Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Klinisk mikrofluidisk chipplatform til isolering af alsidige cirkulerende tumorceller

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/64674
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4
1School of Microelectronics and Data Science, Anhui University of Technology, 2Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Normal University, 3School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, 4Department of Medical Oncology, Changzheng Hospital

Summary

Den kliniske mikrofluidiske chip er en vigtig biomedicinsk analyseteknik, der forenkler forbehandling af kliniske patienters blodprøver og immunfluorescerende pletter cirkulerende tumorceller (CTC'er) in situ på chippen, hvilket muliggør hurtig påvisning og identifikation af en enkelt CTC.

Abstract

Cirkulerende tumorceller (CTC'er) er signifikante i kræftprognose, diagnose og kræftbehandling. CTC-optælling er afgørende for at bestemme patientsygdom, da CTC'er er sjældne og heterogene. CTC'er løsnes fra den primære tumor, kommer ind i blodcirkulationssystemet og vokser potentielt på fjerne steder og metastaserer således tumoren. Da CTC'er bærer lignende oplysninger til den primære tumor, kan CTC-isolering og efterfølgende karakterisering være kritisk i overvågning og diagnosticering af kræft. Optælling, affinitetsmodifikation og klinisk immunfluorescensfarvning af sjældne CTC'er er kraftfulde metoder til CTC-isolering, fordi de giver de nødvendige elementer høj følsomhed. Mikrofluidiske chips tilbyder en flydende biopsimetode, der er fri for smerter for patienterne. I dette arbejde præsenterer vi en liste over protokoller for kliniske mikrofluidiske chips, en alsidig CTC-isoleringsplatform, der indeholder et sæt funktioner og tjenester, der kræves til CTC-separation, analyse og tidlig diagnose, hvilket letter biomolekylær analyse og kræftbehandling. Programmet omfatter sjældne tumorcelletællinger, klinisk patientblodforbehandling, som omfatter lyse af røde blodlegemer og isolering og genkendelse af CTC'er in situ på mikrofluidiske chips. Programmet tillader præcis optælling af tumorceller eller CTC'er. Derudover indeholder programmet et værktøj, der inkorporerer CTC-isolering med alsidige mikrofluidiske chips og immunofluorescensidentifikation in situ på chipsene efterfulgt af biomolekylær analyse.

Introduction

Cirkulerende tumorceller (CTC'er) er signifikante i kræftprognose, diagnose og kræftbehandling. CTC-optælling er afgørende, da CTC'er er sjældne og heterogene. Optælling, affinitetsmodifikation og klinisk immunfluorescensfarvning af sjældne CTC'er er kraftfulde teknikker til CTC-isolering, fordi de tilbyder de nødvendige elementer med høj følsomhed1. Sjældent antal tumorceller blandet med normalt blod efterligner nøje ægte patientblod, da 2-3 ml ægte patientblod kun indeholder 1-10 CTC'er. For at løse et kritisk eksperimentelt problem, i stedet for at bruge et stort antal tumorceller indført i PBS eller blandet med normalt blod, giver brugen af sjældent antal tumorceller os et lavt antal blodlegemer, hvilket er tættere på virkeligheden, når vi udfører et eksperiment.

Kræft er den største dødsårsag i verden2. CTC'er er tumorceller, der udskilles fra den oprindelige tumor, der cirkulerer i blodet og lymfecirkulationssystemerne3. Når CTC'er flytter til et nyt overlevende miljø, vokser de som en anden tumor. Dette kaldes metastase og er ansvarlig for 90% af dødsfaldene hos kræftpatienter4. CTC'er er afgørende for prognose, tidlig diagnose og for at forstå kræftmekanismerne. CTC'er er imidlertid ekstremt sjældne og heterogene i patientblod 5,6.

