Summary
臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場 で循環腫瘍細胞(CTC)を免疫蛍光染色し、単一のCTCの迅速な検出と同定を可能にする重要な生物医学的分析技術です。
Abstract
循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCの列挙は、CTCがまれで不均一であるため、患者の疾患を決定する上で不可欠です。CTCは原発腫瘍から剥離し、血液循環系に入り、離れた部位で増殖する可能性があるため、腫瘍が転移します。CTCは原発腫瘍と同様の情報を持っているため、CTCの分離とその後の特性評価は、がんのモニタリングと診断において重要な場合があります。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離の強力な方法です。マイクロ流体チップは、患者の痛みのないリキッドバイオプシー法を提供します。この研究では、CTCの分離、分析、および早期診断に必要な一連の機能とサービスを組み込んだ、汎用性の高いCTC分離プラットフォームである臨床マイクロ流体チップのプロトコルのリストを提示し、生体分子分析と癌治療を容易にします。このプログラムには、まれな腫瘍細胞カウント、赤血球溶解を含む臨床患者の血液前処理、およびマイクロ流体チップ上でのその 場 でのCTCの分離と認識が含まれます。このプログラムでは、腫瘍細胞またはCTCの正確な列挙が可能です。 さらに、このプログラムには、汎用性の高いマイクロ流体チップによるCTC分離と、チップ上の その場での 免疫蛍光同定、それに続く生体分子分析を組み込んだツールが含まれています。
Introduction
循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCはまれで異種であるため、CTCの列挙は不可欠です。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離のための強力な技術です1。2〜3 mLの実際の患者の血液には1〜10個のCTCしか含まれていないため、正常な血液と混合されたまれな数の腫瘍細胞は実際の患者の血液を厳密に模倣します。重要な実験問題を解決するために、PBSに導入された多数の腫瘍細胞を使用するか、正常な血液と混合する代わりに、まれな数の腫瘍細胞を使用すると、実験を行う際の現実に近い血球数が少なくなります。
がんは世界の主要な死因です2。CTCは、血液およびリンパ循環系を循環する元の腫瘍から脱落した腫瘍細胞である3。CTCが新しい生存可能な環境に移動すると、それらは2番目の腫瘍として成長します。これは転移と呼ばれ、がん患者の死亡の90%の原因です4。CTCは、予後、早期診断、および癌のメカニズムを理解するために不可欠です。しかし、CTCは患者の血液中では非常にまれで不均一です5,6。
マイクロ流体チップは、腫瘍に浸潤しないリキッドバイオプシーを提供します。それらには、ポータブルで低コストであり、セルに一致するスケールを備えているという利点があります。マイクロ流体チップによるCTCの単離は、主に2つのタイプに分類されます:抗原抗体結合に依存するアフィニティベース7,8,9であり、CTC単離のオリジナルで最も広く使用されている方法です。腫瘍細胞と血液細胞10,11,12,13,14,15のサイズと変形能の違いを利用する物理ベースのチップは、ラベルフリーで、操作が簡単です。他の技術に対するマイクロ流体チップの利点は、大きな楕円マイクロフィルターの物理ベースのアプローチが高い捕捉効率でCTCをしっかりと捕捉することです。この理由は、楕円のマイクロポストがラインラインギャップの細いトンネルに編成されているためです。ラインラインギャップは、菱形マイクロポストなどのマイクロポストによって形成される従来のポイントポイントギャップとは異なります。CTCのウェーブチップベースのキャプチャは、物理的特性ベースの分離とアフィニティベースの分離の両方を組み合わせたものです。ウェーブチップベースのキャプチャには、円形のマイクロポストに抗EpCAMの抗体をコーティングした30のウェーブ型アレイが含まれます。CTCは小さなギャップによって捕捉され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。見逃されたCTCは、次のアレイの小さなギャップを通過しなければならず、チップ16の内部に組み込まれたアフィニティベースの絶縁によって捕捉される。
