Summary
Der klinische Mikrofluidik-Chip ist eine wichtige biomedizinische Analysetechnik, die die Vorverarbeitung klinischer Patientenblutproben vereinfacht und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in situ auf dem Chip immunfluoreszent färbt, was den schnellen Nachweis und die Identifizierung eines einzelnen CTC ermöglicht.
Abstract
Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind für die Krebsprognose, -diagnose und -therapie von Bedeutung. Die CTC-Zählung ist für die Bestimmung der Patientenerkrankung von entscheidender Bedeutung, da CTCs selten und heterogen sind. CTCs lösen sich vom Primärtumor, gelangen in den Blutkreislauf und wachsen möglicherweise an entfernten Stellen, wodurch der Tumor metastasiert wird. Da CTCs ähnliche Informationen wie der Primärtumor enthalten, kann die CTC-Isolierung und die anschließende Charakterisierung bei der Überwachung und Diagnose von Krebs von entscheidender Bedeutung sein. Die Enumeration, Affinitätsmodifikation und klinische Immunfluoreszenzfärbung seltener CTCs sind leistungsfähige Methoden für die CTC-Isolierung, da sie die notwendigen Elemente mit hoher Sensitivität liefern. Mikrofluidische Chips bieten eine Flüssigbiopsiemethode, die für die Patienten schmerzfrei ist. In dieser Arbeit stellen wir eine Liste von Protokollen für klinische mikrofluidische Chips vor, eine vielseitige CTC-Isolierungsplattform, die eine Reihe von Funktionalitäten und Diensten enthält, die für die CTC-Trennung, -Analyse und -Frühdiagnose erforderlich sind, und so die biomolekulare Analyse und Krebsbehandlung erleichtern. Das Programm umfasst die Zählung seltener Tumorzellen, die klinische Vorverarbeitung des Patientenblutes, einschließlich der Lyse roter Blutkörperchen, sowie die Isolierung und Erkennung von CTCs in situ auf mikrofluidischen Chips. Das Programm ermöglicht die präzise Zählung von Tumorzellen oder CTCs. Darüber hinaus enthält das Programm ein Tool, das die CTC-Isolierung mit vielseitigen mikrofluidischen Chips und die Immunfluoreszenzidentifikation in situ auf den Chips umfasst, gefolgt von einer biomolekularen Analyse.
Introduction
Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind für die Krebsprognose, -diagnose und -therapie von Bedeutung. Die CTC-Zählung ist von entscheidender Bedeutung, da CTCs selten und heterogen sind. Die Enumeration, Affinitätsmodifikation und klinische Immunfluoreszenzfärbung seltener CTCs sind leistungsfähige Techniken für die CTC-Isolierung, da sie die notwendigen Elemente mit hoher Sensitivität bieten1. Die seltene Anzahl von Tumorzellen, die mit normalem Blut vermischt sind, ahmt echtes Patientenblut sehr gut nach, da 2-3 ml echtes Patientenblut nur 1-10 CTCs enthalten. Um ein kritisches experimentelles Problem zu lösen, anstatt eine große Anzahl von Tumorzellen zu verwenden, die in PBS eingeführt oder mit normalem Blut vermischt wurden, liefert uns die Verwendung einer seltenen Anzahl von Tumorzellen eine geringe Anzahl von Blutzellen, was bei der Durchführung eines Experiments näher an der Realität ist.
Krebs ist die häufigste Todesursache weltweit2. CTCs sind Tumorzellen, die vom ursprünglichen Tumor abgestoßen werden und im Blut- und Lymphkreislauf zirkulieren3. Wenn sich CTCs in eine neue überlebensfähige Umgebung bewegen, wachsen sie wie ein zweiter Tumor. Dies wird als Metastasierung bezeichnet und ist für 90 % der Todesfälle bei Krebspatienten verantwortlich4. CTCs sind entscheidend für die Prognose, die Frühdiagnose und das Verständnis der Mechanismen von Krebs. CTCs sind jedoch extrem selten und heterogenim Blut der Patienten 5,6.