Mikrofluidiske chips tilbyder en flydende biopsi, der ikke invaderer tumoren. De har fordelen ved at være bærbare, lave omkostninger og have en cellematchet skala. Isoleringen af CTC'er med mikrofluidiske chips klassificeres hovedsageligt i to typer: affinitetsbaseret, som er afhængig af antigen-antistofbinding 7,8,9 og er den originale og mest anvendte metode til CTC-isolering; og fysisk baserede chips, der udnytter størrelses- og deformerbarhedsforskelle mellem tumorceller og blodlegemer 10,11,12,13,14,15, er etiketfri og er nemme at betjene. Fordelen ved mikrofluidiske chips i forhold til alternative teknikker er, at den fysisk baserede tilgang til mikrofiltre med stor ellipse fanger CTC'er med høj fangsteffektivitet. Årsagen til dette er, at ellipsemikrostolper er organiseret i slanke tunneler af linjelinjehuller. Linjelinjehullerne adskiller sig fra de traditionelle punktpunktgab dannet af mikrostolper såsom rombemikroposter. Bølgechipbaseret indfangning af CTC'er kombinerer både fysisk egenskabsbaseret og affinitetsbaseret isolation. Bølgechipbaseret optagelse involverer 30 bølgeformede arrays med antistoffet af anti-EpCAM belagt på cirkulære mikroposter. CTC'erne fanges af de små huller, og de store huller bruges til at fremskynde strømningshastigheden. De ubesvarede CTC'er skal passere de små huller i det næste array og fanges af den affinitetsbaserede isolation, der er integreret i chip16.

Målet med protokollen er at demonstrere tællingen af sjældne antal tumorceller og den kliniske analyse af CTC'er med mikrofluidiske chips. Protokollen beskriver CTC-isolationstrinnene, hvordan man opnår et lavt antal tumorceller, den kliniske fysiske adskillelse af små ellipsefiltre, big-ellipsefiltre og trapezformede filtre, affinitetsmodifikation og berigelse17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patientens blodprøver blev leveret af Longhua Hospital tilknyttet Shanghai Medical University.Protokollen følger retningslinjerne fra Peking University Third Hospitals menneskelige forskningsetiske komité. Der blev indhentet informeret samtykke fra patienterne til at bruge prøverne til forskningsformål.

