Summary
临床微流控芯片是一种重要的生物医学分析技术,可简化临床患者血液样本预处理,并在芯片上原 位 对循环肿瘤细胞(CTC)进行免疫荧光染色,从而可以快速检测和鉴定单个CTC。
Abstract
循环肿瘤细胞 (CTC) 在癌症预后、诊断和抗癌治疗中具有重要意义。CTC 计数对于确定患者疾病至关重要,因为 CTC 很少见且具有异质性。CTC从原发肿瘤分离,进入血液循环系统,并可能在远处生长,从而转移肿瘤。由于CTC携带与原发肿瘤相似的信息,因此CTC分离和随后的表征对于监测和诊断癌症至关重要。稀有CTC的计数、亲和力修饰和临床免疫荧光染色是CTC分离的有效方法,因为它们提供了具有高灵敏度的必要元素。微流控芯片提供了一种液体活检方法,对患者没有任何痛苦。在这项工作中,我们提出了临床微流控芯片的协议列表,这是一种多功能CTC分离平台,其中包含CTC分离,分析和早期诊断所需的一组功能和服务,从而促进生物分子分析和癌症治疗。该计划包括罕见肿瘤细胞计数,临床患者血液预处理,其中包括红细胞裂解,以及在微流控芯片上 原位 分离和识别CTC。该程序允许精确计数肿瘤细胞或CTC。 此外,该程序还包括一个工具,该工具将CTC分离与多功能微流控芯片相结合,并在芯片上进行 原位 免疫荧光鉴定,然后进行生物分子分析。
Introduction
循环肿瘤细胞 (CTC) 在癌症预后、诊断和抗癌治疗中具有重要意义。CTC 计数至关重要,因为 CTC 很少见且具有异质性。稀有CTC的计数、亲和力修饰和临床免疫荧光染色是CTC分离的强大技术,因为它们提供了具有高灵敏度的必要元素1。罕见数量的肿瘤细胞与正常血液混合,与真实患者血液非常相似,因为 2-3 mL 的真实患者血液仅包含 1-10 个 CTC。为了解决一个关键的实验问题,与其使用PBS中引入的大量肿瘤细胞或与正常血液混合,不如使用稀有数量的肿瘤细胞为我们提供少量的血细胞,这在进行实验时更接近现实。
癌症是世界上导致死亡的主要原因2.CTC是从原始肿瘤脱落的肿瘤细胞,在血液和淋巴循环系统中循环3。当CTC移动到一个新的可存活环境时,它们会作为第二个肿瘤生长。这称为转移,占癌症患者死亡的90%4。CTC 对于预后、早期诊断和了解癌症机制至关重要。然而,CTC在患者血液中极为罕见且异质性5,6。
微流控芯片提供不会侵入肿瘤的液体活检。它们具有便携、低成本和具有电池匹配规模的优点。用微流控芯片分离CTCs主要分为两种类型:亲和型,依靠抗原抗体结合7,8,9,是CTC分离的原始和应用最广泛的方法;和基于物理的芯片,利用肿瘤细胞和血细胞之间的大小和变形性差异10,11,12,13,14,15,无标记,易于操作。与其他技术相比,微流控芯片的优势在于,基于物理的大椭圆微滤子方法能够以高捕获效率牢固地捕获CTC。原因是椭圆微柱被组织成细长的线-线间隙隧道。线-线间隙不同于菱形微型柱等微柱形成的传统点-点间隙。基于波芯片的CTC捕获结合了基于物理性质和基于亲和力的分离。基于波浪芯片的捕获涉及30个波浪形阵列,抗EpCAM抗体包被在圆形微柱上。CTC被小间隙捕获,大间隙用于加速流速。错过的CTC必须通过下一个阵列中的小间隙,并被集成在芯片16内的基于亲和力的隔离捕获。
该协议的目标是证明稀有数量的肿瘤细胞的计数以及使用微流控芯片对CTC的临床分析。该协议描述了CTC分离步骤,如何获得少量肿瘤细胞,小椭圆过滤器,大椭圆过滤器和梯形过滤器的临床物理分离,亲和力修饰和富集17。
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Protocol
患者血液样本由上海医科大学附属龙华医院提供,该方案遵循北京大学第三医院人类研究伦理委员会的指导方针。获得患者的知情同意,将样本用于研究目的。
1. 预实验以检查培养的肿瘤细胞的捕获效率
- 培养肿瘤细胞MCF-7,MDA-MB-231和HeLa以确定捕获效率。稀释肿瘤细胞悬液,计数肿瘤细胞数,重复直至获得1mL PBS中所需数量的细胞。