Mikrofluidische Chips bieten eine flüssige Biopsie, die nicht in den Tumor eindringt. Sie haben den Vorteil, dass sie tragbar und kostengünstig sind und über eine auf die Zellen abgestimmte Waage verfügen. Die Isolierung von CTCs mit mikrofluidischen Chips wird hauptsächlich in zwei Arten eingeteilt: affinitätsbasiert, die auf der Antigen-Antikörper-Bindung beruht 7,8,9 und die ursprüngliche und am weitesten verbreitete Methode der CTC-Isolierung ist; und physikalische Chips, die Größen- und Verformbarkeitsunterschiede zwischen Tumorzellen und Blutzellen 10,11,12,13,14,15 nutzen, sind markierungsfrei und einfach zu bedienen. Der Vorteil von Mikrofluidik-Chips gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der physikalisch basierte Ansatz von Mikrofiltern mit großen Ellipsen CTCs mit hoher Abscheideeffizienz fest einfängt. Der Grund dafür ist, dass Ellipsen-Mikropfosten in schmalen Tunneln mit Linien-Linien-Lücken organisiert sind. Die Linien-Linien-Lücken unterscheiden sich von den herkömmlichen Punkt-Punkt-Lücken, die von Mikropfosten wie Rauten-Mikropfosten gebildet werden. Die Wellenchip-basierte Erfassung von CTCs kombiniert sowohl eine auf physikalischen Eigenschaften basierende als auch eine affinitätsbasierte Isolierung. Der Wellenchip-basierte Einfang umfasst 30 wellenförmige Arrays, bei denen der Antikörper von Anti-EpCAM auf kreisförmigen Mikropfosten beschichtet ist. Die CTCs werden von den kleinen Lücken erfasst, und die großen Lücken werden genutzt, um die Durchflussrate zu beschleunigen. Die verpassten CTCs müssen die kleinen Lücken im nächsten Array passieren und werden von der affinitätsbasierten Isolierung erfasst, die in den Chip16 integriert ist.
Ziel des Protokolls ist es, die Zählung seltener Tumorzellen und die klinische Analyse von CTCs mit mikrofluidischen Chips zu demonstrieren. Das Protokoll beschreibt die CTC-Isolierungsschritte, die Gewinnung einer geringen Anzahl von Tumorzellen, die klinisch-physikalische Trennung von Small-Ellipse-Filtern, Big-Ellipse-Filtern und Trapezfiltern, die Affinitätsmodifikation und die Anreicherung17.
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Protocol
Die Blutproben der Patienten wurden vom Longhua Hospital geliefert, das der Shanghai Medical University angegliedert ist.Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung des Dritten Krankenhauses der Universität Peking. Die Patienten erhielten eine Einverständniserklärung für die Verwendung der Proben zu Forschungszwecken.
1. Pre-Experiment zur Überprüfung der Einfangeffizienz mit kultivierten Tumorzellen
- Kultivierung der Tumorzellen MCF-7, MDA-MB-231 und HeLa zur Bestimmung der Einfangeffizienz. Verdünnen Sie die Tumorzellsuspension, zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Zellen in 1 ml PBS erreicht ist.
- Kultivieren Sie die Zellen in einem Zellkulturkolben mit einer Ausgangszellzahl von ~ 1 x 105 Zellen in 1 ml modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C mit einer 5%igen CO2 - Atmosphäre.
- Wenn die Zelllinien als adhärente Monoschichten zu 95 % Konfluenz wachsen, lösen Sie sie 2 Minuten lang mit 0,25%iger Trypsinlösung von den Kulturschalen, wie in Chen et al.16 beschrieben.
- Färben Sie die Tumorzellen mit Calcein AM. Geben Sie 3 μl Calcein AM in die Kulturschale und lassen Sie die Schale 30 Minuten lang im Inkubator. Dann verdauen Sie alle Zellen mit Trypsin.
- Zählen Sie die kultivierten Tumorzellen in PBS mit einer Zellzählkammer und verdünnen Sie, bis 100 Tumorzellen pro 1 ml PBS erhalten werden.
HINWEIS: Um die Zellzahl genau zu zählen, nehmen Sie 50 μl der erhaltenen Zellsuspension, um mit einem Mikroskop zu sehen, ob die Anzahl der Tumorzellen darin fünf beträgt oder nicht. Bestimmen Sie das Volumen der Zellsuspension, das eingenommen werden muss, um 100 Tumorzellen zu erhalten, entsprechend der tatsächlichen Anzahl von Tumorzellen in 50 μl Zellsuspension.
- Die Zellsuspension mit 100 Tumorzellen pro 1 ml PBS wird mit einer Spritze mit einer Spritzenpumpe mit unterschiedlichen Flussraten von 0,5 ml/h, 1 ml/h, 2 ml/h, 3 ml/h, 4 ml/h und 5 ml/h in den mikrofluidischen Chip eingeführt. Ermitteln Sie die Abscheideeffizienz für die verschiedenen Durchflussraten und bestimmen Sie die optimale Durchflussrate.
- Zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen, die auf dem Chip erfasst wurden und aus dem Auslass herausfließen. Berechnen Sie die Erfassungseffizienz wie folgt:
Erfassungseffizienz = Anzahl der erfassten Zellen/(Anzahl der erfassten Zellen + Anzahl der ausfließenden Zellen) × 100 % - Wiederholen Sie den Vorgang, um die Einfangeffizienz für eine unterschiedliche Anzahl von Tumorzellen von 10 bis 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100) zu erhalten.
- Zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen, die auf dem Chip erfasst wurden und aus dem Auslass herausfließen. Berechnen Sie die Erfassungseffizienz wie folgt:
- Testen und validieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf eine seltene Anzahl von Tumorzellen. Injizieren Sie diese 10 Probensuspensionen in die Mikrofluidik-Chips mit einer Hohlnadel mit einem Mikropipettenzieher, um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tumorzellen zu aspirieren, die in 1 ml PBS verdünnt sind. Erkennen und zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen für jede Probe nach ihrer Erfassung auf dem Chip.