このプロトコルの目的は、まれな数の腫瘍細胞のカウントと、マイクロ流体チップを使用したCTCの臨床分析を実証することです。プロトコルは、CTC単離ステップ、低数の腫瘍細胞を取得する方法、小楕円フィルター、大楕円フィルター、および台形フィルターの臨床的物理的分離、親和性修飾、および濃縮17について説明しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
患者の血液サンプルは、上海医科大学附属龍華病院から提供され、プロトコルは北京大学第三病院の人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。研究目的でサンプルを使用することについて、患者からインフォームドコンセントが得られました。
1. 培養腫瘍細胞による捕捉効率を確認するための事前実験
- 腫瘍細胞をMCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaで培養し、捕捉効率を測定した。腫瘍細胞懸濁液を希釈し、腫瘍細胞の数を数え、1 mLのPBS中の所望の細胞数が得られるまで繰り返します。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した1mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の開始細胞数~1×105 細胞を有する細胞培養フラスコ内で細胞を培養する。5%CO2 雰囲気で37°Cの加湿雰囲気中でインキュベートします。
- 細胞株が接着性単層として95%コンフルエントまで増殖したら、Chenらに記載されているように、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します16。
- 腫瘍細胞をカルセインAMで染色します。培養皿に3 μLのカルセインAMを入れ、培養器内で30分間保持します。その後、トリプシンですべての細胞を消化します。
- 細胞計数チャンバーを用いてPBSで培養した腫瘍細胞を計数し、PBS1mLあたり100個の腫瘍細胞が得られるまで希釈する。
注:細胞数を正確に列挙するために、得られた細胞懸濁液の50μLを採取して、その中の腫瘍細胞の数が5個であるかどうかを顕微鏡で確認します。50μLの細胞懸濁液中の実際の腫瘍細胞数に応じて、100個の腫瘍細胞を得るために採取する必要のある細胞懸濁液の量を決定します。
- シリンジポンプ付きシリンジを使用して、PBS1 mLあたり100個の腫瘍細胞を含む細胞懸濁液を、0.5 mL/h、1 mL/h、2 mL/h、3 mL/h、4 mL/h、および5 mL/hのさまざまな流速でマイクロ流体チップに導入します。さまざまな流量の捕捉効率を取得し、最適な流量を決定します。
- チップ上に捕捉され、出口から流出する腫瘍細胞の数を数えます。キャプチャ効率を次のように計算します。
捕捉効率=捕捉細胞数/(捕捉細胞数+流出細胞数)×100% - 繰り返して、10〜100(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100)の異なる数の腫瘍細胞の捕捉効率を得る。
- チップ上に捕捉され、出口から流出する腫瘍細胞の数を数えます。キャプチャ効率を次のように計算します。
- マイクロ流体チップの希少な数の腫瘍細胞をテストおよび検証します。マイクロピペットプラーで作った中空針を使用して、これらの10サンプル懸濁液をマイクロ流体チップに注入し、1 mLのPBSで希釈した1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を吸引します。チップ上で捕捉した後の各サンプルの腫瘍細胞の数を検出して列挙します。
注意: 中空針の長さは約3 cm、外径は1 mmです。 - 正常な血液サンプルにスパイクされた腫瘍細胞の臨床実験前テストを実行します。
- 腫瘍細胞をカルセインAMで染色し、5 μLのPBS中の100個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1mLの全正常血液サンプルにスパイクします。.これらの細胞をチップに導入し、緑色の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙する。上記のようにチップ上で 生体内 計数を行い、捕捉後の捕捉効率を算出する。
- ステップ1.4.1を繰り返して、腫瘍細胞数の10から90までの9つの追加濃度(10、20、30、40、50、60、70、80、90)について繰り返します。