- 在起始细胞数为 ~ 1 x 10 的细胞培养瓶中培养细胞,在 1 mL 补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中培养细胞。在37°C的加湿气氛中用5%CO2气氛孵育。
- 当细胞系作为贴壁单层生长至95%汇合时,如Chen等人16中所述,用0.25%胰蛋白酶溶液将它们从培养皿中分离2分钟。
- 用钙黄绿素AM染色肿瘤细胞。将3μL钙黄绿素AM放入培养皿中,并将培养皿在培养箱中保持30分钟。然后,用胰蛋白酶消化所有细胞。
- 用细胞计数室计数PBS中培养的肿瘤细胞,并稀释至每1mL PBS获得100个肿瘤细胞。
注意:为了精确枚举细胞数量,取50μL获得的细胞悬液,用显微镜观察其中的肿瘤细胞数量是否为5个。根据50μL细胞悬液中肿瘤细胞的实际数量,确定获得100个肿瘤细胞所需的细胞悬液体积。
- 使用带有注射泵的注射器以 0.5 mL/h、1 mL/h、2 mL/h、3 mL/h、4 mL/h 和 5 mL/h 的不同流速将每 1 mL PBS 含有 100 个肿瘤细胞的细胞悬液引入微流控芯片。获得各种流速的捕获效率,并确定最佳流速。
- 计算芯片上捕获并从出口流出的肿瘤细胞的数量。捕获效率计算如下:
捕获效率 = 捕获的细胞数/(捕获的细胞数 + 流出的细胞数) × 100% - 重复以获得从10到100(10,20,30,40,50,60,70,80,90,100)的不同数量的肿瘤细胞的捕获效率。
- 计算芯片上捕获并从出口流出的肿瘤细胞的数量。捕获效率计算如下:
- 测试和验证微流控芯片的稀有数量肿瘤细胞。使用由微量移液器拉拔器制成的空心针将这 10 种样品悬浮液注入微流控芯片中,以吸出在 1 mL PBS 中稀释的 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 个肿瘤细胞。检测并枚举每个样品在芯片上捕获后的肿瘤细胞数量。
注意:空心针长约3厘米,外径1毫米。 - 对加标到正常血液样本中的肿瘤细胞进行临床实验前测试。
- 用钙黄绿素AM染色肿瘤细胞,然后在5μLPBS中枚举100个肿瘤细胞。将这些细胞加标到 1 mL 的全正常血液样本中。将这些细胞引入芯片中,并用绿色免疫荧光枚举芯片上捕获的肿瘤细胞数量。如上所述在芯片上进行 体内 计数,并计算捕获后的捕获效率。
- 对从10到90(10,20,30,40,50,60,70,80,90)的九种其他浓度的肿瘤细胞数重复步骤1.4.1。
- 如步骤1.3所述枚举1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个肿瘤细胞而不染色,加标到1mL全正常血液中,将这些样品引入微流控芯片中,并捕获芯片上的肿瘤细胞。
- 用Hoechst,CK-FITC和CD45-PE在芯片上染色。将 3-5 μL 荧光染料放入 20-30 μL PBS 中,然后用注射器将该溶液引入微流控芯片上。用蓝色和绿色免疫荧光枚举芯片上捕获的肿瘤细胞数量,以确定捕获效率。
- 对微流控芯片进行修改,以基于亲和力捕获抗EpCAM。
注意:由于波形芯片结合了基于亲和力和基于物理属性的隔离,因此请使用代理修改芯片。- 用 100 μL 4% (v/v) 3-巯基丙基三甲氧基硅烷在室温下在乙醇中修饰芯片表面 45 分钟。小心而缓慢地将此溶液引入芯片中,以防它破坏芯片的内部结构,尤其是顶面和基板玻璃的粘合。
注意:芯片表面使用巯基硅烷进行改性。芯片上发生的相互作用由化学键决定。建立化学键以实现抗体与抗原修饰的键合。芯片内部对各种试剂进行修饰,以建立相互连接的化学键。最后要修饰的试剂是抗上皮粘附分子(抗EpCAM)。EpCAM的肿瘤细胞表面抗原与芯片内部的抗EpCAM结合,实现CTC的捕获。 - 用乙醇洗涤3倍。在芯片上加入 100 μL 偶联剂 N-y-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯 (GMBS, 1 μM),并使其相互作用 30 分钟。