HINWEIS: Die Hohlnadel ist ca. 3 cm lang und hat einen Außendurchmesser von 1 mm. - Führen Sie klinische Tests vor dem Experiment auf Tumorzellen durch, die in normale Blutproben gestochen wurden.
- Färben Sie die Tumorzellen mit Calcein AM und zählen Sie dann 100 Tumorzellen in 5 μl PBS. Spicken Sie diese Zellen in 1 ml vollwertige Blutproben. Führen Sie diese Zellen in den Chip ein und zählen Sie die Anzahl der auf dem Chip erfassten Tumorzellen mit grüner Immunfluoreszenz. Führen Sie eine In-vivo-Enumeration auf dem Chip durch, wie oben beschrieben, und berechnen Sie die Abscheideeffizienz nach der Abscheidung.
- Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 für neun weitere Konzentrationen der Tumorzellzahl von 10 bis 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- Zählen Sie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tumorzellen wie in Schritt 1.3 beschrieben ohne Färbung auf, stechen Sie in 1 ml normales Vollblut, führen Sie diese Proben in den mikrofluidischen Chip ein und fangen Sie die Tumorzellen auf dem Chip ein.
- Färbung auf dem Chip mit Hoechst, CK-FITC und CD45-PE. Geben Sie 3-5 μl Fluoreszenzfarbstoff in 20-30 μl PBS und geben Sie diese Lösung dann mit einer Spritze auf den Mikrofluidik-Chip. Zählen Sie die Anzahl der auf dem Chip eingefangenen Tumorzellen mit blauer und grüner Immunfluoreszenz, um die Einfangeffizienz zu bestimmen.
- Modifikation des Mikrofluidik-Chips für die affinitätsbasierte Erfassung von Anti-EpCAM.
HINWEIS: Da der Wave-Chip sowohl affinitätsbasierte als auch auf physikalischen Eigenschaften basierende Isolierung kombiniert, modifizieren Sie den Chip mit Agenten.- Die Oberfläche des Chips wird mit 100 μl 4% (v/v) 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan in Ethanol bei Raumtemperatur für 45 Minuten modifiziert. Führen Sie diese Lösung vorsichtig und langsam in den Chip ein, falls sie die innere Struktur des Chips zerstört, insbesondere die Verklebung der Oberfläche und des Substratglases.
HINWEIS: Die Chipoberfläche wird mit Mercaptosilan modifiziert. Die Wechselwirkungen, die auf dem Chip auftreten, werden durch chemische Bindungen bestimmt. Chemische Bindungen werden hergestellt, um die Bindung des mit dem Antigen modifizierten Antikörpers zu realisieren. Im Inneren des Chips werden verschiedene Reagenzien modifiziert, um chemische Bindungen herzustellen, die sich miteinander verbinden. Das letzte Reagenz, das modifiziert wird, ist ein antiepitheliales Adhäsionsmolekül (anti-EpCAM). Das Tumorzelloberflächenantigen von EpCAM wird mit Anti-EpCAM im Chip kombiniert, um den Einfang der CTCs zu realisieren. - 3x mit Ethanol waschen. Geben Sie 100 μl des Haftvermittlers N-y-Maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS, 1 μM) auf den Chip und lassen Sie ihn 30 Minuten lang interagieren.
- 3x mit PBS waschen. Verwenden Sie eine Spritze, um 1 ml PBS zum Waschen auf den Chip zu geben.
- Behandeln Sie den Chip mit 30-40 μl 10 μg/ml Neutravidin bei Raumtemperatur für 30 Minuten, was zu einer Immobilisierung der Zellen auf dem GMBS führt, und spülen Sie dann mit PBS, um überschüssiges Avidin zu entfernen.
- Modifizieren Sie den Chip mit 3 μl antibiotinyliertem EpCAM-Antikörper in einer Konzentration von 10 μg/ml in 100 μl PBS mit 1 % (w/v) BSA. Bewahren Sie dies über Nacht auf.
- Die Oberfläche des Chips wird mit 100 μl 4% (v/v) 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan in Ethanol bei Raumtemperatur für 45 Minuten modifiziert. Führen Sie diese Lösung vorsichtig und langsam in den Chip ein, falls sie die innere Struktur des Chips zerstört, insbesondere die Verklebung der Oberfläche und des Substratglases.
2. Klinisches Experiment auf dem Chip zur Zählung der zirkulierenden Tumorzellen (CTCs)
- Verarbeiten Sie Blutproben von klinischen Krebspatienten mit einer RBCL-Lösung (Rote Blutkörperchenlyse) vor oder geben Sie 2-3 ml der Blutprobe mit einer Spritze direkt auf den Mikrofluidik-Chip.
- Führen Sie eine Vorverarbeitung durch, die etwa 30 Minuten dauert. Entnehmen Sie Vollblutproben in gerinnungshemmenden Röhrchen. 6-9 ml RBS-Lyselösung in 2-3 ml Blut geben. Bei 111 x g 5-8 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und die obere Schicht der roten klaren Flüssigkeit entsorgen.
