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Bioengineering

बहुमुखी परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव के लिए नैदानिक माइक्रोफ्लुइडिक चिप प्लेटफॉर्म

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/64674
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4
1School of Microelectronics and Data Science, Anhui University of Technology, 2Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Normal University, 3School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, 4Department of Medical Oncology, Changzheng Hospital

Summary

नैदानिक माइक्रोफ्लुइडिक चिप एक महत्वपूर्ण बायोमेडिकल विश्लेषण तकनीक है जो चिप पर सीटू में नैदानिक रोगी रक्त नमूना प्रीप्रोसेसिंग और इम्यूनोफ्लोरोसेंटली दाग परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को सरल बनाती है, जिससे एकल सीटीसी का तेजी से पता लगाने और पहचान करने की अनुमति मिलती है।

Abstract

परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) कैंसर का निदान, निदान और कैंसर विरोधी चिकित्सा में महत्वपूर्ण हैं। सीटीसी गणना रोगी रोग का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है क्योंकि सीटीसी दुर्लभ और विषम हैं। सीटीसी प्राथमिक ट्यूमर से अलग हो जाते हैं, रक्त परिसंचरण प्रणाली में प्रवेश करते हैं, और संभावित रूप से दूर के स्थानों पर बढ़ते हैं, इस प्रकार ट्यूमर को मेटास्टेसिस करते हैं। चूंकि सीटीसी प्राथमिक ट्यूमर के समान जानकारी लेते हैं, सीटीसी अलगाव और बाद के लक्षण वर्णन कैंसर की निगरानी और निदान में महत्वपूर्ण हो सकते हैं। दुर्लभ सीटीसी की गणना, आत्मीयता संशोधन और नैदानिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला सीटीसी अलगाव के लिए शक्तिशाली तरीके हैं क्योंकि वे उच्च संवेदनशीलता के साथ आवश्यक तत्व प्रदान करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स एक तरल बायोप्सी विधि प्रदान करते हैं जो रोगियों के लिए किसी भी दर्द से मुक्त है। इस काम में, हम नैदानिक माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के लिए प्रोटोकॉल की एक सूची प्रस्तुत करते हैं, एक बहुमुखी सीटीसी आइसोलेटिंग प्लेटफॉर्म, जिसमें सीटीसी पृथक्करण, विश्लेषण और प्रारंभिक निदान के लिए आवश्यक कार्यात्मकताओं और सेवाओं का एक सेट शामिल है, इस प्रकार बायोमोलेक्यूलर विश्लेषण और कैंसर उपचार की सुविधा है। कार्यक्रम में दुर्लभ ट्यूमर सेल गिनती, नैदानिक रोगी रक्त प्रीप्रोसेसिंग शामिल है, जिसमें लाल रक्त कोशिका लाइसिस, और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स पर सीटू में सीटीसी का अलगाव और मान्यता शामिल है। इसके अतिरिक्त, कार्यक्रम में एक उपकरण शामिल है जो चिप्स पर सीटू में बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स और इम्यूनोफ्लोरेसेंस पहचान के साथ सीटीसी अलगाव को शामिल करता है, इसके बाद बायोमोलेक्यूलर विश्लेषण होता है।

Introduction

परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) कैंसर का निदान, निदान और कैंसर विरोधी चिकित्सा में महत्वपूर्ण हैं। सीटीसी गणना महत्वपूर्ण है क्योंकि सीटीसी दुर्लभ और विषम हैं। दुर्लभ सीटीसी की गणना, आत्मीयता संशोधन और नैदानिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला पन सीटीसी अलगाव के लिए शक्तिशाली तकनीकें हैं क्योंकि वेउच्च संवेदनशीलता के साथ आवश्यक तत्व प्रदान करते हैं। सामान्य रक्त के साथ मिश्रित ट्यूमर कोशिकाओं की दुर्लभ संख्या वास्तविक रोगी के रक्त की बारीकी से नकल करती है क्योंकि वास्तविक रोगी रक्त के 2-3 मिलीलीटर में केवल 1-10 सीटीसी होते हैं। एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक समस्या को हल करने के लिए, पीबीएस में पेश की गई या सामान्य रक्त के साथ मिश्रित बड़ी संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करने के बजाय, दुर्लभ संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग हमें रक्त कोशिकाओं की कम संख्या प्रदान करता है, जो एक प्रयोग करते समय वास्तविकता के करीब है।