- 用PBS清洗3倍。使用注射器将 1 mL PBS 引入芯片进行清洗。
- 在室温下用 30-40 μL 10 μg/mL 中性粒蛋白处理芯片 30 分钟,导致细胞固定在 GMBS 上,然后用 PBS 冲洗以去除多余的亲和素。
- 用 3 μL 浓度为 10 μg/mL 的抗生物素化 EpCAM 抗体在 100 μL PBS 和 1% (w/v) BSA 中修改芯片。保持这个过夜。
- 用 100 μL 4% (v/v) 3-巯基丙基三甲氧基硅烷在室温下在乙醇中修饰芯片表面 45 分钟。小心而缓慢地将此溶液引入芯片中,以防它破坏芯片的内部结构,尤其是顶面和基板玻璃的粘合。
2. 芯片上计数循环肿瘤细胞(CTC)的临床实验
- 使用红细胞裂解 (RBCL) 溶液预处理临床癌症患者血液样本,或使用注射器将 2-3 mL 血液样本直接引入微流控芯片上。
- 执行预处理,大约需要 30 分钟。在抗凝管中收集全血样本。将 6-9 mL RBS 裂解液加入 2-3 mL 血液中。在室温下以111× g 离心5-8分钟,并丢弃上层红色透明液体。
- 捕获、染色、识别和枚举芯片上的细胞,如下所述。
- 按照步骤1中所述捕获芯片上的细胞,对使用Hoechst,CK-FITC和CD45-PE捕获的CTC的芯片进行染色。CK-FITC是肿瘤细胞的特异性染色剂,CD45-PE是针对白细胞的。
- 将 3 μL CK-FITC 加入 20 μL PBS 中。将其引入注射器,并将稀释的CK-FITC泵送到芯片上。静置30分钟。将 300 μL PBS 引入芯片以清洗芯片。
- 将 3 μL CD45-PE 加入 20 μL PBS 中。将其引入注射器,并将稀释的CD45-PE泵送到芯片上。静置30分钟。将 300 μL PBS 引入芯片以清洗芯片。
- 用倒置荧光显微镜以20倍或40倍放大倍率识别CTC。CTC发出蓝色和绿色荧光,白细胞(WBC)发出蓝色和红色荧光。识别具有蓝色和绿色荧光的CTC以及具有蓝色和红色荧光的WBC。
- 从免疫荧光图像中,枚举芯片上捕获的CTC数量。将CTC枚举为Hoechst+/CK-FITC+/CD45−,将WBC枚举为Hoechst+/CK-FITC−/CD45+。
- 通过与注射器相反方向用PBS冲洗到微流控芯片上来富集捕获的CTC,以从入口收集芯片上捕获的CTC。使用含有1mL PBS的注射器,从出口引入以在2-3分钟内富集芯片上捕获的CTC,并从入口收集它们。每个洗涤步骤使用 1 mL PBS,重复 3 次。
- 如下所述对微流控芯片上捕获的肿瘤细胞或CTC进行染色。
- 使用钙黄绿素AM染色。将 5 μL 钙黄绿素 AM 加入 20 μL PBS 中,将细胞染色 30 分钟,然后在室温下以 111 x g 离心 2 分钟以获得肿瘤细胞,并悬浮在 1 mL PBS 中。
- 要鉴定细胞核,以大椭圆微滤片的最佳流速和梯形微滤片的最佳流速向芯片中加入 20 μL DAPI 溶液(10 μL DAPI 试剂在 20 μL PBS 中)。通过 20 μL 抗细胞角蛋白储备溶液(20 μL PBS 中的 3 μL 抗细胞角蛋白抗体)与芯片反应 30 分钟。
- 对芯片上捕获的白细胞进行染色。在芯片上捕获CTC后,向芯片中加入25μL抗CD45抗体溶液(20μL PBS中的5μL抗CD45溶液),并染色30分钟。用PBS洗涤,并用蓝色和绿色荧光鉴定上皮细胞。
- 使用荧光显微镜进行免疫荧光鉴定,如下所述。
- 使用荧光显微镜并用蓝色激光激发样品。找到发出蓝色荧光的细胞,它们是有核细胞。使用以下放大倍率之一:10x、20x 或 40x。为肿瘤细胞找到一个清晰的区域。对于蓝色激光源,请使用420-485nm的激发板波长和515nm的发射板波长。