- Erfassen, färben, erkennen und zählen Sie die Zellen auf dem Chip wie unten beschrieben.
- Fangen Sie die Zellen auf dem Chip ein, wie in Schritt 1 beschrieben.Färben Sie den Chip für die CTCs, die mit Hoechst, CK-FITC und CD45-PE erfasst wurden. CK-FITC ist ein spezifischer Farbstoff für Tumorzellen und CD45-PE für weiße Blutkörperchen.
- Fügen Sie 3 μl CK-FITC zu 20 μl PBS hinzu. Führen Sie diese in die Spritze ein und pumpen Sie das verdünnte CK-FITC auf den Chip. 30 Min. einwirken lassen. Geben Sie 300 μl PBS auf den Chip, um den Chip zu waschen.
- Geben Sie 3 μl CD45-PE zu 20 μl PBS. Führen Sie diese in die Spritze ein und pumpen Sie das verdünnte CD45-PE auf den Chip. 30 Min. ziehen lassen. Geben Sie 300 μl PBS auf den Chip, um den Chip zu waschen.
- Identifizieren Sie die CTCs mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit 20- oder 40-facher Vergrößerung. CTCs emittieren sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz, und weiße Blutkörperchen (Leukozyten) emittieren sowohl blaue als auch rote Fluoreszenz. Identifizieren Sie die CTCs mit blauer und grüner Fluoreszenz und die Leukozyten mit blauer und roter Fluoreszenz.
- Zählen Sie anhand der Immunfluoreszenzbilder die Anzahl der auf dem Chip erfassten CTCs auf. Zählen Sie die CTCs als Hoechst+/CK-FITC+/CD45− und die Leukozyten als Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ auf.
- Reichern Sie die eingefangenen CTCs an, indem Sie mit PBS durch die Spritze in umgekehrter Richtung auf den Mikrofluidik-Chip spülen, um die auf dem Chip erfassten CTCs aus dem Einlass zu sammeln. Verwenden Sie eine Spritze mit 1 ml PBS, führen Sie sie aus dem Auslass ein, um die auf dem Chip erfassten CTCs innerhalb von 2-3 Minuten anzureichern, und sammeln Sie sie aus dem Einlass. Verwenden Sie 1 ml PBS für jeden Waschschritt und wiederholen Sie den Vorgang 3x.
- Färben Sie die auf dem Mikrofluidik-Chip erfassten Tumorzellen oder CTCs wie unten beschrieben.
- Färben Sie mit Calcein AM. Man fügt 5 μl Calcein AM zu 20 μl PBS hinzu, färbt die Zellen 30 Minuten lang, zentrifugiert dann bei 111 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur, um Tumorzellen zu erhalten, und suspendiert in 1 ml PBS.
- Um die Zellkerne zu identifizieren, fügen Sie dem Chip 20 μl DAPI-Lösung (10 μl DAPI-Reagenz in 20 μl PBS) mit der optimalen Flussrate von 1 ml/h für Big-Ellipse-Mikrofilter und 1,5 mL/h für trapezförmige Mikrofilter hinzu. 20 μl Anti-Zytokeratin-Stammlösung (3 μl Anti-Zytokeratin-Antikörper in 20 μl PBS) durchlaufen, um 30 Minuten lang mit dem Chip zu reagieren.
- Färben Sie die auf dem Chip erfassten Leukozyten. Nachdem die CTCs auf dem Chip erfasst wurden, werden 25 μl Anti-CD45-Antikörperlösung (5 μl Anti-CD45-Lösung in 20 μl PBS) in den Chip gegeben und 30 Minuten lang gefärbt. Waschen Sie mit PBS und identifizieren Sie die Epithelzellen mit blauer und grüner Fluoreszenz.
- Führen Sie die Immunfluoreszenzidentifikation mit Fluoreszenzmikroskopie wie unten beschrieben durch.
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Probe mit dem blauen Laser an. Finden Sie die Zellen, die blaue Fluoreszenz aussenden, bei denen es sich um kernhaltige Zellen handelt. Verwenden Sie eine der folgenden Vergrößerungen: 10x, 20x oder 40x. Finden Sie ein freies Feld für die Tumorzelle. Verwenden Sie für die blaue Laserquelle eine Anregungsplattenwellenlänge von 420-485 nm und eine Wellenlänge der Emissionsplatte von 515 nm.