1. Foreksperiment for at kontrollere indfangningseffektiviteten med dyrkede tumorceller

  1. Dyrk tumorcellerne MCF-7, MDA-MB-231 og HeLa til bestemmelse af fangsteffektiviteten. Fortynd tumorcellesuspensionen, tæl antallet af tumorceller, og gentag, indtil det ønskede antal celler i 1 ml PBS er opnået.
    1. Dyrk cellerne i en cellekulturkolbe med et startcelleantal på ~ 1 x 105 celler i 1 ml af Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Der inkuberes i befugtet atmosfære ved 37 °C med en 5 % CO2 atmosfære.
    2. Når cellelinjerne vokser som klæbende monolag til 95% sammenløb, løsnes de fra kulturskålene med 0,25% trypsinopløsning i 2 minutter som beskrevet i Chen et al.16.
    3. Plet tumorcellerne med calcein AM. Kom 3 μL calcein AM i kulturskålen, og hold skålen i inkubatoren i 30 min. Derefter,fordøje alle cellerne med trypsin.
    4. Tæl de dyrkede tumorceller i PBS med et celletællekammer, og fortynd, indtil der opnås 100 tumorceller pr. 1 ml PBS.
      BEMÆRK: For præcist at opregne cellenummer skal du tage 50 μL af den opnåede cellesuspension for at se, om antallet af tumorceller i det er fem eller ej med et mikroskop. Bestem mængden af cellesuspension, der skal tages for at opnå 100 tumorceller i henhold til det faktiske antal tumorceller i 50 μL cellesuspension.
  2. Indfør cellesuspensionen indeholdende 100 tumorceller pr. 1 ml PBS i den mikrofluidiske chip ved hjælp af en sprøjte med en sprøjtepumpe ved forskellige strømningshastigheder på 0,5 ml / time, 1 ml / time, 2 ml / time, 3 ml / time, 4 ml / time og 5 ml / time. Få opsamlingseffektiviteten for de forskellige strømningshastigheder, og bestem den optimale strømningshastighed.
    1. Tæl antallet af tumorceller fanget på chippen og strømmer ud fra udløbet. Beregn fangsteffektiviteten som nedenfor:
      Indfangningseffektivitet = Antal celler fanget/(Antal celler fanget + antal celler, der strømmer ud) × 100%
    2. Gentag for at opnå indfangningseffektiviteten for forskellige antal tumorceller fra 10 til 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
  3. Test og valider den mikrofluidiske chip for et sjældent antal tumorceller. Injicer disse 10 prøvesuspensioner i de mikrofluidiske chips ved hjælp af en hul nål lavet med en mikropipettetrækker for at aspirere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller fortyndet i 1 ml PBS. Opdag og opregne antallet af tumorceller for hver prøve efter deres fangst på chippen.
    BEMÆRK: Den hule nål er ca. 3 cm lang med en udvendig diameter på 1 mm.
  4. Udfør klinisk præeksperimentel test for tumorceller spiket i normale blodprøver.
    1. Plet tumorcellerne med calcein AM, og opregn derefter 100 tumorceller i 5 μL PBS. Spike disse celler i 1 ml hele normale blodprøver. Indfør disse celler i chippen, og opregne antallet af tumorceller fanget på chippen med grøn immunofluorescens. Udfør in vivo-optælling på chippen som beskrevet ovenfor, og beregn optagelseseffektiviteten efter optagelse.
    2. Gentag trin 1.4.1 for ni yderligere koncentrationer af tumorcelletal fra 10 til 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
    3. Opregne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller som beskrevet i trin 1.3 uden farvning, spids i 1 ml helt normalt blod, indfør disse prøver i den mikrofluidiske chip og fang tumorcellerne på chippen.
    4. Plet på chippen med Hoechst, CK-FITC og CD45-PE. Sæt 3-5 μL fluorescerende farvestof i 20-30 μL PBS, og introducer derefter denne opløsning på den mikrofluidiske chip med en sprøjte. Opregne antallet af tumorceller fanget på chippen med både blå og grøn immunofluorescens for at bestemme fangsteffektiviteten.
  5. Udfør modifikation af den mikrofluidiske chip til affinitetsbaseret optagelse af anti-EpCAM.
    BEMÆRK: Da bølgechippen kombinerer både affinitetsbaseret og fysisk egenskabsbaseret isolering, skal du ændre chippen med agenter.
    1. Chippens overflade modificeres med 100 μL 4% (v/v) 3-mercaptopropyltrimethoxysilan i ethanol ved stuetemperatur i 45 min. Indfør denne opløsning i chippen forsigtigt og langsomt, hvis den ødelægger chipens indre struktur, især bindingen af den øverste overflade og substratglas.
      BEMÆRK: Chipoverfladen ændres ved hjælp af mercaptosilan. De interaktioner, der forekommer på chippen, bestemmes af kemiske bindinger. Kemiske bindinger etableres for at realisere bindingen af antistoffet modificeret med antigenet. Forskellige reagenser modificeres inde i chippen for at etablere kemiske bindinger, der forbinder hinanden. Det sidste reagens, der skal modificeres, er et antiepiteladhæsionsmolekyle (anti-EpCAM). Tumorcelleoverfladeantigenet i EpCAM kombineres med anti-EpCAM inde i chippen for at realisere indfangningen af CTC'erne.
    2. Vask med ethanol 3x. Der tilsættes 100 μL koblingsmiddel N-y-maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS, 1 μM) på chippen, og lad den interagere i 30 minutter.
    3. Vask med PBS 3x. Brug en sprøjte til at indføre 1 ml PBS på chippen til vask.
    4. Behandl chippen med 30-40 μL 10 μg/ml neutravidin ved stuetemperatur i 30 minutter, hvilket fører til immobilisering af cellerne på GMBS, og skyl derefter med PBS for at fjerne overskydende avidin.
    5. Chippen modificeres med 3 μL antibiotinyleret EpCAM-antistof i en koncentration på 10 μg/ml i 100 μL PBS med 1 % (w/v) BSA. Opbevar dette natten over.