कैंसर दुनिया में मौत का प्रमुख कारणहै। सीटीसी मूल ट्यूमर से निकलने वाली ट्यूमर कोशिकाएं हैं जो रक्त और लसीकापरिसंचरण प्रणालियों में फैलती हैं। जब सीटीसी एक नए उत्तरजीविता वातावरण में चले जाते हैं, तो वे दूसरे ट्यूमर के रूप में बढ़ते हैं। इसे मेटास्टेसिस कहा जाता है और यहकैंसर रोगियों में 90% मौतों के लिए जिम्मेदार है। सीटीसी रोग का निदान, प्रारंभिक निदान और कैंसर के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, सीटीसी रोगीके रक्त में बेहद दुर्लभ और विषम हैं।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स एक तरल बायोप्सी प्रदान करते हैं जो ट्यूमर पर आक्रमण नहीं करता है। उनके पास पोर्टेबल, कम लागत और सेल-मिलान स्केल होने का लाभ है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ सीटीसी के अलगाव को मुख्य रूप से दो प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: आत्मीयता-आधारित, जो एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग 7,8,9 पर निर्भर करता है और सीटीसी अलगाव की मूल और सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है; और भौतिक-आधारित चिप्स, जो ट्यूमर कोशिकाओं और रक्त कोशिकाओं10,11,12,13,14,15 के बीच आकार और विकृति के अंतर का उपयोग करते हैं, लेबल-मुक्त हैं, और संचालित करना आसान है। वैकल्पिक तकनीकों पर माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का लाभ यह है कि बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर का भौतिक-आधारित दृष्टिकोण दृढ़ता से उच्च कैप्चर दक्षता के साथ सीटीसी को पकड़ता है। इसका कारण यह है कि दीर्घवृत्त माइक्रोपोस्ट को लाइन-लाइन अंतराल की पतली सुरंगों में व्यवस्थित किया जाता है। लाइन-लाइन अंतराल पारंपरिक बिंदु-बिंदु अंतराल से अलग हैं जो माइक्रोपोस्ट जैसे कि रोचबस माइक्रोपोस्ट द्वारा बनाए जाते हैं। सीटीसी की वेव चिप-आधारित कैप्चरिंग भौतिक संपत्ति-आधारित और आत्मीयता-आधारित अलगाव दोनों को जोड़ती है। वेव चिप-आधारित कैप्चर में गोलाकार माइक्रोपोस्ट पर लेपित एंटी-ईपीकैम के एंटीबॉडी के साथ 30 तरंग-आकार के सरणियां शामिल हैं। सीटीसी को छोटे अंतराल द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, और प्रवाह दर में तेजी लाने के लिए बड़े अंतराल का उपयोग किया जाता है। छूटे हुए सीटीसी को अगली सरणी में छोटे अंतराल को पार करना पड़ता है और चिप16 के अंदर एकीकृत आत्मीयता-आधारित अलगाव द्वारा कैप्चर किया जाता है।

प्रोटोकॉल का लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं की दुर्लभ संख्या की गिनती और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ सीटीसी के नैदानिक विश्लेषण को प्रदर्शित करना है। प्रोटोकॉल सीटीसी अलगाव चरणों का वर्णन करता है, ट्यूमर कोशिकाओं की कम संख्या कैसे प्राप्त करें, छोटे-दीर्घवृत्त फिल्टर, बड़े-दीर्घवृत्त फिल्टर, और ट्रेपोज़ॉइड फिल्टर, आत्मीयता संशोधन और संवर्धन17 का नैदानिक भौतिक पृथक्करण।

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Protocol

रोगी के रक्त के नमूने शंघाई मेडिकल यूनिवर्सिटी से संबद्ध लोंगहुआ अस्पताल द्वारा आपूर्ति किए गए थे। प्रोटोकॉल पेकिंग विश्वविद्यालय के तीसरे अस्पताल की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है। अनुसंधान उद्देश्यों के लिए नमूनों का उपयोग करने के लिए रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कैप्चर दक्षता की जांच करने के लिए पूर्व-प्रयोग

