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Bioengineering

Plateforme de puces microfluidiques cliniques pour l’isolement de cellules tumorales circulantes polyvalentes

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/64674
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4
1School of Microelectronics and Data Science, Anhui University of Technology, 2Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Normal University, 3School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, 4Department of Medical Oncology, Changzheng Hospital

Summary

La puce microfluidique clinique est une technique d’analyse biomédicale importante qui simplifie le prétraitement des échantillons de sang cliniques des patients et colore immunofluorement les cellules tumorales circulantes (CTC) in situ sur la puce, permettant la détection et l’identification rapides d’un seul CTC.

Abstract

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans le pronostic du cancer, le diagnostic et le traitement anticancéreux. Le dénombrement des CTC est essentiel pour déterminer la maladie du patient, car les CTC sont rares et hétérogènes. Les CTC sont détachés de la tumeur primaire, pénètrent dans le système de circulation sanguine et se développent potentiellement à des sites distants, métastasant ainsi la tumeur. Étant donné que les CTC portent des informations similaires à celles de la tumeur primaire, l’isolement des CTC et la caractérisation ultérieure peuvent être essentiels dans la surveillance et le diagnostic du cancer. Le dénombrement, la modification de l’affinité et la coloration par immunofluorescence clinique des CTC rares sont des méthodes puissantes pour l’isolement des CTC, car elles fournissent les éléments nécessaires avec une sensibilité élevée. Les puces microfluidiques offrent une méthode de biopsie liquide exempte de toute douleur pour les patients. Dans ce travail, nous présentons une liste de protocoles pour les puces microfluidiques cliniques, une plate-forme polyvalente d’isolation CTC, qui intègre un ensemble de fonctionnalités et de services nécessaires à la séparation, à l’analyse et au diagnostic précoce des CTC, facilitant ainsi l’analyse biomoléculaire et le traitement du cancer. Le programme comprend le comptage des cellules tumorales rares, le prétraitement clinique du sang des patients, qui comprend la lyse des globules rouges, ainsi que l’isolement et la reconnaissance des CTC in situ sur des puces microfluidiques. Le programme permet le dénombrement précis des cellules tumorales ou CTC. De plus, le programme comprend un outil qui intègre l’isolation CTC avec des puces microfluidiques polyvalentes et l’identification par immunofluorescence in situ sur les puces, suivie d’une analyse biomoléculaire.

Introduction

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans le pronostic du cancer, le diagnostic et le traitement anticancéreux. Le dénombrement des CTC est essentiel car les CTC sont rares et hétérogènes. Le dénombrement, la modification de l’affinité et la coloration clinique par immunofluorescence des CTC rares sont des techniques puissantes pour l’isolement des CTC car elles offrent les éléments nécessaires avec une sensibilité élevée1. Un nombre rare de cellules tumorales mélangées à du sang normal imite étroitement le sang réel des patients, car 2 à 3 ml de sang réel de patient ne contiennent que 1 à 10 CTC. Pour résoudre un problème expérimental critique, au lieu d’utiliser un grand nombre de cellules tumorales introduites dans le PBS ou mélangées avec du sang normal, l’utilisation d’un nombre rare de cellules tumorales nous fournit un faible nombre de cellules sanguines, ce qui est plus proche de la réalité lors de la réalisation d’une expérience.

Le cancer est la première cause de décès dans le monde2. Les CTC sont des cellules tumorales excrétées de la tumeur d’origine qui circulent dans les systèmes de circulation sanguine et lymphatique3. Lorsque les CTC se déplacent vers un nouvel environnement de survie, ils se développent comme une deuxième tumeur. C’est ce qu’on appelle la métastase et elle est responsable de 90% des décès chez les patients cancéreux4. Les CTC sont essentiels pour le pronostic, le diagnostic précoce et la compréhension des mécanismes du cancer. Cependant, les CTC sont extrêmement rares et hétérogènes dans le sang des patients 5,6.