- 在不移动样品的情况下,使用另一个激光源。旋转荧光显微镜并用绿色激光激发样品。找到发出绿色荧光的细胞,这表明肿瘤细胞。使用此绿色激光源以相同的放大倍率拍摄同一视场的图像。同时发出蓝色和绿色荧光的细胞被认为是肿瘤细胞。对于绿色激光源,请使用460-550nm的激发板波长和590nm的发射板波长
- 在不移动样品的情况下,使用另一个激光源。旋转荧光显微镜并用红色激光激发样品。找到发出红色荧光的细胞。使用此红色激光源以相同的放大倍率拍摄同一视场的图像。同时发出蓝色和红色荧光的细胞被识别为白细胞。
- 保存图像,以便使用上面的每个激光源获得。用不同颜色的灯光拍摄同一场的几张图像。
- 使用激发板波长为330-400nm,发射板波长为425nm的紫外光。使用激发板波长为395-415nm,发射板波长为455nm的紫色光。
- 如步骤1.2.1所示计算捕获效率。
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Representative Results
整个设置包括注射泵、注射器和微流体芯片。注射器中的细胞悬液连接到注射泵,并将细胞悬液引入微流控芯片以捕获细胞。所有使用的微流控芯片的捕获效率约为90%或更高。对于波浪芯片,我们设计了具有不同间隙的微结构。小间隙用于捕获CTC,大间隙用于加速流速。细胞悬液在大间隙区域快速流动。错过的CTC往往被后续阵列16中的小间隙捕获。对于椭圆芯片,我们设计了线-线间隙而不是点-点间隙,以形成一个细长的隧道,以增强捕获。因此,实现了高捕获效率1。我们设计了一个椭圆结构,以避免边缘和角落,以保持生存能力。梯形过滤器有两个圆形螺旋通道,带有嵌入式梯形和圆形微柱屏障。梯形滤波器的捕获效率分别为94%、95%和93%。
图1 显示,所有的肿瘤细胞都被波芯片捕获。由于所有肿瘤细胞都集中在波微柱阵列周围,这表明该微流控芯片的捕获效率很高,如捕获的肿瘤细胞数量所示。因此,这种设置使得捕获稀有肿瘤细胞变得更加容易;事实上,该芯片的制造是为了捕获大量肿瘤细胞以及稀有数量的肿瘤细胞。例如,如果芯片是固体或可重复的,足以捕获10,000个肿瘤细胞,则芯片很容易捕获10-100个细胞。 视频1 显示了如何在实验前获得稀有数量的肿瘤细胞。使用微量移液器拉拔器制成的空心针从培养皿中吸出1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个肿瘤细胞,培养皿中用钙黄绿素AM染色的稀释肿瘤细胞在PBS中。细胞被与空心针连接的硅胶管吸收。将具有绿色免疫荧光的肿瘤细胞吸入空心针中。吹入空心管导致空心针内的肿瘤细胞被排放到微量离心管1中。这是获得稀有肿瘤细胞的程序。 图2 显示了使用小椭圆微滤片捕获的胃癌患者的CTC。 图3 显示了使用梯形微滤光片捕获的结直肠癌患者的CTC,并发出蓝色和绿色荧光。 图4 显示了捕获后在芯片上生长的肿瘤细胞,这些肿瘤细胞准备用抗癌药物治疗。这些发现表明,大椭圆微滤子对细胞活力没有任何负面影响。
图5 显示了在微流控芯片上捕获的结直肠CTC的临床免疫荧光分析。这些在明场中可见,并用Hoechst,CK-FITC和CD45-PE染色。CTC被识别为DAPI+/CK+/CD45−,白细胞被识别为DAPI+/CK−/CD45+。 图6 显示了捕获后在大椭圆芯片上培养的结直肠肿瘤细胞。 图7 显示了在大椭圆微滤片上捕获的结直肠肿瘤细胞。临床上,患者血液中的CTC被波片、梯形微滤片和大椭圆微滤片捕获,表明这三种芯片成功捕获了CTC。