  1. कैप्चर दक्षता निर्धारित करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं एमसीएफ -7, एमडीए-एमबी -231, और हेला को कल्चर करें। ट्यूमर सेल निलंबन को पतला करें, ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, और पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं की वांछित संख्या प्राप्त होने तक दोहराएं।
    1. एक सेल कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 1 एमएल में ~ 1 x 105 कोशिकाओं की शुरुआती सेल संख्या के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है। 5% सीओ2 वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें।
    2. जब सेल लाइनें 95% संगम के लिए अनुगामी मोनोलेयर के रूप में बढ़ती हैं, तो उन्हें चेन एट अल .16 में वर्णित 2 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन समाधान के साथ संस्कृति व्यंजनों से अलग करें।
    3. कैल्सीन एएम के साथ ट्यूमर कोशिकाओं को दाग दें। कल्चर डिश में कैल्सीन एएम के 3 μL डालें, और पकवान को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें। फिर, ट्रिप्सिन के साथ सभी कोशिकाओं को पचाएं।
    4. सेल काउंटिंग चैंबर के साथ पीबीएस में सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं की गणना करें, और तब तक पतला करें जब तक कि पीबीएस के प्रति 1 एमएल 100 ट्यूमर कोशिकाएं प्राप्त न हों।
      नोट: सेल संख्या की सटीक गणना करने के लिए, माइक्रोस्कोप के साथ यह देखने के लिए प्राप्त सेल निलंबन का 50 μL लें कि इसमें ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या पांच है या नहीं। सेल निलंबन की मात्रा तय करें जिसे सेल निलंबन के 50 μL में ट्यूमर कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के अनुसार 100 ट्यूमर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए।
  2. 0.5 एमएल/घंटा, 1 एमएल/घंटा, 2 एमएल/घंटा, 3 एमएल/घंटा, 4 एमएल/घंटा, और 5 एमएल/घंटा की विभिन्न प्रवाह दरों पर सिरिंज पंप के साथ सिरिंज का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चिप में 100 ट्यूमर कोशिकाओं वाले सेल सस्पेंशन को पेश करें। विभिन्न प्रवाह दरों के लिए कैप्चर दक्षता प्राप्त करें, और इष्टतम प्रवाह दर निर्धारित करें।
    1. चिप पर कैप्चर किए गए और आउटलेट से बाहर बहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। नीचे के रूप में कैप्चर दक्षता की गणना करें:
      कैप्चर दक्षता = कैप्चर की गई कोशिकाओं की संख्या / (कैप्चर की गई कोशिकाओं की संख्या + बाहर बहने वाली कोशिकाओं की संख्या) × 100%
    2. 10 से 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100) से ट्यूमर कोशिकाओं की विभिन्न संख्याओं के लिए कैप्चर दक्षता प्राप्त करने के लिए दोहराएं।
  3. ट्यूमर कोशिकाओं की दुर्लभ संख्या के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप का परीक्षण और सत्यापन करें। इन 10 नमूना निलंबनों को माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में एक खोखली सुई का उपयोग करके इंजेक्ट करें जो 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, और 10 ट्यूमर कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस में पतला करने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर से बना है। चिप पर कब्जा करने के बाद प्रत्येक नमूने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या का पता लगाएं और गणना करें।
    नोट: खोखली सुई 1 मिमी बाहरी व्यास के साथ लंबाई में लगभग 3 सेमी है।
  4. सामान्य रक्त के नमूनों में स्पाइक ट्यूमर कोशिकाओं के लिए नैदानिक पूर्व-प्रयोग परीक्षण करें।
    1. कैल्सीन एएम के साथ ट्यूमर कोशिकाओं को दाग दें, और फिर पीबीएस के 5 μL में 100 ट्यूमर कोशिकाओं की गणना करें। इन कोशिकाओं को पूरे सामान्य रक्त के नमूनों के 1 एमएल में स्पाइक करें। इन कोशिकाओं को चिप में पेश करें, और हरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ चिप पर कैप्चर किए गए ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। ऊपर वर्णित चिप पर विवो गणना में प्रदर्शन करें, और कैप्चर के बाद कैप्चर दक्षता की गणना करें।
    2. 10 से 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90) तक ट्यूमर सेल संख्या ओं की नौ अतिरिक्त सांद्रता के लिए चरण 1.4.1 दोहराएं।
    3. चरण 1.3 में वर्णित 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 और 10 ट्यूमर कोशिकाओं की गणना करें, पूरे सामान्य रक्त के 1 एमएल में स्पाइक करें, इन नमूनों को माइक्रोफ्लुइडिक चिप में पेश करें, और चिप पर ट्यूमर कोशिकाओं को कैप्चर करें।
    4. होचस्ट, सीके-एफआईटीसी और सीडी 45-पीई के साथ चिप पर दाग लगाएं। फ्लोरोसेंट डाई के 3-5 μL को पीबीएस के 20-30 μL में डालें, और फिर इस घोल को सिरिंज के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर पेश करें। कैप्चर दक्षता निर्धारित करने के लिए नीले और हरे दोनों इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ चिप पर कैप्चर किए गए ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  5. एंटी-ईपीकैम के आत्मीयता-आधारित कैप्चर के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप का संशोधन करें।
    नोट: चूंकि वेव चिप आत्मीयता-आधारित और भौतिक संपत्ति-आधारित अलगाव दोनों को जोड़ती है, इसलिए एजेंटों के साथ चिप को संशोधित करें।
    1. 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इथेनॉल में 4% (वी / वी) 3-मर्कैप्टोप्रोपिल ट्राइमेथॉक्सीसिलेन के 100 μL के साथ चिप की सतह को संशोधित करें। चिप की आंतरिक संरचना को नष्ट करने के मामले में इस समाधान को सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे चिप में पेश करें, विशेष रूप से शीर्ष सतह और सब्सट्रेट ग्लास का संबंध।
      नोट: चिप की सतह को मर्कैप्टोसिलेन का उपयोग करके संशोधित किया गया है। चिप पर होने वाली बातचीत रासायनिक बंधों द्वारा निर्धारित की जाती है। एंटीजन के साथ संशोधित एंटीबॉडी के संबंध का एहसास करने के लिए रासायनिक बंधन स्थापित किए जाते हैं। रासायनिक बंधों को स्थापित करने के लिए चिप के अंदर विभिन्न अभिकर्मकों को संशोधित किया जाता है जो एक दूसरे से जुड़ते हैं। संशोधित किया जाने वाला अंतिम अभिकर्मक एक एंटी-एपिथेलियल आसंजन अणु (एंटी-ईपीकैम) है। ईपीकैम का ट्यूमर सेल सतह एंटीजन सीटीसी के कब्जे का एहसास करने के लिए चिप के अंदर एंटी-ईपीकैम के साथ गठबंधन करता है।
    2. इथेनॉल 3x से धो लें। चिप पर युग्मन एजेंट एन-वाई-मैलिमिडोब्यूट्रिलोक्सी सक्सिनिमाइड एस्टर (जीएमबीएस, 1 μM) के 100 μL जोड़ें, और इसे 30 मिनट के लिए बातचीत करने की अनुमति दें।
    3. पीबीएस 3x से धो लें। धोने के लिए चिप पर 1 एमएल पीबीएस पेश करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें।
    4. चिप को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10 μg / mL न्यूट्राविडिन के 30-40 μL के साथ इलाज करें, जिससे जीएमबीएस पर कोशिकाओं का स्थिरीकरण होता है, और फिर अतिरिक्त एविडिन को हटाने के लिए पीबीएस के साथ फ्लश होता है।
    5. 1% (डब्ल्यू / वी) बीएसए के साथ पीबीएस के 100 μL में 10 μg / mL की एकाग्रता पर एंटी-बायोटिनीलेटेड EPCAM एंटीबॉडी के 3 μL के साथ चिप को संशोधित करें। इसे रात भर लगा रहने दें।

2. परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) की गणना करने के लिए चिप पर नैदानिक प्रयोग।