2. Klinisk eksperiment på chippen for at opregne de cirkulerende tumorceller (CTC'er)

  1. Forbehandle kliniske kræftpatienters blodprøver ved hjælp af røde blodlegemer lysis (RBCL) opløsning, eller indfør 2-3 ml af blodprøven direkte på den mikrofluidiske chip ved hjælp af en sprøjte.
    1. Udfør forbehandling, som tager ca. 30 min. Saml fuldblodsprøver i antikoagulationsrør. Tilsæt 6-9 ml RBS-lyseopløsning i 2-3 ml blod. Der centrifugeres ved 111 x g i 5-8 minutter ved stuetemperatur, og det øverste lag rød, klar væske kasseres.
  2. Optag, plet, genkend og optal cellerne på chippen som beskrevet nedenfor.
    1. Hent cellerne på chippen som beskrevet i trin 1.Plet chippen til de CTC'er, der er registreret ved hjælp af Hoechst, CK-FITC og CD45-PE. CK-FITC er en specifik plet for tumorceller, og CD45-PE er for hvide blodlegemer.
    2. Der tilsættes 3 μL CK-FITC til 20 μL PBS. Indfør dette i sprøjten, og pump den fortyndede CK-FITC på chippen. Lad plette i 30 min. Indfør 300 μL PBS på chippen for at vaske chippen.
    3. Der tilsættes 3 μL CD45-PE til 20 μL PBS. Indfør dette i sprøjten, og pump den fortyndede CD45-PE på chippen. Lad det stå i 30 min. Indfør 300 μL PBS på chippen for at vaske chippen.
    4. Identificer CTC'erne med et inverteret fluorescensmikroskop ved 20x eller 40x forstørrelse. CTC'er udsender både blå og grøn fluorescens, og hvide blodlegemer (WBC'er) udsender både blå og rød fluorescens. Identificer CTC'erne med både blå og grøn fluorescens og WBC'erne med både blå og rød fluorescens.
    5. Fra immunofluorescensbillederne opregnes antallet af CTC'er, der er fanget på chippen. CTC'erne opregnes som Hoechst+/CK-FITC+/CD45− og WBC'erne som Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
  3. Berig de indfangede CTC'er ved at skylle med PBS gennem sprøjten i modsat retning på den mikrofluidiske chip for at opsamle CTC'erne, der er fanget på chippen fra indløbet. Brug en sprøjte med 1 ml PBS, indfør den fra udløbet for at berige CTC'erne, der er fanget på chippen inden for 2-3 minutter, og saml dem fra indløbet. Brug 1 ml PBS til hvert vasketrin, og gentag 3x.
  4. Plet tumorcellerne eller CTC'erne fanget på den mikrofluidiske chip som beskrevet nedenfor.
    1. Plet ved hjælp af calcein AM. Tilsæt 5 μL calcein AM til 20 μL PBS, pletter cellerne i 30 minutter, centrifuger derefter ved 111 x g i 2 minutter ved stuetemperatur for at opnå tumorceller, og opslæm i 1 ml PBS.
    2. For at identificere cellekernerne tilsættes 20 μL DAPI-opløsning (10 μL DAPI-reagens i 20 μL PBS) til chippen ved den optimale strømningshastighed på 1 ml / t for big-ellipse mikrofiltre og 1,5 ml / h for trapezoide. Pass gennem 20 μL anticytokeratin stamopløsning (3 μL anticytokeratinantistof i 20 μL PBS) for at reagere med chippen i 30 minutter.
    3. Plet WBC'erne fanget på chippen. Når CTC'erne er fanget på chippen, tilsættes 25 μL anti-CD45-antistofopløsning (5 μL anti-CD45-opløsning i 20 μL PBS) til chippen, og lad det plette i 30 minutter. Vask med PBS, og identificer epitelcellerne med både blå og grøn fluorescens.
  5. Udfør immunfluorescensidentifikation med fluorescensmikroskopi som beskrevet nedenfor.
    1. Brug et fluorescensmikroskop og exciter prøven med den blå laser. Find de celler, der udsender blå fluorescens, som er nukleatceller. Brug en af følgende forstørrelser: 10x, 20x eller 40x. Find et klart felt for tumorcellen. Til den blå laserkilde skal du bruge en excitationspladebølgelængde på 420-485 nm og en emissionspladebølgelængde på 515 nm.
    2. Uden at flytte prøverne skal du bruge en anden laserkilde. Drej fluorescensmikroskopet og exciter prøven med den grønne laser. Find cellerne, der udsender grøn fluorescens, hvilket er tegn på tumorceller. Tag billeder af det samme felt med samme forstørrelse med denne grønne laserkilde. De celler, der udsender både blå og grøn fluorescens, genkendes som tumorceller. Til den grønne laserkilde skal du bruge en excitationspladebølgelængde på 460-550 nm og en emissionspladebølgelængde på 590 nm
    3. Uden at flytte prøverne skal du bruge en anden laserkilde. Drej fluorescensmikroskopet og exciter prøven med den røde laser. Find cellerne, der udsender rød fluorescens. Tag billeder af det samme felt med samme forstørrelse med denne røde laserkilde. De celler, der udsender både blå og rød fluorescens, genkendes som hvide blodlegemer.
    4. Gem billedet til opnået ved hjælp af hver af laserkilderne ovenfor. Tag flere billeder af det samme felt med forskellige farvede lys.
    5. Brug ultraviolet lys med en excitationspladebølgelængde på 330-400 nm og en emissionspladebølgelængde på 425 nm. Brug lilla lys med en excitationspladebølgelængde på 395-415 nm og en emissionspladebølgelængde på 455 nm.
  6. Opsamlingseffektiviteten beregnes som i trin 1.2.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele opsætningen inkluderer en sprøjtepumpe, en sprøjte og en mikrofluidisk chip. Cellesuspensionen i sprøjten er forbundet med sprøjtepumpen, og cellesuspensionen indføres i den mikrofluidiske chip for at fange cellerne. Opsamlingseffektiviteten for alle de anvendte mikrofluidiske chips var omkring 90% eller derover. Til bølgechippen designede vi mikrostrukturer med varierede huller. De små huller bruges til at fange CTC'erne, og de store huller bruges til at accelerere strømningshastigheden. Cellesuspensionen flyder hurtigt i de store mellemrumsområder. De ubesvarede CTC'er har tendens til at blive fanget af de små huller i det efterfølgende array16. Til ellipsechips designede vi linjehuller i stedet for punktpunkthuller for at danne en slank tunnel for at forbedre optagelsen. Derfor blev der opnået høj fangsteffektivitet1. Vi designede en ellipsestruktur for at undgå kanter og hjørner for at bevare levedygtigheden. Trapezfiltrene har to cirkulære spiralkanaler med indlejrede trapezformede og cirkulære mikropostbarrierer. For trapezformede filtre var fangsteffektiviteten for MCF-7, MDA-MB-231 og HeLa henholdsvis 94%, 95% og 93%18%.