- Verwenden Sie eine andere Laserquelle, ohne die Proben zu bewegen. Drehen Sie das Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Probe mit dem grünen Laser an. Finden Sie die Zellen, die grüne Fluoreszenz aussenden, was auf Tumorzellen hinweist. Nehmen Sie mit dieser grünen Laserquelle Bilder des gleichen Feldes mit der gleichen Vergrößerung auf. Die Zellen, die sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz aussenden, werden als Tumorzellen erkannt. Verwenden Sie für die grüne Laserquelle eine Anregungsplattenwellenlänge von 460-550 nm und eine Wellenlänge der Emissionsplatte von 590 nm
- Verwenden Sie eine andere Laserquelle, ohne die Proben zu bewegen. Drehen Sie das Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Probe mit dem roten Laser an. Finde die Zellen, die rote Fluoreszenz aussenden. Nehmen Sie mit dieser roten Laserquelle Bilder des gleichen Feldes mit der gleichen Vergrößerung auf. Die Zellen, die sowohl blaue als auch rote Fluoreszenz aussenden, werden als weiße Blutkörperchen erkannt.
- Speichern Sie das Bild, um es mit den oben genannten Laserquellen zu erhalten. Nehmen Sie mehrere Bilder desselben Feldes mit verschiedenfarbigen Lichtern auf.
- Verwenden Sie ultraviolettes Licht mit einer Anregungsplattenwellenlänge von 330-400 nm und einer Wellenlänge der Emissionsplatte von 425 nm. Verwenden Sie violettes Licht mit einer Anregungsplattenwellenlänge von 395-415 nm und einer Wellenlänge der Emissionsplatte von 455 nm.
- Berechnen Sie die Abscheideeffizienz wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.
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Representative Results
Das gesamte Setup besteht aus einer Spritzenpumpe, einer Spritze und einem Mikrofluidik-Chip. Die Zellsuspension in der Spritze wird mit der Spritzenpumpe verbunden, und die Zellsuspension wird in den Mikrofluidik-Chip eingeführt, um die Zellen einzufangen. Die Erfassungseffizienz für alle verwendeten Mikrofluidik-Chips lag bei etwa 90 % oder mehr. Für den Wellenchip haben wir Mikrostrukturen mit unterschiedlichen Lücken entworfen. Die kleinen Lücken werden verwendet, um die CTCs zu erfassen, und die großen Lücken werden verwendet, um die Durchflussrate zu beschleunigen. Die Zellsuspension fließt schnell in den großen Spaltbereichen. Die übersehenen CTCs neigen dazu, durch die kleinen Lücken in der nachfolgenden Anordnung16 erfasst zu werden. Für Ellipsen-Chips haben wir Linien-Linien-Lücken anstelle von Punkt-Punkt-Lücken entworfen, um einen schlanken Tunnel zu bilden, um die Erfassung zu verbessern. Dadurch wurde eine hohe Abscheideeffizienz erreicht1. Wir haben eine Ellipsenstruktur entworfen, um Kanten und Ecken zu vermeiden und die Rentabilität zu erhalten. Die Trapezfilter verfügen über zwei kreisförmige Spiralkanäle mit eingebetteten Trapez- und kreisförmigen Mikropfostenbarrieren. Bei Trapezfiltern betrugen die Abscheidewirkungsgrade für MCF-7, MDA-MB-231 und HeLa 94 %, 95 % bzw. 93 %18.
Abbildung 1 zeigt, dass alle Tumorzellen vom Wellenchip eingefangen wurden. Da alle Tumorzellen um das Wellen-Micropost-Array herum konzentriert waren, deutet dies auf eine hohe Einfangeffizienz für diesen mikrofluidischen Chip hin, wie die Anzahl der eingefangenen Tumorzellen zeigt. Daher ist es mit diesem Aufbau viel einfacher, seltene Tumorzellen zu erfassen. Tatsächlich ist der Chip so hergestellt, dass er eine große Anzahl von Tumorzellen sowie eine seltene Anzahl von Tumorzellen einfängt. Wenn der Chip beispielsweise fest oder reproduzierbar genug ist, um 10.000 Tumorzellen zu erfassen, ist es für den Chip ein Leichtes, 10-100 Zellen zu erfassen. Video 1 zeigt, wie eine seltene Anzahl von Tumorzellen für das Vorexperiment gewonnen wurde. Eine Hohlnadel, die mit einem Mikropipettenzieher hergestellt wurde, wurde verwendet, um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tumorzellen aus einer Kulturschale mit verdünnten Tumorzellen zu aspirieren, die mit Calcein AM in PBS gefärbt waren. Die Zellen wurden von dem mit der Hohlnadel verbundenen Kieselgelrohr absorbiert. Eine Tumorzelle mit grüner Immunfluoreszenz wurde in die Hohlnadel gesaugt. Das Blasen in das Hohlröhrchen führte dazu, dass die Tumorzelle im Inneren der Hohlnadel in ein Mikrozentrifugenröhrchen1 entladen wurde. Dies ist das Verfahren, um seltene Tumorzellen zu gewinnen. Abbildung 2 zeigt CTCs eines Magenkrebspatienten, die mit Mikrofiltern mit kleinen Ellipsen aufgenommen wurden. Abbildung 3 zeigt die CTCs eines Darmkrebspatienten, die mit trapezförmigen Mikrofiltern aufgenommen wurden und sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz emittieren. Abbildung 4 zeigt Tumorzellen, die nach dem Einfangen auf dem Chip gezüchtet wurden und bereit sind, mit Krebsmedikamenten behandelt zu werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Mikrofilter mit großen Ellipsen keine negativen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen haben.