- ステップ1.3で説明したように、染色せずに1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を列挙し、1 mLの全正常血液にスパイクし、これらのサンプルをマイクロ流体チップに導入し、チップ上の腫瘍細胞を捕捉します。
- チップをヘキスト、CK-FITC、およびCD45-PEで染色します。3〜5μLの蛍光色素を20〜30μLのPBSに入れ、次いでこの溶液をシリンジを用いてマイクロ流体チップ上に導入する。チップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を青と緑の両方の免疫蛍光で列挙し、捕捉効率を決定します。
- 抗EpCAMの親和性ベースの捕捉のためにマイクロ流体チップの修飾を行う。
メモ: Wave チップはアフィニティベースと物理的特性ベースの両方の分離を組み合わせているため、エージェントでチップを変更します。- 100 μLの4%(v/v)3-メルカプトプロピルトリメトキシシランをエタノール中で室温で45分間チップの表面改質します。チップの内部構造、特に上面と基板ガラスの接着を破壊する場合に備えて、この溶液をチップに注意深くゆっくりと導入してください。
注:チップ表面はメルカプトシランを使用して改質されています。チップ上で発生する相互作用は、化学結合によって決定されます。抗原で修飾された抗体の結合を実現するために化学結合が確立されます。チップ内では、さまざまな試薬が修飾され、互いに結合する化学結合が確立されます。修飾される最後の試薬は、抗上皮接着分子(抗EpCAM)である。EpCAMの腫瘍細胞表面抗原は、チップ内の抗EpCAMと組み合わせて、CTCの捕捉を実現します。 - エタノール3倍で洗浄します。カップリング剤N-y-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS、1 μM)を100 μLチップ上に加え、30分間相互作用させます。
- PBS 3xで洗浄します。シリンジを使用して、洗浄するチップに1 mLのPBSを導入します。
- チップを30-40 μLの10 μg/mLニュートラアビジンで室温で30分間処理し、細胞をGMBSに固定化してから、PBSで洗い流して余分なアビジンを除去します。
- 100 μLのPBS溶液中に10 μg/mLの濃度の抗ビオチン化EpCAM抗体3 μLを1%(w/v)BSAでチップを修飾します。これを一晩保管してください。
- 100 μLの4%(v/v)3-メルカプトプロピルトリメトキシシランをエタノール中で室温で45分間チップの表面改質します。チップの内部構造、特に上面と基板ガラスの接着を破壊する場合に備えて、この溶液をチップに注意深くゆっくりと導入してください。
2.循環腫瘍細胞(CTC)を列挙するためのチップ上の臨床実験
- 赤血球溶解(RBCL)溶液を使用して臨床がん患者の血液サンプルを前処理するか、シリンジを使用して2〜3 mLの血液サンプルをマイクロ流体チップに直接導入します。
- 約30分かかる前処理を実行します。抗凝固チューブで全血サンプルを収集します。6〜9 mLのRBS溶解溶液を2〜3 mLの血液に加えます。111 x g で室温で5〜8分間遠心分離し、赤い透明な液体の上層を廃棄します。
- 以下に説明するように、チップ上の細胞を捕捉、染色、認識、および列挙します。
- ステップ 1 の説明に従ってチップ上の細胞を捕捉します。Hoechst、CK-FITC、および CD45-PE を使用して捕捉された CTC のチップを染色します。CK-FITCは腫瘍細胞に対する特異的染色剤であり、CD45-PEは白血球に対する特異的染色剤である。
- 3 μL の CK-FITC を 20 μL の PBS に加えます。これをシリンジに入れ、希釈したCK-FITCをチップに送り込みます。30分間染色します。チップ上に300 μLのPBSを導入してチップを洗浄します。
- 3 μLのCD45-PEを20 μLのPBSに加えます。これをシリンジに入れ、希釈したCD45-PEをチップに送り込みます。30分間放置します。チップ上に300 μLのPBSを導入してチップを洗浄します。
- 倒立蛍光顕微鏡で20倍または40倍の倍率でCTCを同定します。CTCは青色と緑色の両方の蛍光を発し、白血球(WBC)は青色と赤色の両方の蛍光を発します。青と緑の両方の蛍光を持つCTCと、青と赤の両方の蛍光を持つWBCを特定します。