Figur 1 viser, at alle tumorcellerne blev fanget af bølgechippen. Da alle tumorcellerne var koncentreret omkring bølgemikropostarrayet, indikerer dette høj indfangningseffektivitet for denne mikrofluidiske chip, som det fremgår af antallet af tumorceller, der blev fanget. Derfor gør denne opsætning det meget lettere at fange sjældne tumorceller; Faktisk er chippen fremstillet til at fange et stort antal tumorceller såvel som et sjældent antal tumorceller. For eksempel, hvis chippen er solid eller reproducerbar nok til at fange 10.000 tumorceller, er det let for chippen at fange 10-100 celler. Video 1 viser, hvordan sjældent antal tumorceller blev opnået til præ-eksperimentet. En hul nål fremstillet ved hjælp af en mikropipettetrækker blev brugt til at aspirere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller fra en dyrkningsskål med fortyndede tumorceller farvet med calcein AM i PBS. Cellerne blev absorberet af silicagelrøret forbundet med den hule nål. En tumorcelle med grøn immunfluorescens blev suget ind i den hule nål. Blæsning i det hule rør førte til, at tumorcellen inde i den hule nål blev udledt i et mikrocentrifugerør1. Dette er proceduren for at opnå sjældne tumorceller. Figur 2 viser CTC'er fra en gastrisk kræftpatient fanget ved hjælp af mikrofiltre med lille ellipse. Figur 3 viser CTC'erne fra en kolorektal cancerpatient fanget ved hjælp af trapezformede mikrofiltre og udsender både blå og grøn fluorescens. Figur 4 viser tumorceller dyrket på chippen efter fangst, som er klar til at blive behandlet med kræftmedicin. Disse resultater illustrerer, at mikrofiltre med stor ellipse ikke har nogen negative virkninger på cellelevedygtigheden.