  1. लाल रक्त कोशिकाओं लाइसिस (आरबीसीएल) समाधान का उपयोग करके पूर्व-प्रक्रिया नैदानिक कैंसर रोगी रक्त के नमूने, या सिरिंज का उपयोग करके सीधे माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर रक्त के नमूने के 2-3 एमएल पेश करें।
    1. प्री-प्रोसेसिंग करें, जिसमें लगभग 30 मिनट लगते हैं। एंटीकोग्यूलेशन ट्यूबों में पूरे रक्त के नमूने एकत्र करें। 2-3 एमएल रक्त में 6-9 एमएल आरबीएस लाइसिस घोल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5-8 मिनट के लिए 111 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और लाल स्पष्ट तरल की ऊपरी परत को छोड़ दें।
  2. चिप पर कोशिकाओं को पकड़ना, दागना, पहचानना और गणना करना जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. चरण 1 में वर्णित के रूप में चिप पर कोशिकाओं को कैप्चर करें। होचस्ट, सीके-एफआईटीसी और सीडी 45-पीई का उपयोग करके कैप्चर किए गए सीटीसी के लिए चिप को दाग दें। सीके-एफआईटीसी ट्यूमर कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट दाग है, और सीडी 45-पीई सफेद रक्त कोशिकाओं के लिए है।
    2. पीबीएस के 20 μL में CK-FITC के 3 μL जोड़ें। इसे सिरिंज में पेश करें, और चिप पर पतला सीके-एफआईटीसी पंप करें। 30 मिनट के लिए दाग लगा दें। चिप को धोने के लिए चिप पर पीबीएस के 300 μL पेश करें।
    3. CD45-PE के 3 μL को PBS के 20 μL में जोड़ें। इसे सिरिंज में पेश करें, और चिप पर पतला सीडी 45-पीई पंप करें। 30 मिनट के लिए खड़े रहने दें। चिप को धोने के लिए चिप पर पीबीएस के 300 μL पेश करें।
    4. 20x या 40x आवर्धन पर उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ CTCs की पहचान करें। सीटीसी नीले और हरे रंग की प्रतिदीप्ति दोनों का उत्सर्जन करते हैं, और सफेद रक्त कोशिकाएं (डब्ल्यूबीसी) नीले और लाल प्रतिदीप्ति दोनों का उत्सर्जन करती हैं। नीले और हरे रंग की प्रतिदीप्ति दोनों के साथ सीटीसी और नीले और लाल प्रतिदीप्ति दोनों के साथ डब्ल्यूबीसी की पहचान करें।
    5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से, चिप पर कैप्चर किए गए सीटीसी की संख्या की गणना करें। सीटीसी को होचस्ट +/सीके-एफआईटीसी+/सीडी45− और डब्ल्यूबीसी को होचस्ट+/सीके-एफआईटीसी-/सीडी45+ के रूप में गिनाइए।
  3. इनलेट से चिप पर कैप्चर किए गए सीटीसी को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर रिवर्स दिशा में सिरिंज के माध्यम से पीबीएस के साथ फ्लश करके कैप्चर किए गए सीटीसी को समृद्ध करें। 1 एमएल पीबीएस के साथ एक सिरिंज का उपयोग करें, इसे 2-3 मिनट के भीतर चिप पर कैप्चर किए गए सीटीसी को समृद्ध करने के लिए आउटलेट से पेश करें, और उन्हें इनलेट से इकट्ठा करें। प्रत्येक धोने के चरण के लिए पीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करें, और 3x दोहराएं।
  4. नीचे वर्णित के रूप में माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर कैप्चर किए गए ट्यूमर कोशिकाओं या सीटीसी को दाग दें।
    1. कैल्सीन एएम का उपयोग करके दाग लगाएं। 20 μL PBS में कैल्सीन एएम के 5 μL जोड़ें, 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को दाग दें, फिर ट्यूमर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 111 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और पीबीएस के 1 एमएल में निलंबित करें।
    2. सेलुलर नाभिक की पहचान करने के लिए, चिप में 20 μL DAPI समाधान (PBS के 20 μL में DAPI अभिकर्मक का 10 μL) जोड़ें, जो बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर के लिए 1 mL / h और ट्रेपोज़ॉइड के लिए 1.5 mL / h की इष्टतम प्रवाह दर पर है। 30 मिनट के लिए चिप के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एंटी-साइटोकेराटिन स्टॉक समाधान के 20 μL (पीबीएस के 20 μL में एंटी-साइटोकेराटिन एंटीबॉडी के 3 μL) के माध्यम से गुजरें।
    3. चिप पर कैप्चर किए गए डब्ल्यूबीसी को दाग दें। चिप पर सीटीसी कैप्चर किए जाने के बाद, चिप में एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी समाधान के 25 μL (पीबीएस के 20 μL में एंटी-सीडी 45 समाधान का 5 μL) जोड़ें, और 30 मिनट के लिए दाग ने दें। पीबीएस के साथ धोएं, और नीले और हरे रंग के प्रतिदीप्ति दोनों के साथ उपकला कोशिकाओं की पहचान करें।
  5. नीचे वर्णित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस पहचान करें।
    1. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और नीले लेजर के साथ नमूने को उत्तेजित करें। नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाली कोशिकाओं का पता लगाएं, जो न्यूक्लियेट कोशिकाएं हैं। निम्न आवर्धन में से किसी एक का उपयोग करें: 10x, 20x, या 40x. ट्यूमर सेल के लिए एक स्पष्ट क्षेत्र खोजें। नीले लेजर स्रोत के लिए, 420-485 एनएम की उत्तेजना प्लेट तरंग दैर्ध्य और 515 एनएम की उत्सर्जन प्लेट तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।
    2. नमूने को स्थानांतरित किए बिना, किसी अन्य लेजर स्रोत का उपयोग करें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को घुमाएं और हरे रंग के लेजर के साथ नमूने को उत्तेजित करें। हरे रंग की प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाली कोशिकाओं का पता लगाएं, जो ट्यूमर कोशिकाओं का संकेत है। इस हरे रंग के लेजर स्रोत के साथ समान आवर्धन के साथ एक ही क्षेत्र की छवियां लें। नीले और हरे रंग की प्रतिदीप्ति दोनों का उत्सर्जन करने वाली कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में पहचाना जाता है। हरे लेजर स्रोत के लिए, 460-550 एनएम की उत्तेजना प्लेट तरंग दैर्ध्य और 590 एनएम की उत्सर्जन प्लेट तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।
    3. नमूने को स्थानांतरित किए बिना, किसी अन्य लेजर स्रोत का उपयोग करें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को घुमाएं और लाल लेजर के साथ नमूने को उत्तेजित करें। लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाली कोशिकाओं का पता लगाएं। इस लाल लेजर स्रोत के साथ समान आवर्धन के साथ एक ही क्षेत्र की छवियां लें। नीले और लाल प्रतिदीप्ति दोनों का उत्सर्जन करने वाली कोशिकाओं को सफेद रक्त कोशिकाओं के रूप में पहचाना जाता है।
    4. उपरोक्त प्रत्येक लेजर स्रोत का उपयोग करके प्राप्त करने के लिए छवि सहेजें। विभिन्न रंगीन रोशनी के साथ एक ही क्षेत्र की कई छवियां लें।
    5. 330-400 एनएम की उत्तेजना प्लेट तरंग दैर्ध्य और 425 एनएम की उत्सर्जन प्लेट तरंग दैर्ध्य के साथ पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करें। 395-415 एनएम की उत्तेजना प्लेट तरंग दैर्ध्य और 455 एनएम की उत्सर्जन प्लेट तरंग दैर्ध्य के साथ बैंगनी प्रकाश का उपयोग करें।
  6. चरण 1.2.1 के रूप में कैप्चर दक्षता की गणना करें।