- 免疫蛍光画像から、チップ上に捕捉されたCTCの数を列挙する。CTC を Hoechst+/CK-FITC+/CD45- として列挙し、WBC を Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ として列挙します。
- シリンジを通してPBSでマイクロ流体チップに逆方向にフラッシュし、チップ上に捕捉されたCTCを入口から回収することにより、捕捉されたCTCを濃縮します。1 mLのPBSを含むシリンジを使用し、出口から導入して、2〜3分以内にチップ上に捕捉されたCTCを濃縮し、入口から収集します。洗浄ステップごとに1 mLのPBSを使用し、3回繰り返します。
- マイクロ流体チップ上に捕捉された腫瘍細胞またはCTCを以下のように染色する。
- カルセインAMを使用して染色します。5 μLのカルセインAMを20 μLのPBSに加え、細胞を30分間染色した後、111 x g で室温で2分間遠心分離して腫瘍細胞を取得し、1 mLのPBSに懸濁します。
- 細胞核を特定するには、20 μLのDAPI溶液(20 μLのPBSに10 μLのDAPI試薬)を、大きな楕円マイクロフィルターの場合は1 mL/h、台形のマイクロフィルターの場合は1.5 mL/hの最適な流速でチップに追加します。20 μLの抗サイトケラチン原液(20 μLのPBS中に3 μLの抗サイトケラチン抗体)を通過させて、チップと30分間反応させます。
- チップにキャプチャされたWBCを染色します。CTCをチップ上に捕捉した後、25 μLの抗CD45抗体溶液(20 μLのPBS中に5 μLの抗CD45溶液)をチップに加え、30分間染色します。PBSで洗浄し、青色と緑色の両方の蛍光で上皮細胞を同定します。
- 以下に述べるように蛍光顕微鏡による免疫蛍光同定を行う。
- 蛍光顕微鏡を使用し、青色レーザーでサンプルを励起します。核細胞である青色蛍光を発する細胞を見つけます。次の倍率のいずれかを使用します:10倍、20倍、または40倍。腫瘍細胞の明確なフィールドを見つけます。青色レーザー光源には、励起板波長420〜485 nm、発光板波長515 nmを使用します。
- サンプルを移動せずに、別のレーザー光源を使用します。蛍光顕微鏡を回転させ、緑色レーザーで試料を励起します。腫瘍細胞の指標である緑色の蛍光を発する細胞を見つけます。この緑色レーザー光源で同じ視野の画像を同じ倍率で撮影します。青色と緑色の両方の蛍光を発する細胞は、腫瘍細胞として認識されます。緑色レーザー光源には、励起板波長460〜550 nm、発光板波長590 nmを使用してください
- サンプルを移動せずに、別のレーザー光源を使用します。蛍光顕微鏡を回転させ、赤色レーザーで試料を励起します。赤色蛍光を発する細胞を見つけます。この赤色レーザー光源で同じ視野の画像を同じ倍率で撮影します。青色と赤色の両方の蛍光を発する細胞は、白血球として認識されます。
- 上記の各レーザー光源を使用して得られた画像を保存します。異なる色のライトで同じフィールドの複数の画像を撮ります。
- 励起板波長330〜400nm、発光板波長425nmの紫外線を使用してください。励起板波長395-415nm、発光板波長455nmの紫色光を使用してください。
- 手順1.2.1のようにキャプチャ効率を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
セットアップ全体には、シリンジポンプ、シリンジ、およびマイクロ流体チップが含まれます。シリンジ内の細胞懸濁液をシリンジポンプに接続し、細胞懸濁液をマイクロ流体チップに導入して細胞を捕捉します。利用したすべてのマイクロ流体チップの捕捉効率は約90%以上でした。ウェーブチップでは、ギャップの異なる微細構造を設計しました。小さなギャップはCTCを捕捉するために使用され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。細胞懸濁液は大きなギャップ領域で素早く流れます。欠落したCTCは、後続のアレイ16の小さなギャップによって捕捉される傾向がある。楕円チップの場合、ポイントとポイントのギャップではなくラインラインギャップを設計して、キャプチャを強化するためにスリムなトンネルを形成しました。したがって、高い捕捉効率を達成した1.生存率を維持するために、エッジとコーナーを避けるように楕円構造を設計しました。台形フィルターには、台形と円形のマイクロポストバリアが埋め込まれた2つの円形スパイラルチャネルがあります。台形フィルターの場合、MCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaのキャプチャ効率はそれぞれ94%、95%、および93%でした18。