Abbildung 5 zeigt die klinische Immunfluoreszenzanalyse von kolorektalen CTCs, die auf dem Mikrofluidik-Chip erfasst wurden. Diese werden im Hellfeld gesehen und mit Hoechst-, CK-FITC- und CD45-PE-Färbung gefärbt. Die CTCs wurden als DAPI+/CK+/CD45− und die Leukozyten als DAPI+/CK−/CD45+ identifiziert. Abbildung 6 zeigt kolorektale Tumorzellen, die nach dem Einfangen auf dem Big-Ellipse-Chip kultiviert wurden. Abbildung 7 zeigt kolorektale Tumorzellen, die auf den Mikrofiltern mit großer Ellipse eingefangen wurden. Klinisch wurden CTCs im Blut von Patienten mit Wellenchips, trapezförmigen Mikrofiltern und Mikrofiltern mit großer Ellipse eingefangen, was darauf hindeutet, dass diese drei Chips CTCs erfolgreich einfangen können. Möglicherweise könnten sie in CTC-Produkten, wie z. B. CTC-Isolationsprodukten, mit hoher Effizienz eingesetzt werden.
Abbildung 1: Erfassung von Wellenchips. Alle Tumorzellen von MCF-7 wurden um das Array des Wellenchips herum eingefangen, ohne dass Zellen fehlten. Da sich außer dem Array in keinem anderen Bereich Tumorzellen befanden, deutet dies auf die hohe Einfangeffizienz des Chips hin. Es wurde eine große Anzahl von Tumorzellen eingefangen. Daher können auch seltene Tumorzellen leicht erfasst werden. Die Tumorzellen von MCF-7 wurden mit einem Wellenchip eingefangen und (A) mit Hoechst und (B) mit Calcein AM gefärbt. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Klinische Probe für CTCs, die von Mikrofiltern mit kleiner Ellipse erfasst wurden. Klinische CTCs eines Magenkrebspatienten, die von Mikrofiltern mit kleinen Ellipsen erfasst wurden. Die CTCs wurden im Hellfeld und mit blauer und grüner Fluoreszenz identifiziert. Der blaue Kreis in (A) zeigt eine CTC eines Magenkrebspatienten an, die im Inneren des Chips erfasst wurde. Aus den aufgenommenen Bildern ist zu erkennen, dass es keine anderen Zellen in anderen Bereichen gab, was darauf hindeutet, dass die Einfangreinheit für diesen Chip hoch war. Tumorzellen von MCF-7 wurden mit Mikrofiltern mit kleinen Ellipsen eingefangen und in (A) Hellfeld, (B) mit Hoechst gefärbt und (C) mit CK-FITC gefärbt. Maßstab: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Klinische Probe von CTCs, die von trapezförmigen Mikrofiltern erfasst wurden. Klinische CTCs eines Darmkrebspatienten wurden mit trapezförmigen Mikrofiltern erfasst. Auf diesen Bildern ist zu sehen, dass sechs CTCs eingefangen wurden, was darauf hindeutet, dass die Erfassungseffizienz in dem kleinen Feld hoch war. Darüber hinaus traten keine anderen Zellen auf, was darauf hindeutet, dass die Einfangreinheit für diesen Chip extrem hoch war. Tumorzellen von MCF-7 wurden mit trapezförmigen Mikrofiltern eingefangen und in (A) Hellfeld, (B) mit Hoechst gefärbt und (C) mit CK-FITC gefärbt. Maßstab: 20 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Kultur von CTCs, die von Mikrofiltern mit großen Ellipsen eingefangen wurden. Die Tumorzellen von MCF-7 wurden von Mikrofiltern mit großer Ellipse vor einem Mikropost-Array mit großer Ellipse eingefangen. Es passierten keine Tumorzellen das Array, was auf eine hohe Erfassungseffizienz für diesen Chip hindeutet. Nach dem Einfangen wuchsen die Tumorzellen für 24-48 h. Dies deutet darauf hin, dass sowohl die Abscheideeffizienz als auch die Viabilität für die Mikrofilter mit großen Ellipsen sehr hoch waren. Die kultivierten Tumorzellen von MCF-7 wurden von Mikrofiltern mit großer Ellipse eingefangen und bei (A) 0 h nach dem Einfang, (B) 24 h nach dem Einfang und (C) 48 h nach dem Einfang gesehen. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiel einer klinischen Probe, die für die CTC-Erfassung durch trapezförmige Mikrofilter verwendet wird. Klinische CTCs eines Darmkrebspatienten wurden mit trapezförmigen Mikrofiltern erfasst. In diesen Bildern ist zu sehen, dass zwei CTCs erfasst wurden, was auf eine hohe Erfassungseffizienz hindeutet. Es gab keine weiteren Zellstörungen außer Resten von Erythrozyten im Chip. Daher ist es für die klinische Vorverarbeitung der CTC-Erfassung besser, auf die Lyse roter Blutkörperchen zu verzichten. CTCs von kolorektalem Karzinom wurden von trapezförmigen Mikrofiltern aufgenommen und in (A) Hellfeld, (B) gefärbt mit Hoechst, (C) gefärbt mit CK-FITC und (D) in zusammengeführten Bildern