Figur 5 viser den kliniske immunfluorescensanalyse af kolorektal CTC'er fanget på den mikrofluidiske chip. Disse ses i brightfield og farves med Hoechst-, CK-FITC- og CD45-PE-farvning. CTC'erne blev anerkendt som DAPI+/CK+/CD45−, og WBC'erne blev identificeret som DAPI+/CK−/CD45+. Figur 6 viser kolorektal tumorceller dyrket på big-ellipse chip efter fangst. Figur 7 viser kolorektal tumorceller fanget på big-ellipse mikrofiltre. Klinisk blev CTC'er i patientblod fanget af bølgechips, trapezformede mikrofiltre og mikrofiltre med stor ellipse, hvilket indikerer, at disse tre chips har succes med at fange CTC'er. Potentielt kan de anvendes i CTC-produkter, såsom CTC-isoleringsprodukter, med høj effektivitet.

Figure 1
Figur 1: Optagelse af bølgechip. Alle tumorcellerne i MCF-7 blev fanget omkring bølgechipens array, uden at der manglede celler. Da der ikke var nogen tumorceller i noget andet område udover arrayet, indikerer dette chipens høje fangsteffektivitet. Et stort antal tumorceller blev fanget. Derfor kan sjældne tumorceller også let fanges. Tumorceller fra MCF-7 blev fanget af bølgechip og (A) farvet med Hoechst og (B) farvet med calcein AM. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Klinisk prøve for CTC'er fanget af mikrofiltre med små ellipse. Kliniske CTC'er hos en gastrisk kræftpatient fanget af mikrofiltre med små ellipse. CTC'erne blev identificeret i brightfield og med både blå og grøn fluorescens. Den blå cirkel i (A) angiver en CTC for en gastrisk kræftpatient fanget inde i chippen. Fra de billeder, der blev taget, kan det ses, at der ikke var andre celler i andre områder, hvilket indikerer, at fangstrenheden var høj for denne chip. Tumorceller af MCF-7 blev fanget af mikrofiltre med små ellipser og set i (A) brightfield, (B) farvet med Hoechst og (C) farvet med CK-FITC. Vægtstang: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Klinisk prøve af CTC'er fanget af trapezformede mikrofiltre. Kliniske CTC'er fra en kolorektal cancerpatient blev fanget af trapezformede mikrofiltre. På disse billeder kan det ses, at seks CTC'er blev fanget, hvilket indikerer, at fangsteffektiviteten var høj i det lille felt. Derudover dukkede ingen andre celler op, hvilket indikerer, at fangstrenheden var ekstremt høj for denne chip. Tumorceller af MCF-7 blev fanget af trapezformede mikrofiltre og set i (A) brightfield, (B) farvet med Hoechst og (C) farvet med CK-FITC. Skalabjælke: 20 μm Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Dyrkning af CTC'er fanget af mikrofiltre med stor ellipse. Tumorceller af MCF-7 blev fanget af big-ellipse mikrofiltre foran en big-ellipse micropost array. Ingen tumorceller passerede gennem arrayet, hvilket indikerer høj fangsteffektivitet for denne chip. Efter indfangning voksede tumorcellerne i 24-48 timer. Dette indikerer, at både fangsteffektiviteten og levedygtigheden var meget høj for mikrofiltrene med stor ellipse. De dyrkede tumorceller i MCF-7 blev fanget af big-ellipse mikrofiltre og set ved (A) 0 timer efter fangst, (B) 24 timer efter fangst og (C) 48 timer efter fangst. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på en klinisk prøve, der anvendes til CTC-indfangning af trapezformede mikrofiltre. Kliniske CTC'er fra en kolorektal cancerpatient blev fanget af trapezformede mikrofiltre. På disse billeder kan det ses, at to CTC'er blev fanget, hvilket indikerer høj optagelseseffektivitet. Der var ingen anden celleforstyrrelse undtagen rester af RBC'er i chippen. For den kliniske forbehandling af CTC-indfangning er det således bedre ikke at anvende røde blodlegemer. CTC'er af kolorektal cancer blev fanget af trapezformede mikrofiltre og set i (A) brightfield, (B) farvet med Hoechst, (C) farvet med CK-FITC og (D) set i fusionerede billeder. Vægtstang: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på dyrkede CTC'er fanget af en big-ellipse chip. Tumorcellekulturer af MCF-7-celler foran big-ellipse micropost array og bag big-ellipse mikrofiltre. Tumorcellerne farvet med calcein AM, der udsender grøn fluorescens, voksede som ønsket, hvilket indikerer, at cellelevedygtigheden for denne chip var meget høj. I alt var der 15 arrays med varierede huller for hvert array organiseret af big-ellipse mikroposter. MCF-7 tumorceller blev dyrket på big-ellipse chip efter capture (A) i et array og (B) i et andet array. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Eksempel på en klinisk prøve, der anvendes til CTC-indfangning af mikrofiltre med stor ellipse. Kliniske CTC'er fra en kolorektal cancerpatient blev fanget af mikrofiltre med stor ellipse. Fra billederne kan det ses, at der var RBC-forurening. Dette indikerer, at hele patientens blodprøve skal fortyndes, og at chippen skal skylles efter fangst. CTC'er af blodprøver fra patienter med klinisk kolorektal cancer blev taget på big-ellipse-chippen og set i (A) brightfield, (B) farvet med Hoechst og (C) farvet med CK-FITC. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prognosen og tidlig diagnosticering af kræft har en signifikant effekt på kræftbehandling1. CTC-isolering med mikrofluidiske chips tilbyder en flydende biopsi uden invasion. CTC'er er imidlertid ekstremt sjældne og heterogene i blodet1, hvilket gør det udfordrende at isolere CTC'er. CTC'er har lignende egenskaber som de oprindelige tumorkilder, hvorfra de stammer. Således spiller CTC'er en afgørende rolle i kræftmetastase1.