图 1:波形芯片捕获。 MCF-7的所有肿瘤细胞都被捕获在波芯片阵列周围,没有任何细胞丢失。由于除阵列外,任何其他区域都没有任何肿瘤细胞,这表明芯片的高捕获效率。捕获大量肿瘤细胞。因此,罕见的肿瘤细胞也很容易被捕获。MCF-7的肿瘤细胞被波片捕获,(A)用Hoechst染色,(B)用钙黄绿素AM染色。比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 2:小椭圆微滤片捕获的 CTC 临床样本。 由小椭圆微滤片捕获的胃癌患者的临床CTC。在明场和蓝色和绿色荧光中鉴定CTC。(A)中的蓝色圆圈表示芯片内捕获的胃癌患者的CTC。从拍摄的图像可以看出,在任何其他区域都没有其他电池,这表明该芯片的捕获纯度很高。MCF-7的肿瘤细胞被小椭圆微滤片捕获,并在(A)明场中观察到,(B)用Hoechst染色,(C)用CK-FITC染色。比例尺:20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3:梯形微滤片捕获的CTC的临床样本。 来自结直肠癌患者的临床CTC被梯形微滤片捕获。在这些图像中,可以看出捕获了六个CTC,表明在小视场中捕获效率较高。此外,没有出现其他电池,表明该芯片的捕获纯度非常高。MCF-7的肿瘤细胞被梯形微滤子捕获,并在(A)明场中观察到,(B)用Hoechst染色,(C)用CK-FITC染色。比例尺: 20 μm 请点击此处查看此图的大图。
图4:大椭圆微滤子捕获的CTC培养物。 MCF-7的肿瘤细胞被大椭圆微柱阵列前的大椭圆微过滤器捕获。没有肿瘤细胞通过阵列,表明该芯片的捕获效率很高。捕获后,肿瘤细胞生长24-48小时。这表明大椭圆微滤片的捕获效率和活性都非常高。用大椭圆微滤子捕获MCF-7培养的肿瘤细胞,并在捕获后(A)0 h,(B)捕获后24 h和(C)捕获后48 h观察。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:用于梯形微滤片捕获 CTC 的临床样品示例。 来自结直肠癌患者的临床CTC被梯形微滤片捕获。在这些图像中,可以看到捕获了两个CTC,表明捕获效率高。除了芯片中红细胞的残余外,没有其他细胞干扰。因此,对于CTC捕获的临床预处理,最好不要使用红细胞裂解。结直肠癌的CTC被梯形微滤光片捕获,并在(A)明场中观察到,(B)用Hoechst染色,(C)用CK-FITC染色,(D)在合并图像中看到。比例尺:20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 6:由大椭圆芯片捕获的培养 CTC 示例。 MCF-7细胞的肿瘤细胞培养物在大椭圆微柱阵列前面和大椭圆微滤子后面。用钙黄绿素AM染色的肿瘤细胞发出绿色荧光,如预期生长,表明该芯片的细胞活力非常高。总共有 15 个阵列,每个阵列都有不同的间隙,由大椭圆微柱组织。MCF-7肿瘤细胞在一个阵列中捕获(A)后在大椭圆芯片上培养,在另一个阵列中捕获(B)。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 7:用于大椭圆微滤片捕获 CTC 的临床样品示例。 来自结直肠癌患者的临床CTC被大椭圆微滤片捕获。从图像中可以看出,有红细胞污染。这表明必须稀释整个患者血液样本,并且在捕获后需要冲洗芯片。临床结直肠癌患者血液样本的CTC在大椭圆芯片上捕获,并在(A)明场中观察到,(B)用Hoechst染色,(C)用CK-FITC染色。比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
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Discussion
癌症的预后和早期诊断对癌症治疗有显著影响1.使用微流控芯片进行CTC分离可提供无侵入的液体活检。然而,CTC在血液中极为罕见且异质性1,这使得分离CTC具有挑战性。因此,CTC在癌症转移中起着至关重要的作用1。
所提出的协议允许使用微流控芯片对CTC分离进行完整分析。该协议包括与CTC隔离相关的所有关键程序。例如,该协议包括RBCL分析,其仔细记录并组织成不同的包,罕见肿瘤细胞采集,最佳流速测定,捕获效率,临床表征和计数。对手术的精心管理有助于临床患者样本处理。该方案允许对临床患者样本进行预处理和处理,并为临床医生提供重要服务。