gesehen. Maßstab: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Beispiel für kultivierte CTCs, die von einem Big-Ellipse-Chip eingefangen wurden. Tumorzellkulturen von MCF-7-Zellen vor dem Big-Ellipse-Micropost-Array und hinter den Big-Ellipse-Mikrofiltern. Die mit Calcein gefärbten Tumorzellen, die grüne Fluoreszenz emittieren, wuchsen wie gewünscht, was darauf hindeutet, dass die Zelllebensfähigkeit für diesen Chip sehr hoch war. Insgesamt gab es 15 Arrays, mit unterschiedlichen Lücken für jedes Array, die durch Mikropfosten mit großen Ellipsen organisiert waren. MCF-7-Tumorzellen wurden auf dem Big-Ellipse-Chip kultiviert, nachdem sie (A) in einem Array und (B) in einem anderen Array eingefangen wurden. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Beispiel einer klinischen Probe, die für die CTC-Erfassung durch Big-Ellipse-Mikrofilter verwendet wird. Klinische CTCs eines Darmkrebspatienten wurden mit Big-Ellipse-Mikrofiltern erfasst. Auf den Bildern ist zu erkennen, dass es eine Kontamination mit Erythrozyten gab. Dies bedeutet, dass die Blutprobe des ganzen Patienten verdünnt werden muss und dass der Chip nach der Entnahme gespült werden muss. CTCs von Blutproben klinischer Darmkrebspatienten wurden auf dem Big-Ellipse-Chip aufgenommen und in (A) Hellfeld, (B) mit Hoechst gefärbt und (C) mit CK-FITC gefärbt. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Prognose und Früherkennung von Krebserkrankungen haben einen signifikanten Einfluss auf die Krebsbehandlung1. Die CTC-Isolierung mit mikrofluidischen Chips ermöglicht eine Flüssigbiopsie ohne Invasion. CTCs sind jedoch extrem selten und heterogen im Blut1, was die Isolierung von CTCs erschwert. CTCs haben ähnliche Eigenschaften wie die ursprünglichen Tumorquellen, aus denen sie stammen. Somit spielen CTCs eine wichtige Rolle bei der Krebsmetastasierung1.
Das vorgeschlagene Protokoll ermöglicht eine vollständige Analyse der CTC-Isolierung mit dem Mikrofluidik-Chip. Das Protokoll enthält alle wichtigen Verfahren im Zusammenhang mit der CTC-Isolierung. Dieses Protokoll umfasst beispielsweise RBCL-Analysen, die akribisch aufgezeichnet und in verschiedene Pakete unterteilt werden, die Erfassung seltener Tumorzellen, die Bestimmung der optimalen Flussrate, die Erfassungseffizienz, die klinische Charakterisierung und die Zählung. Die sorgfältige Verwaltung der Vorgänge erleichtert die Verarbeitung klinischer Patientenproben. Das Protokoll ermöglicht die Vor- und Verarbeitung klinischer Patientenproben und bietet wichtige Dienstleistungen für Kliniker.
Für die CTC-Isolierung ist die Vorprozessierung seltener Tumorzellen äußerst schwierig durchzuführen. Diese Schwierigkeit wurde gelöst, indem eine Hohlnadel verwendet wurde, die durch einen Nadelzieher gezogen wurde, um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tumorzellen nach Belieben zu saugen. Anschließend wurde eine nahezu reale klinische Patientenblutprobe mit der gewünschten Anzahl von Tumorzellen in normales Blut gemischt, um eine Blutprobe eines Patienten nachzuahmen. Mit diesen künstlichen Patientenblutproben wurde ein realitätsnahes Experiment durchgeführt. Diese Methode hat ein schwieriges Problem gelöst, das normalerweise bei der CTC-Isolierung für Vorexperimente auftritt. Dieser Ansatz ist nicht einfach durchzuführen und wurde an anderer Stelle noch nie berichtet. Es ist jedoch ein nützlicher Ansatz, bevor ein echtes klinisches Experiment durchgeführt wird.
Die CTC-Isolierung mit mikrofluidischen Chips wird in drei Typen eingeteilt: affinitätsbasiert, physikalisch basiert und immunmagnetisch. Für die affinitätsbasierte Isolierung muss der Mikrofluidik-Chip modifiziert werden. Die spezifischen Modifikationsverfahren wurden für die Modifikation mit Anti-EpCAM aufgenommen. Die CTCs wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Hoechst, CK-FITC und CD45-PE identifiziert. Da viele Tumorzellen EpCAM exprimieren, ist Anti-EpCAM ein wichtiger Antikörper, um CTCs im Blut von Patienten einzufangen. Anti-EpCAM ist jedoch sehr teuer; Daher wurden viele Aptamere entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Wir verwenden hauptsächlich physikalisch basierte Mikrofluidik-Chips wie Mikrofilter mit kleinen Ellipsen und trapezförmige Mikrofilter, um CTCs zu erfassen, da sie einfach, leicht zu bedienen und effektiv sind.