図1 は、全ての腫瘍細胞がウェーブチップによって捕捉されたことを示す。すべての腫瘍細胞がウェーブマイクロポストアレイの周りに集中していたため、これは、捕捉された腫瘍細胞の数によって示されるように、このマイクロ流体チップの高い捕捉効率を示しています。したがって、この設定により、まれな腫瘍細胞の捕捉がはるかに簡単になります。実際、このチップは、多数の腫瘍細胞とまれな数の腫瘍細胞を捕捉するように製造されています。例えば、チップが10,000個の腫瘍細胞を捕捉するのに十分固体または再現性がある場合、チップは10〜100個の細胞を捕捉することが容易である。 ビデオ1 は、事前実験で得られた腫瘍細胞の希少性を示しています。マイクロピペットプラーを用いて作製した中空針を用いて、PBS中でカルセインAMで染色した腫瘍細胞を希釈した培養皿から1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個の腫瘍細胞を吸引した。細胞は、中空針で接続されたシリカゲルチューブによって吸収された。緑色の免疫蛍光を有する腫瘍細胞を中空針に吸引した。中空チューブに吹き込むと、中空針内部の腫瘍細胞が微小遠心チューブ1に排出される。これはまれな腫瘍細胞を得るための手順です。 図2 は、小楕円マイクロフィルターを用いて捕捉された胃癌患者のCTCを示す。 図3 は、台形マイクロフィルターを使用して捕捉され、青色と緑色の両方の蛍光を発する結腸直腸癌患者のCTCを示しています。 図4 は、捕捉後にチップ上で増殖し、抗がん剤で治療する準備ができている腫瘍細胞を示しています。これらの知見は、大楕円マイクロフィルターが細胞の生存率に悪影響を及ぼさないことを示している。
図5 は、マイクロ流体チップ上に捕捉された結腸直腸CTCの臨床免疫蛍光分析を示す。これらは明視野で見られ、ヘキスト、CK-FITC、およびCD45-PE染色で染色されます。CTCはDAPI+/CK+/CD45−として認識され、WBCはDAPI+/CK−/CD45+として識別された。 図6 は、捕捉後の大楕円チップ上で培養した大腸腫瘍細胞を示す。 図7 は、大きな楕円のマイクロフィルター上に捕捉された結腸直腸腫瘍細胞を示す。臨床的には、患者の血液中のCTCは、波動チップ、台形マイクロフィルター、および大楕円マイクロフィルターによって捕捉され、これら3つのチップがCTCの捕捉に成功していることを示しています。
図1:ウェーブチップキャプチャ。 MCF-7のすべての腫瘍細胞は、細胞が欠落することなく、ウェーブチップのアレイの周囲に捕捉されました。アレイ以外の領域に腫瘍細胞がなかったため、これはチップの高い捕捉効率を示しています。多数の腫瘍細胞が捕獲された。したがって、まれな腫瘍細胞も容易に捕捉することができる。MCF-7の腫瘍細胞をウェーブチップにより捕捉し、(A)ヘキストで染色し、(B)カルセインAMで染色した。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:小楕円マイクロフィルターで捕捉されたCTCの臨床サンプル。 小楕円マイクロフィルターで撮影した胃がん患者の臨床CTC。CTCは明視野で、青色と緑色の両方の蛍光で同定されました。(A)の青い円は、チップ内部に捕捉された胃癌患者のCTCを示す。撮影された画像から、他のどの領域にも他のセルがなかったことがわかり、このチップのキャプチャ純度が高かったことを示しています。MCF-7の腫瘍細胞を小楕円マイクロフィルターで捕捉し、(A)明視野、(B)ヘキストで染色、(C)CK-FITCで染色した。スケールバー:20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:台形マイクロフィルターで捕捉されたCTCの臨床サンプル。 結腸直腸癌患者からの臨床CTCは、台形マイクロフィルターによって捕捉されました。これらの画像では、6つのCTCが撮影されたことがわかり、小さなフィールドでの捕獲効率が高かったことがわかります。さらに、他の細胞は出現せず、このチップの捕捉純度が非常に高いことを示しています。MCF-7の腫瘍細胞を台形マイクロフィルターで捕捉し、(A)明視野、(B)ヘキストで染色、および(C)CK-FITCで染色しました。スケールバー: 20 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:大きな楕円マイクロフィルターで捕捉されたCTCの培養。 MCF-7の腫瘍細胞は、大きな楕円マイクロポストアレイの前で大きな楕円のマイクロフィルターによって捕捉されました。腫瘍細胞はアレイを通過せず、このチップの高い捕捉効率を示しています。捕捉後、腫瘍細胞は24〜48時間増殖した。これは、捕捉効率と生存率の両方が大楕円マイクロフィルターで非常に高いことを示しています。MCF-7の培養腫瘍細胞を大楕円マイクロフィルターで捕捉し、(A)捕捉後0時間、(B)捕捉後24時間、および(C)捕捉後48時間で観察した。スケールバー:50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:台形マイクロフィルターによるCTC捕捉に用いた臨床サンプルの例。 結腸直腸癌患者からの臨床CTCは、台形マイクロフィルターによって捕捉されました。これらの画像では、2つのCTCがキャプチャされたことがわかり、キャプチャ効率が高いことを示しています。チップ内の赤血球の残留物以外の細胞障害はありませんでした。したがって、CTC捕捉の臨床前処理には、赤血球溶解を使用しない方が良い。結腸直腸癌のCTCを台形マイクロフィルターで捕捉し、(A)明視野、(B)ヘキストで染色、(C)CK-FITCで染色、および(D)マージ画像で観察されました。スケールバー:20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:大楕円チップで捕捉した培養CTCの例。 大楕円マイクロポストアレイの前および大楕円マイクロフィルターの後ろにあるMCF-7細胞の腫瘍細胞培養。緑色蛍光を発するカルセインAMで染色された腫瘍細胞は、所望のように増殖し、このチップの細胞生存率が非常に高いことを示している。合計で15個のアレイがあり、各アレイには大きな楕円のマイクロポストによってさまざまなギャップがありました。MCF-7腫瘍細胞は、(A)1つのアレイで、(B)別のアレイで捕捉した後にビッグ楕円チップ上で培養した。スケールバー:50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:大楕円マイクロフィルターによるCTC捕捉に用いた臨床サンプルの例。 大腸がん患者の臨床CTCは、大きな楕円のマイクロフィルターによって捕捉されました。画像から、RBC汚染があったことがわかります。これは、患者全体の血液サンプルを希釈する必要があり、キャプチャ後にチップを洗い流す必要があることを示しています。臨床大腸がん患者の血液サンプルのCTCを大楕円チップに捕捉し、(A)明視野、(B)ヘキスト染色、および(C)CK-FITCで染色しました。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
がんの予後と早期診断は、がん治療に大きな影響を与えます1.マイクロ流体チップによるCTC分離は、浸潤のないリキッドバイオプシーを提供します。しかし、CTCは血液中で非常にまれで不均一であるため1、CTCを単離することは困難です。 CTCは、それらが由来する元の腫瘍源と同様の特性を有する。したがって、CTCは癌転移において重要な役割を果たします1。
提案されたプロトコルは、マイクロ流体チップによるCTC分離の完全な分析を可能にします。プロトコルには、CTC分離に関連するすべての主要な手順が含まれています。たとえば、このプロトコルには、細心の注意を払って記録され、さまざまなパッケージに編成されたRBCL分析、希少腫瘍細胞の取得、最適な流速の決定、捕捉効率、臨床特性評価、および列挙が含まれます。操作の慎重な管理は、臨床患者のサンプル処理を容易にします。このプロトコルは、臨床患者サンプルの前処理と処理を可能にし、臨床医に不可欠なサービスを提供します。
CTC単離の場合、希少腫瘍細胞の前処理は極めて困難です。この困難は、針引き器を通して引っ張られた中空の針を使用して、必要に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を吸引することによって解決されました。次に、患者の血液サンプルを模倣して、正常血液に所望の数の腫瘍細胞を混合した、現実に近い臨床患者の血液サンプルを調製した。これらの人工患者の血液サンプルを用いて、現実に近い実験を行った。この方法は、事前実験のためのCTC単離で通常遭遇する困難な問題を解決しました。このアプローチは実行が容易ではなく、他の場所で報告されたことはありません。ただし、実際の臨床実験を行う前に有用なアプローチです。