Den foreslåede protokol tillader en komplet analyse af CTC-isolering med den mikrofluidiske chip. Protokollen indeholder alle de vigtigste procedurer i forbindelse med CTC-isolering. For eksempel inkluderer denne protokol RBCL-analyser, som registreres omhyggeligt og organiseres i forskellige pakker, sjælden tumorcelleoptagelse, optimal bestemmelse af strømningshastighed, indfangningseffektivitet, klinisk karakterisering og optælling. Den omhyggelige styring af operationerne letter behandlingen af den kliniske patientprøve. Protokollen giver mulighed for forbehandling og behandling af kliniske patientprøver og tilbyder vitale tjenester til klinikere.

Til CTC-isolering er forbehandling af sjældne tumorceller ekstremt vanskelig at udføre. Denne vanskelighed blev løst ved at bruge en hul nål trukket gennem en nåletrækker til at suge 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller efter ønske. Derefter blev en tæt på reel klinisk patientblodprøve fremstillet med det ønskede antal tumorceller blandet i normalt blod, der efterlignede en patientblodprøve. Med disse kunstige patientblodprøver blev der udført et tæt på reelt eksperiment. Denne metode har løst et vanskeligt problem, der normalt mødes i CTC-isolering til præ-eksperimenter. Denne tilgang er ikke let at udføre og er aldrig blevet rapporteret andetsteds; Det er dog en nyttig tilgang, før du udfører et rigtigt klinisk eksperiment.

CTC-isolering med mikrofluidiske chips er klassificeret i tre typer: affinitetsbaseret, fysisk baseret og immunmagnetisk-baseret. For affinitetsbaseret isolering skal den mikrofluidiske chip ændres. De specifikke ændringsprocedurer er medtaget for modifikation med anti-EpCAM. CTC'erne blev identificeret ved immunofluorescensfarvning med Hoechst, CK-FITC og CD45-PE. Da mange tumorceller udtrykker EpCAM, er anti-EpCAM et vigtigt antistof til at fange CTC'er i patientens blod. Anti-EpCAM er dog meget dyrt; Således er mange aptamers blevet udviklet til at løse dette problem. Vi bruger hovedsageligt fysisk baserede mikrofluidiske chips såsom små ellipsemikrofiltre og trapezformede mikrofiltre til at fange CTC'er, da de er enkle, nemme at betjene og effektive.

Fordelen ved denne teknik i forhold til alternative teknikker er, at den fysisk baserede chip af mikrofiltre med stor ellipse fanger CTC'er med høj fangsteffektivitet. Årsagen til dette er, at der er slanke tunneler af linjehuller. Bølgechips fanger CTC'er ved at kombinere både fysisk egenskabsbaseret og affinitetsbaseret isolation. CTC'erne fanges af de små huller, og de store huller kan bruges til at accelerere strømningshastigheden. De ubesvarede CTC'er skal passere gennem de små huller i de følgende arrays og fanges også af den affinitetsbaserede isolation.