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Representative Results

पूरे सेटअप में एक सिरिंज पंप, एक सिरिंज और एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप शामिल है। सिरिंज में सेल निलंबन सिरिंज पंप से जुड़ा होता है, और सेल निलंबन को कोशिकाओं को पकड़ने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप में पेश किया जाता है। उपयोग किए गए सभी माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के लिए कैप्चर दक्षता लगभग 90% या उससे अधिक थी। वेव चिप के लिए, हमने विभिन्न अंतराल के साथ माइक्रोस्ट्रक्चर डिजाइन किए। छोटे अंतराल का उपयोग सीटीसी को पकड़ने के लिए किया जाता है, और बड़े अंतराल का उपयोग प्रवाह दर में तेजी लाने के लिए किया जाता है। सेल निलंबन बड़े अंतराल क्षेत्रों में जल्दी से बहता है। छूटे हुए सीटीसी को बाद की सरणी16 में छोटे अंतराल द्वारा कैप्चर किया जाता है। दीर्घवृत्त चिप्स के लिए, हमने कैप्चर को बढ़ाने के लिए एक पतली सुरंग बनाने के लिए पॉइंट-पॉइंट अंतराल के बजाय लाइन-लाइन अंतराल तैयार किए। इसलिए, उच्च कैप्चर दक्षता हासिल की गई थी1. हमने व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए किनारों और कोनों से बचने के लिए एक दीर्घवृत्त संरचना तैयार की। ट्रेपोज़ॉइड फिल्टर में एम्बेडेड ट्रेपोज़ॉइड और सर्कुलर माइक्रोपोस्ट बैरियर के साथ दो गोलाकार सर्पिल चैनल होते हैं। ट्रेपोज़ॉइड फिल्टर के लिए, एमसीएफ -7, एमडीए-एमबी -231, और हेला के लिए कैप्चर क्षमता क्रमशः 94%, 95% और 93%थी।

चित्र 1 से पता चलता है कि सभी ट्यूमर कोशिकाओं को तरंग चिप द्वारा कब्जा कर लिया गया था। चूंकि सभी ट्यूमर कोशिकाएं तरंग माइक्रोपोस्ट सरणी के आसपास केंद्रित थीं, इसलिए यह इस माइक्रोफ्लुइडिक चिप के लिए उच्च कैप्चर दक्षता को इंगित करता है, जैसा कि कैप्चर किए गए ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या से प्रदर्शित होता है। इसलिए, यह सेटअप दुर्लभ ट्यूमर कोशिकाओं को पकड़ना बहुत आसान बनाता है; दरअसल, चिप को बड़ी संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं के साथ-साथ दुर्लभ संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं को पकड़ने के लिए गढ़ा गया है। उदाहरण के लिए, यदि चिप 10,000 ट्यूमर कोशिकाओं को पकड़ने के लिए पर्याप्त ठोस या प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, तो चिप के लिए 10-100 कोशिकाओं को पकड़ना आसान है। वीडियो 1 दिखाता है कि पूर्व-प्रयोग के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की दुर्लभ संख्या कैसे प्राप्त की गई थी। माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके बनाई गई एक खोखली सुई का उपयोग पीबीएस में कैल्सीन एएम से सना पतला ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक कल्चर डिश से 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 और 10 ट्यूमर कोशिकाओं को एस्पिरेट करने के लिए किया गया था। कोशिकाओं को खोखली सुई से जुड़े सिलिका जेल ट्यूब द्वारा अवशोषित किया गया था। हरे रंग के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ एक ट्यूमर सेल को खोखली सुई में सक्शन किया गया था। खोखले ट्यूब में उड़ाने से खोखली सुई के अंदर ट्यूमर सेल को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब1 में छोड़ दिया गया। यह दुर्लभ ट्यूमर कोशिकाओं को प्राप्त करने की प्रक्रिया है। चित्रा 2 एक गैस्ट्रिक कैंसर रोगी से सीटीसी को छोटे-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर का उपयोग करके कैप्चर करता है। चित्रा 3 एक कोलोरेक्टल कैंसर रोगी से सीटीसी को ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर का उपयोग करके कैप्चर किया गया है और नीले और हरे रंग की प्रतिदीप्ति दोनों का उत्सर्जन करता है। चित्रा 4 कैप्चर के बाद चिप पर विकसित ट्यूमर कोशिकाओं को दर्शाता है, जो कैंसर-रोधी दवा के साथ इलाज के लिए तैयार हैं। ये निष्कर्ष बताते हैं कि बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर का सेल व्यवहार्यता पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं पड़ता है।

चित्रा 5 माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर कैप्चर किए गए कोलोरेक्टल सीटीसी के नैदानिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण को दर्शाता है। ये ब्राइटफील्ड में देखे जाते हैं और होचस्ट, सीके-एफआईटीसी और सीडी 45-पीई धुंधला पन से रंगे होते हैं। सीटीसी को DAPI+/CK+/CD45−के रूप में मान्यता दी गई थी, और WBCs की पहचान DAPI+/CK−/CD45+ के रूप में की गई थी। चित्र 6 कैप्चर के बाद बड़े-दीर्घवृत्त चिप पर सुसंस्कृत कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं को दर्शाता है। चित्रा 7 बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर पर कैप्चर किए गए कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं को दर्शाता है। नैदानिक रूप से, रोगी के रक्त में सीटीसी को वेव चिप्स, ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर और बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था, यह दर्शाता है कि ये तीन चिप्स सीटीसी को कैप्चर करने में सफल हैं।

Figure 1
चित्र 1: वेव चिप कैप्चर। एमसीएफ -7 की सभी ट्यूमर कोशिकाओं को तरंग चिप की सरणी के चारों ओर कैप्चर किया गया था, बिना किसी कोशिका के गायब हो गया था। चूंकि सरणी के अलावा किसी अन्य क्षेत्र में कोई ट्यूमर कोशिकाएं नहीं थीं, इसलिए यह चिप की उच्च कैप्चर दक्षता को इंगित करता है। बड़ी संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया गया था। इसलिए, दुर्लभ ट्यूमर कोशिकाओं को भी आसानी से पकड़ा जा सकता है। एमसीएफ -7 की ट्यूमर कोशिकाओं को तरंग चिप द्वारा कैप्चर किया गया था और (ए) होचस्ट से सना हुआ था और (बी) कैल्सीन एएम से सना हुआ था। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: छोटे-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किए गए सीटीसी के लिए नैदानिक नमूना। एक गैस्ट्रिक कैंसर रोगी के नैदानिक सीटीसी को छोटे-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया है। सीटीसी को ब्राइटफील्ड में और नीले और हरे रंग के प्रतिदीप्ति दोनों के साथ पहचाना गया था। (ए) में नीला सर्कल चिप के अंदर पकड़े गए गैस्ट्रिक कैंसर रोगी के सीटीसी को इंगित करता है। ली गई तस्वीरों से यह देखा जा सकता है कि किसी अन्य क्षेत्र में कोई अन्य सेल नहीं थे, यह दर्शाता है कि इस चिप के लिए कैप्चर शुद्धता अधिक थी। एमसीएफ -7 की ट्यूमर कोशिकाओं को छोटे-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था और (ए) ब्राइटफील्ड, (बी) होचस्ट से सना हुआ, और (सी) सीके-एफआईटीसी से सना हुआ देखा गया था। स्केल बार: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किए गए सीटीसी का नैदानिक नमूना। एक कोलोरेक्टल कैंसर रोगी से नैदानिक सीटीसी को ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था। इन छवियों में, यह देखा जा सकता है कि छह सीटीसी कैप्चर किए गए थे, यह दर्शाता है कि छोटे क्षेत्र में कैप्चर दक्षता अधिक थी। इसके अतिरिक्त, कोई अन्य कोशिका दिखाई नहीं दी, यह दर्शाता है कि इस चिप के लिए कैप्चर शुद्धता बेहद अधिक थी। एमसीएफ -7 की ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था और (ए) ब्राइटफील्ड, (बी) होचस्ट से सना हुआ, और (सी) सीके-एफआईटीसी से सना हुआ देखा गया था। स्केल बार: 20 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किए गए सीटीसी की संस्कृति। एमसीएफ -7 की ट्यूमर कोशिकाओं को एक बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोपोस्ट सरणी के सामने बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था। कोई ट्यूमर कोशिकाएं सरणी से नहीं गुजरीं, जो इस चिप के लिए उच्च कैप्चर दक्षता का संकेत देती हैं। पकड़ने के बाद, ट्यूमर कोशिकाएं 24-48 घंटे तक बढ़ीं। यह इंगित करता है कि बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर के लिए कैप्चर दक्षता और व्यवहार्यता दोनों बहुत अधिक थे। एमसीएफ -7 की सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं को बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था और कैप्चर के बाद (ए) 0 घंटे, (बी) कैप्चर के 24 घंटे बाद और (सी) कैप्चर के 48 घंटे बाद देखा गया था। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर द्वारा सीटीसी कैप्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले नैदानिक नमूने का उदाहरण। एक कोलोरेक्टल कैंसर रोगी से नैदानिक सीटीसी को ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था। इन छवियों में, यह देखा जा सकता है कि दो सीटीसी कैप्चर किए गए थे, जो उच्च कैप्चर दक्षता का संकेत देते हैं। चिप में आरबीसी के अवशेषों के अलावा कोई अन्य सेल गड़बड़ी नहीं थी। इस प्रकार, सीटीसी कैप्चर के नैदानिक पूर्व-प्रसंस्करण के लिए, लाल रक्त कोशिका लाइसिस का उपयोग नहीं करना बेहतर है। कोलोरेक्टल कैंसर के सीटीसी को ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था और (ए) ब्राइटफील्ड में देखा गया था, (बी) होचस्ट से सना हुआ, (सी) सीके-एफआईटीसी से सना हुआ, और (डी) विलय की गई छवियों में देखा गया था। स्केल बार: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एक बड़े-दीर्घवृत्त चिप द्वारा कैप्चर किए गए सुसंस्कृत सीटीसी का उदाहरण। एमसीएफ -7 कोशिकाओं की ट्यूमर सेल संस्कृतियां बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोपोस्ट सरणी के सामने और बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर के पीछे। हरे रंग की प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाले कैल्सीन एएम से सना ट्यूमर कोशिकाएं वांछित रूप से बढ़ीं, यह दर्शाता है कि इस चिप के लिए सेल व्यवहार्यता बहुत अधिक थी। कुल मिलाकर, 15 सरणी थे, जिनमें बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोपोस्ट द्वारा आयोजित प्रत्येक सरणी के लिए विभिन्न अंतराल थे। एमसीएफ -7 ट्यूमर कोशिकाओं को एक सरणी में (ए) और दूसरे सरणी में (बी) पकड़ने के बाद बड़े-दीर्घवृत्त चिप पर संवर्धित किया गया था। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा सीटीसी कैप्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले नैदानिक नमूने का उदाहरण। एक कोलोरेक्टल कैंसर रोगी से नैदानिक सीटीसी को बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर द्वारा कैप्चर किया गया था। छवियों से, यह देखा जा सकता है कि आरबीसी संदूषण था। यह इंगित करता है कि पूरे रोगी के रक्त के नमूने को पतला किया जाना चाहिए और चिप को पकड़ने के बाद फ्लश करने की आवश्यकता है। नैदानिक कोलोरेक्टल कैंसर रोगी के रक्त के नमूनों के सीटीसी को बड़े-दीर्घवृत्त चिप पर कैप्चर किया गया था और (ए) ब्राइटफील्ड, (बी) होचस्ट से सना हुआ, और (सी) सीके-एफआईटीसी से सना हुआ देखा गया था। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

रोग का निदान और कैंसर के प्रारंभिक निदान का कैंसर के उपचार पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ताहै। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ सीटीसी अलगाव बिना किसी आक्रमण के तरल बायोप्सी प्रदान करता है। हालांकि, सीटीसीरक्त 1 में बेहद दुर्लभ और विषम हैं, जो सीटीसी को अलग करना चुनौतीपूर्ण बनाता है। इस प्रकार, सीटीसी कैंसर मेटास्टेसिस1 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक चिप के साथ सीटीसी अलगाव के पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल में सीटीसी अलगाव से संबंधित सभी प्रमुख प्रक्रियाएं शामिल हैं। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में आरबीसीएल विश्लेषण शामिल हैं, जिन्हें सावधानीपूर्वक और विभिन्न पैकेजों में व्यवस्थित किया जाता है, दुर्लभ ट्यूमर सेल अधिग्रहण, इष्टतम प्रवाह दर निर्धारण, कैप्चर दक्षता, नैदानिक लक्षण वर्णन और गणना। ऑपरेशन का सावधानीपूर्वक प्रबंधन नैदानिक रोगी नमूना प्रसंस्करण की सुविधा प्रदान करता है। प्रोटोकॉल नैदानिक रोगी के नमूनों के पूर्व-प्रसंस्करण और प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है और चिकित्सकों के लिए महत्वपूर्ण सेवाएं प्रदान करता है।

सीटीसी अलगाव के लिए, दुर्लभ ट्यूमर कोशिकाओं का पूर्व-प्रसंस्करण करना बेहद मुश्किल है। इस कठिनाई को इच्छानुसार 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 और 10 ट्यूमर कोशिकाओं को चूसने के लिए सुई खींचने वाले के माध्यम से खींची गई खोखली सुई का उपयोग करके हल किया गया था। फिर, एक रोगी के रक्त के नमूने की नकल करते हुए, सामान्य रक्त में मिश्रित ट्यूमर कोशिकाओं की वांछित संख्या के साथ एक करीबी-से-वास्तविक नैदानिक रोगी रक्त का नमूना तैयार किया गया था। इन कृत्रिम रोगी रक्त नमूनों के साथ, एक करीबी-से-वास्तविक प्रयोग किया गया था। इस विधि ने एक कठिन समस्या को हल किया है जो आमतौर पर पूर्व-प्रयोगों के लिए सीटीसी अलगाव में मिलती है। यह दृष्टिकोण प्रदर्शन करना आसान नहीं है और इसे कहीं और रिपोर्ट नहीं किया गया है; हालांकि, यह एक वास्तविक नैदानिक प्रयोग करने से पहले एक उपयोगी दृष्टिकोण है।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ सीटीसी अलगाव को तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है: आत्मीयता-आधारित, भौतिक-आधारित और इम्यूनोमैग्नेटिक-आधारित। आत्मीयता-आधारित अलगाव के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक चिप को संशोधित करने की आवश्यकता है। एंटी-ईपीकैम के साथ संशोधन के लिए विशिष्ट संशोधन प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है। सीटीसी की पहचान होचस्ट, सीके-एफआईटीसी और सीडी 45-पीई के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से की गई थी। चूंकि कई ट्यूमर कोशिकाएं ईपीकैम व्यक्त करती हैं, इसलिए एंटी-ईपीकैम रोगी के रक्त में सीटीसी को पकड़ने के लिए एक महत्वपूर्ण एंटीबॉडी है। हालांकि, एंटी-ईपीकैम बहुत महंगा है; इस प्रकार, इस समस्या को हल करने के लिए कई एपटामर विकसित किए गए हैं। हम मुख्य रूप से सीटीसी को पकड़ने के लिए छोटे-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर और ट्रेपोज़ॉइड माइक्रोफिल्टर जैसे भौतिक-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का उपयोग करते हैं क्योंकि वे सरल, संचालित करने में आसान और प्रभावी हैं।

वैकल्पिक तकनीकों पर इस तकनीक का लाभ यह है कि बड़े-दीर्घवृत्त माइक्रोफिल्टर की भौतिक-आधारित चिप उच्च कैप्चर दक्षता के साथ सीटीसी को मजबूती से पकड़ती है। इसका कारण यह है कि लाइन-लाइन अंतराल की पतली सुरंगें हैं। वेव चिप्स भौतिक संपत्ति-आधारित और आत्मीयता-आधारित अलगाव दोनों को मिलाकर सीटीसी को कैप्चर करते हैं। सीटीसी को छोटे अंतराल द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, और बड़े अंतराल का उपयोग प्रवाह दर में तेजी लाने के लिए किया जा सकता है। छूटे हुए सीटीसी को निम्नलिखित सरणियों में छोटे अंतराल से गुजरना पड़ता है और आत्मीयता-आधारित अलगाव द्वारा भी कब्जा कर लिया जाता है।

प्रोटोकॉल ने सीटीसी अलगाव में कई प्रमुख समस्याओं को हल किया है, खासकर नैदानिक प्रयोगों के लिए। हालांकि, सीटीसी अलगाव में हर विस्तृत कदम को शामिल करना असंभव है, जैसे कि नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर और एपटामर संशोधन की भूमिका के बारे में। ये पहलू सीटीसी अलगाव में भी एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। हालांकि, वे कैप्चर दक्षता में सुधार जैसी समस्याओं को हल करने में महत्वपूर्ण नहीं हैं। इसके बजाय, ये पहलू सीटीसी अलगाव को नई सामग्री के साथ समृद्ध करते हैं।

यह काम डिज़ाइन किए गए माइक्रोफ्लुइडिक चिप के साथ सीटीसी के नैदानिक अलगाव पर केंद्रित है। उपयोग किए जाने वाले अधिकांश माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स मुख्य रूप से भौतिक-आधारित होते हैं, जैसे कि बड़े-दीर्घवृत्त फिल्टर और छोटे-दीर्घवृत्त फिल्टर। वेव चिप्स आत्मीयता-आधारित और भौतिक-आधारितचिप गुणों दोनों को मिलाकर बनाए जाते हैं। इस काम में कैप्चर शुद्धता को बढ़ाने के लिए बड़े-दीर्घवृत्त फिल्टर के माइक्रोपोस्ट को छोटा करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। छोटे-दीर्घवृत्त फिल्टर को विभिन्न सरणियों के लिए विभिन्न माइक्रोपोस्ट आकारों के साथ डिजाइन करके भी बेहतर बनाया जा सकता है। कैप्चर को बढ़ाने के लिए अधिक सरणियों को जोड़कर वेव चिप्स को बेहतर तरीके से डिजाइन किया जा सकता है।

बिग-एलिप्स फिल्टर को लंबी अण्डाकार माइक्रोपोस्ट के साथ व्यवस्थित किया जाता है ताकि लाइन-लाइन सुरंगें बनाई जा सकें जो उच्च कैप्चर दक्षता प्राप्त करती हैं। हालांकि, इस कैप्चर की सीमा यह है कि कैप्चर शुद्धता पर्याप्त नहीं है या उच्च कैप्चर शुद्धता आसानी से प्राप्त नहीं होती है। वेव चिप के लिए, सीटीसी को पकड़ने के लिए छोटे अंतराल का उपयोग किया जाता है, और छूटे हुए सीटीसी को निम्नलिखित सरणियों द्वारा कैप्चर किया जाता है। बड़े अंतराल का उपयोग प्रवाह दर में तेजी लाने और आरबीसी से गड़बड़ी को खत्म करने के लिए किया जाता है, इस प्रकार कैप्चर शुद्धता में सुधार होता है; हालांकि, कैप्चर दक्षता 90% से ऊपर ठोस है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ सीटीसी अलगाव में नैदानिक सत्यापन महत्वपूर्ण है। यह काम बड़े-दीर्घवृत्त फिल्टर, छोटे-दीर्घवृत्त फिल्टर और वेव चिप्स के साथ कोलोरेक्टल रोगियों से सीटीसी के नैदानिक अलगाव को प्रस्तुत करता है। डिज़ाइन किए गए माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का उद्देश्य नैदानिक रूप से सीटीसी की गणना करना है। कुछ अन्य प्रणालियों या प्लेटफार्मों के मौजूदा तरीकों के लिए, कैप्चर दक्षता कम है, या नैदानिक अनुप्रयोगों में प्रभावी ढंग से उपयोग की जाने वाली विधि के लिए कैप्चर दक्षता पर्याप्त नहीं है।

इन तीन माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के नैदानिक प्रदर्शन के आधार पर, जिनमें उच्च कैप्चर दक्षता है, उन्हें संभावित रूप से सीटीसी उत्पादों में लागू किया जा सकता है, खासकर संशोधन के बाद। हमारे प्रोटोकॉल की ताकत यह है कि यह वास्तविक नैदानिक नमूनों की नकल करने के लिए दुर्लभ संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं की गणना को प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, नैदानिक प्रयोगात्मक प्रक्रिया संभव और व्यावहारिक है। यह विधि सीटीसी को पूरे रोगी के रक्त से अलग कर सकती है। इसलिए, विधि नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध कार्य को चीन के अनहुई प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (1908085एमएफ197, 1908085क्यूबी66), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21904003), तियानजिन शिक्षा आयोग की वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना (2018केजे 154), अनहुई प्रांत (KJ2020A0239) के उच्च शिक्षा संस्थानों के प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम और बहुआयामी सूचना प्रसंस्करण की शंघाई कुंजी प्रयोगशाला, बहुआयामी सूचना की पूर्वी चीन प्रमुख प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था। प्रसंस्करण, पूर्वी चीन सामान्य विश्वविद्यालय (MIP20221)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein AM BIOTIUM 80011
calibrated microcapillary pipettes Sigma- Aldrich P0799
CD45-PE BD Biosciences 560975
CK-FITC BD Biosciences 347653 cytokeratin monoclonal antibody
DMEM HyClone SH30081.05
fetal bovine serum (FBS) GIBCO,USA 26140
Hoechst 33342 Molecular Probes, Solarbio Corp., China C0031
penicillin-streptomycin Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL) Solarbio, Beijing R1010

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References

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Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y., Wang, S., Jiao, X. Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (200), e64674, doi:10.3791/64674 (2023).

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