マイクロ流体チップによるCTC分離は、アフィニティベース、物理ベース、免疫磁気ベースの3種類に分類されます。アフィニティベースの分離では、マイクロ流体チップを変更する必要があります。抗EpCAMによる変更には、特定の変更手順が含まれています。CTCは、ヘキスト、CK-FITC、およびCD45-PEによる免疫蛍光染色によって同定されました。多くの腫瘍細胞がEpCAMを発現しているため、抗EpCAMは患者の血液中のCTCを捕捉するための重要な抗体です。ただし、アンチEpCAMは非常に高価です。したがって、この問題を解決するために多くのアプタマーが開発されている。CTCはシンプルで操作が簡単で効果的であるため、主に小楕円マイクロフィルターや台形マイクロフィルターなどの物理ベースのマイクロ流体チップを利用してCTCを捕捉します。
他の技術に対するこの技術の利点は、大きな楕円マイクロフィルターの物理ベースのチップが高い捕捉効率でCTCをしっかりと捕捉することです。この理由は、ラインラインギャップのスリムなトンネルがあるためです。Waveチップは、物理的特性ベースの分離とアフィニティベースの分離の両方を組み合わせてCTCをキャプチャします。CTCは小さなギャップによって捕捉され、大きなギャップを使用して流量を加速できます。欠落した CTC は、次のアレイの小さなギャップを通過する必要があり、アフィニティベースの分離によってもキャプチャされます。
このプロトコルは、特に臨床実験において、CTC分離におけるいくつかの主要な問題を解決しました。しかし、ナノ粒子やナノ構造の役割やアプタマー修飾など、CTC単離にすべての詳細なステップを含めることは不可能です。これらの側面は、CTCの分離においても重要な役割を果たします。ただし、キャプチャ効率の向上などの問題を解決する上で重要ではありません。代わりに、これらの側面は新しいコンテンツでCTC分離を充実させます。
この作業は、設計されたマイクロ流体チップによるCTCの臨床的分離に焦点を当てています。使用されるほとんどのマイクロ流体チップは、大楕円フィルターや小楕円フィルターなど、主に物理ベースです。Waveチップは、アフィニティベースのチッププロパティと物理ベースのチッププロパティの両方を組み合わせて作られています1。大楕円フィルターのマイクロポストは、この作業でキャプチャの純度を高めるために短く設計されました。小楕円フィルタは、アレイごとに異なるマイクロポストサイズで設計することで改善することもできます。Waveチップは、キャプチャを強化するためにアレイを追加することで、より適切に設計できます。
大きな楕円フィルターは、長い楕円形のマイクロポストで構成され、高いキャプチャ効率を実現するラインライントンネルを形成します。しかしながら、この捕捉の限界は、捕捉純度が十分に高くないか、または高い捕捉純度が得られにくいことである。Wave チップの場合、小さなギャップを使用して CTC をキャプチャし、欠落した CTC は次のアレイによってキャプチャされます。大きなギャップは、流量を加速し、RBCからの外乱を排除するために使用されるため、キャプチャの純度が向上します。ただし、キャプチャ効率は90%以上と安定しており、再現性があります。
臨床的検証は、マイクロ流体チップによるCTC分離において重要です。この研究は、大楕円フィルター、小楕円フィルター、およびウェーブチップを使用した結腸直腸患者からのCTCの臨床的分離を示しています。設計されたマイクロ流体チップの目的は、CTCを臨床的に列挙することです。他のいくつかのシステムまたはプラットフォームの既存の方法の場合、捕捉効率が低いか、または捕捉効率が、この方法が臨床アプリケーションで効果的に使用されるのに十分高くない。
捕捉効率の高いこれら3つのマイクロ流体チップの臨床性能に基づいて、特に修飾後のCTC製品に適用できる可能性があります。私たちのプロトコルの強みは、実際の臨床サンプルを模倣するためにまれな数の腫瘍細胞の列挙を実証することです。さらに、臨床実験手順は実行可能で実用的です。この方法は、患者の血液全体からCTCを分離することができます。したがって、この方法は臨床用途に適している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究成果は、中国安徽自然科学財団(1908085MF197、1908085QB66)、中国国家自然科学財団(21904003)、天津教育委員会科学研究プロジェクト(2018KJ154)、安徽省高等教育機関の省自然科学研究プログラム(KJ2020A0239)、および華東多次元情報重点実験室上海多次元情報処理重点実験室の支援を受けました処理、華東師範大学(MIP20221)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