Protokollen har løst flere store problemer i CTC-isolering, især for kliniske forsøg. Det er imidlertid umuligt at medtage alle detaljerede trin i CTC-isolering, f.eks. med hensyn til nanopartiklers og nanostrukturers rolle og aptamermodifikation. Disse aspekter spiller også en væsentlig rolle i CTC-isolation. De er dog ikke kritiske for at løse problemer som forbedring af fangsteffektiviteten. I stedet beriger disse aspekter CTC-isolationen med nyt indhold.

Dette arbejde koncentrerer sig om den kliniske isolering af CTC'er med den designede mikrofluidiske chip. De fleste anvendte mikrofluidiske chips er hovedsageligt fysisk baserede, såsom big-ellipse filtre og små-ellipse filtre. Bølgechips fremstilles ved at kombinere både affinitetsbaserede og fysisk baserede chipegenskaber1. Mikroposterne i big-ellipse-filtre blev designet til at være kortere for at forbedre fangstrenheden i dette arbejde. De små ellipsefiltre kan også forbedres ved at designe dem med forskellige mikrostolpestørrelser til forskellige arrays. Bølgechips kan designes bedre ved at tilføje flere arrays for at forbedre optagelsen.

Big-ellipse filtre er organiseret med lange elliptiske mikroposter for at danne linjelinjetunneler, der opnår høj fangsteffektivitet. Begrænsningen ved denne fangst er imidlertid, at fangstrenheden ikke er høj nok, eller at høj fangstrenhed ikke let opnås. For bølgechip bruges de små huller til at fange CTC'erne, og de ubesvarede CTC'er fanges af følgende arrays. De store huller bruges til at accelerere strømningshastigheden og eliminere forstyrrelser fra RBC'er og dermed forbedre fangstens renhed; Opsamlingseffektiviteten er dog fast på over 90% og er reproducerbar.

Klinisk validering er signifikant ved CTC-isolering med mikrofluidiske chips. Dette arbejde præsenterer den kliniske isolering af CTC'er fra kolorektal patienter med big-ellipse filtre, små-ellipse filtre og bølgechips. Formålet med de designede mikrofluidiske chips er at klinisk opregne CTC'er. For de eksisterende metoder i nogle andre systemer eller platforme er opsamlingseffektiviteten lav, eller indfangningseffektiviteten er ikke høj nok til, at metoden kan anvendes effektivt i kliniske applikationer.

Baseret på de kliniske præstationer af disse tre mikrofluidiske chips, som har høj fangsteffektivitet, kan de potentielt anvendes i CTC-produkter, især efter modifikation. Styrken ved vores protokol er, at den demonstrerer optællingen af et sjældent antal tumorceller for at efterligne virkelige kliniske prøver. Derudover er den kliniske eksperimentelle procedure mulig og praktisk. Denne metode kan adskille CTC'er fra fuldpatientblod. Derfor er metoden egnet til kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette forskningsarbejde blev støttet af Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), National Natural Science Foundation of China (21904003), det videnskabelige forskningsprojekt fra Tianjin Education Commission (2018KJ154), det provinsielle naturvidenskabelige forskningsprogram for videregående uddannelsesinstitutioner i Anhui-provinsen (KJ2020A0239) og Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Forarbejdning, East China Normal University (MIP20221).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein AM BIOTIUM 80011
calibrated microcapillary pipettes Sigma- Aldrich P0799
CD45-PE BD Biosciences 560975
CK-FITC BD Biosciences 347653 cytokeratin monoclonal antibody
DMEM HyClone SH30081.05
fetal bovine serum (FBS) GIBCO,USA 26140
Hoechst 33342 Molecular Probes, Solarbio Corp., China C0031
penicillin-streptomycin Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL) Solarbio, Beijing R1010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
  2. World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
  4. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  5. Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
  6. Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
  7. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  8. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  9. Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
  10. Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
  11. Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
  12. Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
  13. Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
  14. Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
  15. Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
  16. Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
  17. Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
  18. Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).

Tags

Bioengineering udgave 200 Mikrofluidisk chip cirkulerende tumorceller (CTC'er) immunfluorescensidentifikation
Klinisk mikrofluidisk chipplatform til isolering af alsidige cirkulerende tumorceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y.,… More

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y., Wang, S., Jiao, X. Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (200), e64674, doi:10.3791/64674 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter