por ejemplo, si el chip es lo suficientemente sólido o reproducible como para capturar 10.000 células tumorales, es fácil que el chip capture entre 10 y 100 células. El video 1 muestra cómo se obtuvo un número raro de células tumorales para el pre-experimento. Se utilizó una aguja hueca hecha con un extractor de micropipetas para aspirar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 células tumorales de una placa de cultivo con células tumorales diluidas teñidas con calceína AM en PBS. Las células fueron absorbidas por el tubo de gel de sílice conectado con la aguja hueca. Se succionó una célula tumoral con inmunofluorescencia verde en la aguja hueca. El soplado en el tubo hueco llevó a que la célula tumoral dentro de la aguja hueca se descargara en un tubo de microcentrífuga1. Este es el procedimiento para obtener células tumorales raras. En la figura 2 se muestran las CTC de un paciente con cáncer gástrico capturadas con microfiltros de elipse pequeña. La Figura 3 muestra las CTC de un paciente con cáncer colorrectal capturadas con microfiltros trapezoidales y emitiendo fluorescencia azul y verde. La Figura 4 muestra las células tumorales que crecen en el chip después de la captura, que están listas para ser tratadas con medicamentos contra el cáncer. Estos hallazgos ilustran que los microfiltros de elipse grande no tienen ningún efecto negativo sobre la viabilidad celular.
La Figura 5 muestra el análisis clínico de inmunofluorescencia de CTC colorrectales capturadas en el chip microfluídico. Estos se observan en campo claro y se tiñen con tinción de Hoechst, CK-FITC y CD45-PE. Los CTC se reconocieron como DAPI+/CK+/CD45−, y los leucocitos se identificaron como DAPI+/CK−/CD45+. La Figura 6 muestra las células tumorales colorrectales cultivadas en el chip de elipse grande después de la captura. La figura 7 muestra las células tumorales colorrectales capturadas en los microfiltros de elipse grande. Clínicamente, las CTC en la sangre de los pacientes se capturaron mediante chips de onda, microfiltros trapezoidales y microfiltros de elipse grande, lo que indica que estos tres chips tienen éxito en la captura de CTC. Potencialmente, podrían aplicarse en productos de CTC, como los productos de aislamiento de CTC, con alta eficiencia.
Figura 1: Captura de chips de onda. Todas las células tumorales de MCF-7 fueron capturadas alrededor de la matriz del chip de onda sin que faltara ninguna célula. Dado que no había células tumorales en ninguna otra área además de la matriz, esto indica la alta eficiencia de captura del chip. Se capturó un gran número de células tumorales. Por lo tanto, las células tumorales raras también se pueden capturar fácilmente. Las células tumorales de MCF-7 se capturaron mediante chip de onda y (A) se tiñeron con Hoechst y (B) se tiñeron con calceína AM. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Muestra clínica de CTCs capturada por microfiltros de elipse pequeña. CTC clínicas de un paciente con cáncer gástrico capturadas por microfiltros de elipse pequeña. Las CTC se identificaron en campo claro y con fluorescencia azul y verde. El círculo azul en (A) indica una CTC de un paciente con cáncer gástrico capturado dentro del chip. A partir de las imágenes tomadas, se puede ver que no había otras celdas en ninguna otra área, lo que indica que la pureza de captura era alta para este chip. Las células tumorales de MCF-7 se capturaron mediante microfiltros de elipse pequeña y se observaron en (A) campo claro, (B) teñido con Hoechst y (C) teñido con CK-FITC. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Muestra clínica de CTCs captada por microfiltros trapezoidales. Las CTC clínicas de un paciente con cáncer colorrectal se capturaron mediante microfiltros trapezoidales. En estas imágenes, se puede ver que se capturaron seis CTC, lo que indica que la eficiencia de captura fue alta en el campo pequeño. Además, no aparecieron otras células, lo que indica que la pureza de captura era extremadamente alta para este chip. Las células tumorales de MCF-7 se capturaron mediante microfiltros trapezoidales y se observaron en (A) campo claro, (B) teñidas con Hoechst y (C) teñidas con CK-FITC. Barra de escala: 20 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cultivo de CTCs capturadas por microfiltros de elipse grande. Las células tumorales de MCF-7 se capturaron mediante microfiltros de elipse grande frente a una matriz de micropostes de elipse grande. Ninguna célula tumoral pasó a través de la matriz, lo que indica una alta eficiencia de captura para este chip. Después de la captura, las células tumorales crecieron durante 24-48 h. Esto indica que tanto la eficiencia de captura como la viabilidad fueron muy altas para los microfiltros de elipse grande. Las células tumorales cultivadas de MCF-7 se capturaron mediante microfiltros de elipse grande y se observaron en (A) 0 h después de la captura, (B) 24 h después de la captura y (C) 48 h después de la captura. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de una muestra clínica utilizada para la captura de CTC mediante microfiltros trapezoidales. Las CTC clínicas de un paciente con cáncer colorrectal se capturaron mediante microfiltros trapezoidales. En estas imágenes, se puede ver que se capturaron dos CTC, lo que indica una alta eficiencia de captura. No hubo ninguna otra alteración celular, excepto residuos de glóbulos rojos en el chip. Por lo tanto, para el preprocesamiento clínico de la captura de CTC, es mejor no utilizar la lisis de glóbulos rojos. Las CTC del cáncer colorrectal se capturaron mediante microfiltros trapezoidales y se observaron en (A) campo claro, (B) teñido con Hoechst, (C) teñido con CK-FITC y (D) visto en imágenes combinadas. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplo de CTC cultivadas capturadas por un chip de elipse grande. Cultivos de células tumorales de células MCF-7 delante de la matriz de micropostes de elipse grande y detrás de los microfiltros de elipse grande. Las células tumorales teñidas con calceína AM que emitía fluorescencia verde crecieron como se deseaba, lo que indica que la viabilidad celular de este chip era muy alta. En total, había 15 arrays, con huecos variados para cada array organizados por micropostes de grandes elipses. Las células tumorales MCF-7 se cultivaron en el chip de elipse grande después de la captura (A) en una matriz y (B) en otra matriz. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Ejemplo de una muestra clínica utilizada para la captura de CTC mediante microfiltros de gran elipse. Las CTC clínicas de un paciente con cáncer colorrectal se capturaron mediante microfiltros de elipse grande. A partir de las imágenes, se puede ver que había contaminación por glóbulos rojos. Esto indica que la muestra de sangre completa del paciente debe diluirse y que el chip debe enjuagarse después de la captura. Las CTC de muestras de sangre de pacientes clínicos con cáncer colorrectal se capturaron en el chip de elipse grande y se observaron en (A) campo claro, (B) teñido con Hoechst y (C) teñido con CK-FITC. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El pronóstico y el diagnóstico precoz del cáncer tienen un efecto significativo en el tratamiento del cáncer1. El aislamiento de CTC con chips microfluídicos ofrece una biopsia líquida sin invasión. Sin embargo, las CTC son extremadamente raras y heterogéneas en la sangre1, lo que dificulta su aislamiento. Las CTC tienen propiedades similares a las fuentes tumorales originales de las que se originan. Por lo tanto, las CTC juegan un papel vital en la metástasis del cáncer1.
El protocolo propuesto permite un análisis completo del aislamiento de CTC con el chip microfluídico. El protocolo incluye todos los procedimientos clave relacionados con el aislamiento de CTC. Por ejemplo, este protocolo incluye análisis de RBCL, que se registran meticulosamente y se organizan en diferentes paquetes, adquisición de células tumorales raras, determinación de la tasa de flujo óptima, eficiencia de captura, caracterización clínica y enumeración. La gestión cuidadosa de las operaciones facilita el procesamiento clínico de las muestras de los pacientes. El protocolo permite el preprocesamiento y procesamiento de muestras clínicas de pacientes y ofrece servicios vitales para los médicos.
Para el aislamiento de CTC, el preprocesamiento de células tumorales raras es extremadamente difícil de realizar. Esta dificultad se resolvió mediante el uso de una aguja hueca introducida a través de un extractor de agujas para succionar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 células tumorales según se desee. A continuación, se preparó una muestra de sangre clínica del paciente casi real con el número deseado de células tumorales mezcladas con sangre normal, imitando una muestra de sangre del paciente. Con estas muestras artificiales de sangre de pacientes, se llevó a cabo un experimento casi real. Este método ha resuelto un problema difícil que generalmente se encuentra en el aislamiento de CTC para experimentos previos. Este enfoque no es fácil de llevar a cabo y nunca se ha informado en ningún otro lugar; Sin embargo, es un enfoque útil antes de realizar un experimento clínico real.
El aislamiento CTC con chips microfluídicos se clasifica en tres tipos: basado en afinidad, basado en físico y basado en inmunomagnetismo. Para el aislamiento basado en la afinidad, es necesario modificar el chip microfluídico. Se han incluido los procedimientos de modificación específicos para la modificación con anti-EpCAM. Las CTC se identificaron mediante tinción de inmunofluorescencia con Hoechst, CK-FITC y CD45-PE. Dado que muchas células tumorales expresan EpCAM, el anti-EpCAM es un anticuerpo importante para capturar CTC en la sangre del paciente. Sin embargo, el anti-EpCAM es muy caro; Por lo tanto, se han desarrollado muchos aptámeros para resolver este problema. Utilizamos principalmente chips microfluídicos de base física, como microfiltros de elipse pequeña y microfiltros trapezoidales, para capturar CTC, ya que son simples, fáciles de operar y efectivos.
La ventaja de esta técnica sobre las técnicas alternativas es que el chip de base física de los microfiltros de elipse grande captura firmemente las CTC con una alta eficiencia de captura. La razón de esto es que hay túneles delgados de huecos línea-línea. Los chips de onda capturan CTC mediante la combinación de aislamiento basado en propiedades físicas y basado en afinidad. Los CTC son capturados por los pequeños huecos, y los grandes huecos se pueden utilizar para acelerar el caudal. Los CTC perdidos tienen que pasar a través de los pequeños huecos en las siguientes matrices y también son capturados por el aislamiento basado en afinidad.
El protocolo ha resuelto varios problemas importantes en el aislamiento de CTC, especialmente para experimentos clínicos. Sin embargo, es imposible incluir todos los pasos detallados en el aislamiento de CTC, como el papel de las nanopartículas y nanoestructuras y la modificación de aptámeros. Estos aspectos también juegan un papel esencial en el aislamiento de CTC. Sin embargo, no son críticos para resolver problemas como la mejora de la eficiencia de la captura. Por el contrario, estos aspectos enriquecen el aislamiento del CTC con nuevos contenidos.
Este trabajo se centra en el aislamiento clínico de CTCs con el chip microfluídico diseñado. La mayoría de los chips microfluídicos utilizados se basan principalmente en la física, como los filtros de elipse grande y los filtros de elipse pequeña. Los chips de onda se fabrican combinando propiedades de chip basadas en afinidad y físicas1. Los micropostes de los filtros de elipse grande se diseñaron para ser más cortos para mejorar la pureza de captura en este trabajo. Los filtros de elipse pequeña también se pueden mejorar diseñándolos con tamaños de micropostes variados para diferentes matrices. Los chips de onda se pueden diseñar mejor agregando más matrices para mejorar la captura.
Los filtros de elipse grande se organizan con micropostes elípticos largos para formar túneles línea-línea que logran una alta eficiencia de captura. Sin embargo, la limitación de esta captura es que la pureza de captura no es lo suficientemente alta o no se obtiene fácilmente una pureza de captura alta. En el caso del chip de onda, los pequeños huecos se utilizan para capturar los CTC, y los CTC perdidos se capturan mediante las siguientes matrices. Los grandes huecos se utilizan para acelerar el caudal y eliminar la perturbación de los glóbulos rojos, mejorando así la pureza de la captura; sin embargo, la eficiencia de captura es sólida por encima del 90% y es reproducible.
La validación clínica es significativa en el aislamiento de CTC con chips microfluídicos. En este trabajo se presenta el aislamiento clínico de CTC de pacientes colorrectales con filtros de elipse grande, filtros de elipse pequeña y chips de onda. El objetivo de los chips microfluídicos diseñados es enumerar clínicamente las CTC. Para los métodos existentes de algunos otros sistemas o plataformas, la eficiencia de captura es baja, o la eficiencia de captura no es lo suficientemente alta como para que el método se utilice de manera efectiva en aplicaciones clínicas.
Sobre la base de las prestaciones clínicas de estos tres chips microfluídicos, que tienen una alta eficiencia de captura, pueden aplicarse potencialmente en productos CTC, especialmente después de la modificación. El punto fuerte de nuestro protocolo es que demuestra la enumeración de un número raro de células tumorales para imitar muestras clínicas reales. Además, el procedimiento clínico experimental es factible y práctico. Este método puede separar las CTC de la sangre total del paciente. Por lo tanto, el método es apropiado para aplicaciones clínicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo de investigación contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Anhui de China (1908085MF197, 1908085QB66), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21904003), el Proyecto de Investigación Científica de la Comisión de Educación de Tianjin (2018KJ154), el Programa Provincial de Investigación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de la Provincia de Anhui (KJ2020A0239) y el Laboratorio Clave de Procesamiento de Información Multidimensional de Shanghái, el Laboratorio Clave de Información Multidimensional de China Oriental Procesamiento, Universidad Normal del Este de China (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