对于CTC分离,罕见肿瘤细胞的预处理极其困难。通过使用通过拔针器的空心针根据需要吸吮1,2,3,4,5,6,7,8,9和10个肿瘤细胞来解决这一困难。然后,制备接近真实的临床患者血液样本,将所需数量的肿瘤细胞混合到正常血液中,模拟患者血液样本。用这些人工患者血液样本,进行了接近真实的实验。该方法解决了在实验前CTC分离中通常遇到的难题。这种方法不容易实施,从未在其他地方报道过;然而,在进行真正的临床实验之前,这是一种有用的方法。
使用微流控芯片的CTC分离分为三种类型:基于亲和力,基于物理和基于免疫磁性。对于基于亲和力的分离,需要修改微流控芯片。具体的修改程序已被包括在内,用于使用抗EpCAM进行修改。通过用Hoechst,CK-FITC和CD45-PE进行免疫荧光染色来鉴定CTC。由于许多肿瘤细胞表达EpCAM,抗EpCAM是捕获患者血液中CTC的重要抗体。然而,抗EpCAM非常昂贵;因此,已经开发出许多适配体来解决这个问题。我们主要利用基于物理的微流控芯片,如小椭圆微过滤器和梯形微过滤器来捕获CTC,因为它们简单,易于操作且有效。
与其他技术相比,该技术的优势在于基于物理的大椭圆微滤波器芯片以高捕获效率牢固地捕获CTC。原因是有细长的线线间隙隧道。波浪芯片通过结合基于物理性质和基于亲和力的分离来捕获CTC。CTC被小间隙捕获,大间隙可用于加速流速。遗漏的CTC必须通过以下阵列中的小间隙,并且还被基于亲和力的隔离捕获。
该方案解决了CTC分离中的几个主要问题,特别是对于临床实验。然而,不可能包括CTC分离中的每个详细步骤,例如关于纳米颗粒和纳米结构的作用以及适配体修饰。这些方面在CTC隔离中也起着至关重要的作用。但是,它们在解决诸如提高捕获效率等问题时并不重要。相反,这些方面用新的内容丰富了CTC隔离。
这项工作集中在使用设计的微流控芯片对CTC的临床分离。使用的大多数微流控芯片主要是基于物理的,例如大椭圆滤波器和小椭圆滤波器。波浪芯片是通过结合基于亲和力和基于物理的芯片特性制成的1.大椭圆滤光片的微柱设计得更短,以提高本工作捕获的纯度。小椭圆滤波器也可以通过为不同的阵列设计具有不同微柱尺寸来改进。波浪芯片可以通过添加更多阵列来增强捕获来更好地设计。
大椭圆过滤器与长椭圆微柱一起组织,形成线-线隧道,实现高捕获效率。然而,这种捕获的局限性在于捕获纯度不够高或不易获得高捕获纯度。对于波浪芯片,使用小间隙捕获CTC,错过的CTC由以下阵列捕获。大间隙用于加速流速并消除红细胞的干扰,从而提高捕获纯度;然而,捕获效率稳定在90%以上,并且是可重复的。
使用微流控芯片进行CTC分离的临床验证具有重要意义。这项工作介绍了用大椭圆过滤器、小椭圆过滤器和波芯片从结直肠患者中分离CTCs。设计的微流控芯片的目的是临床上枚举CTC。对于其他一些系统或平台的现有方法,捕获效率低,或者捕获效率不够高,无法有效地用于临床应用。
基于这三种具有高捕获效率的微流控芯片的临床性能,它们有可能应用于CTC产品中,特别是经过修饰后。我们协议的优势在于它展示了稀有数量的肿瘤细胞的计数以模拟真实的临床样本。此外,临床实验程序是可行和实用的。这种方法可以从整个患者血液中分离CTC。因此,该方法适用于临床应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究工作得到了安徽省自然科学基金(1908085MF197,1908085QB66)、国家自然科学基金(21904003)、天津市教委科研项目(2018KJ154)、安徽省高校省级自然科学研究计划(KJ2020A0239)、上海市多维信息处理重点实验室、华东地区多维信息重点实验室的支持华东师范大学加工学(MIP20221)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
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