Der Vorteil dieser Technik gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der physikalisch basierte Chip von Big-Ellipse-Mikrofiltern CTCs mit hoher Abscheideeffizienz fest einfängt. Der Grund dafür ist, dass es schmale Tunnel mit Linien-Linien-Lücken gibt. Wellenchips erfassen CTCs, indem sie sowohl eine auf physikalischen Eigenschaften basierende als auch eine affinitätsbasierte Isolierung kombinieren. Die CTCs werden von den kleinen Lücken erfasst, und die großen Lücken können zur Beschleunigung der Durchflussrate genutzt werden. Die verpassten CTCs müssen die kleinen Lücken in den folgenden Arrays passieren und werden ebenfalls von der affinitätsbasierten Isolierung erfasst.
Das Protokoll hat mehrere große Probleme bei der CTC-Isolierung gelöst, insbesondere bei klinischen Experimenten. Es ist jedoch unmöglich, jeden detaillierten Schritt in die CTC-Isolierung einzubeziehen, z. B. in Bezug auf die Rolle von Nanopartikeln und Nanostrukturen und die Aptamermodifikation. Diese Aspekte spielen auch bei der CTC-Isolierung eine wesentliche Rolle. Sie sind jedoch nicht entscheidend für die Lösung von Problemen wie der Verbesserung der Erfassungseffizienz. Stattdessen bereichern diese Aspekte die CTC-Isolierung mit neuen Inhalten.
Diese Arbeit konzentriert sich auf die klinische Isolierung von CTCs mit dem entworfenen mikrofluidischen Chip. Die meisten verwendeten Mikrofluidik-Chips sind hauptsächlich physikalischer Basis, wie z. B. Filter mit großen Ellipsen und Filter mit kleinen Ellipsen. Wave-Chips werden durch die Kombination von affinitätsbasierten und physikalischen Chipeigenschaften hergestellt1. Die Mikropfosten von Big-Ellipse-Filtern wurden kürzer gestaltet, um die Einfangreinheit in dieser Arbeit zu verbessern. Die Filter mit kleinen Ellipsen können auch verbessert werden, indem sie mit unterschiedlichen Micropost-Größen für verschiedene Arrays entworfen werden. Wave-Chips können besser entworfen werden, indem mehr Arrays hinzugefügt werden, um die Erfassung zu verbessern.
Filter mit großen Ellipsen sind mit langen elliptischen Mikropfosten angeordnet, um Line-Line-Tunnel zu bilden, die eine hohe Erfassungseffizienz erreichen. Die Einschränkung dieser Abscheidung besteht jedoch darin, dass die Abscheiderreinheit nicht hoch genug ist oder eine hohe Einfangreinheit nicht leicht zu erhalten ist. Bei Wellenchips werden die kleinen Lücken verwendet, um die CTCs zu erfassen, und die verpassten CTCs werden von den folgenden Arrays erfasst. Die großen Spaltmaße werden genutzt, um die Durchflussrate zu beschleunigen und Störungen durch Erythrozyten zu eliminieren, wodurch die Abscheiderreinheit verbessert wird. Die Abscheideeffizienz liegt jedoch solide bei über 90 % und ist reproduzierbar.
Die klinische Validierung ist bei der CTC-Isolierung mit mikrofluidischen Chips von Bedeutung. In dieser Arbeit wird die klinische Isolierung von CTCs aus kolorektalen Patienten mit Big-Ellipse-Filtern, Small-Ellipse-Filtern und Wave-Chips vorgestellt. Das Ziel der entworfenen mikrofluidischen Chips ist es, CTCs klinisch zu zählen. Bei den bestehenden Methoden einiger anderer Systeme oder Plattformen ist die Abscheideeffizienz gering oder die Abscheideeffizienz ist nicht hoch genug, um die Methode effektiv in klinischen Anwendungen einzusetzen.
Basierend auf den klinischen Leistungen dieser drei mikrofluidischen Chips, die eine hohe Abscheideeffizienz aufweisen, können sie möglicherweise in CTC-Produkten eingesetzt werden, insbesondere nach Modifikationen. Die Stärke unseres Protokolls besteht darin, dass es die Zählung einer seltenen Anzahl von Tumorzellen demonstriert, um echte klinische Proben nachzuahmen. Darüber hinaus ist das klinisch-experimentelle Verfahren durchführbar und praktikabel. Mit dieser Methode können CTCs aus dem Vollblut des Patienten getrennt werden. Daher ist die Methode für klinische Anwendungen geeignet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschungsarbeit wurde unterstützt von der Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), der National Natural Science Foundation of China (21904003), dem Scientific Research Project der Tianjin Education Commission (2018KJ154), dem Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) und dem Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Verarbeitung, East China Normal University (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
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