Les puces microfluidiques offrent une biopsie liquide qui n’envahit pas la tumeur. Ils ont l’avantage d’être portables, peu coûteux et d’avoir une balance adaptée aux cellules. L’isolement des CTC à l’aide de puces microfluidiques est classé principalement en deux types: basé sur l’affinité, qui repose sur la liaison antigène-anticorps 7,8,9 et est la méthode originale et la plus largement utilisée d’isolement CTC; et les puces physiques, qui utilisent les différences de taille et de déformabilité entre les cellules tumorales et les cellules sanguines 10,11,12,13,14,15, sont sans marquage et faciles à utiliser. L’avantage des puces microfluidiques par rapport aux techniques alternatives est que l’approche physique des microfiltres à grosses ellipses capture fermement les CTC avec une efficacité de capture élevée. La raison en est que les micropoteaux d’ellipse sont organisés en minces tunnels d’espaces ligne-ligne. Les écarts de ligne de ligne sont différents des écarts de point de point traditionnels formés par des micropoteaux tels que les micropoteaux de losange. La capture de CTC basée sur des puces à ondes combine à la fois une isolation basée sur les propriétés physiques et une isolation basée sur l’affinité. La capture par puce à ondes implique 30 réseaux en forme d’onde avec l’anticorps anti-EpCAM recouvert de micropoteaux circulaires. Les CTC sont capturés par les petits espaces, et les grands écarts sont utilisés pour accélérer le débit. Les CTC manqués doivent passer les petits espaces dans la matrice suivante et sont capturés par l’isolation basée sur l’affinité intégrée à l’intérieur de la puce16.

L’objectif du protocole est de démontrer le comptage d’un nombre rare de cellules tumorales et l’analyse clinique des CTC avec des puces microfluidiques. Le protocole décrit les étapes d’isolement CTC, comment obtenir un faible nombre de cellules tumorales, la séparation physique clinique des filtres à petites ellipses et des filtres à grandes ellipses et des filtres trapézoïdaux, la modification de l’affinité et l’enrichissement17.

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Protocol

Les échantillons de sang des patients ont été fournis par l’hôpital Longhua affilié à l’Université médicale de Shanghai.Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine du troisième hôpital de l’Université de Pékin. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour l’utilisation des échantillons à des fins de recherche.

1. Pré-expérience pour vérifier l’efficacité de la capture avec des cellules tumorales en culture

  1. Culture des cellules tumorales MCF-7, MDA-MB-231 et HeLa pour déterminer l’efficacité de capture. Diluer la suspension de cellules tumorales, compter le nombre de cellules tumorales et répéter jusqu’à ce que le nombre souhaité de cellules dans 1 mL de PBS soit obtenu.
    1. Culture des cellules dans un flacon de culture cellulaire avec un nombre de cellules de départ de ~ 1 x 105 cellules dans 1 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incuber dans une atmosphère humidifiée à 37 °C avec une atmosphère de 5% de CO2 .
    2. Lorsque les lignées cellulaires se développent sous forme de monocouches adhérentes à 95% de confluence, détachez-les des boîtes de culture avec une solution de trypsine à 0,25% pendant 2 minutes, comme décrit dans Chen et al.16.
    3. Colorer les cellules tumorales avec de la calcéine AM. Mettez 3 μL de calcéine AM dans le plat de culture et conservez le plat dans l’incubateur pendant 30 min. Ensuite, digérez toutes les cellules avec de la trypsine.
    4. Compter les cellules tumorales cultivées dans le PBS avec une chambre de comptage cellulaire et diluer jusqu’à ce que 100 cellules tumorales par 1 mL de PBS soient obtenues.
      REMARQUE: Afin de dénombrer avec précision le nombre de cellules, prenez 50 μL de la suspension cellulaire obtenue pour voir si le nombre de cellules tumorales qu’elle contient est de cinq ou non avec un microscope. Décider du volume de suspension cellulaire à prendre pour obtenir 100 cellules tumorales en fonction du nombre réel de cellules tumorales dans 50 μL de suspension cellulaire.
  2. Introduire la suspension cellulaire contenant 100 cellules tumorales par 1 mL de PBS dans la puce microfluidique à l’aide d’une seringue avec une pompe à seringue à des débits variés de 0,5 mL/h, 1 mL/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h et 5 mL/h. Obtenir l’efficacité de capture pour les différents débits et déterminer le débit optimal.
    1. Comptez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce et sortant de la sortie. Calculez l’efficacité de capture comme ci-dessous :
      Efficacité de capture = Nombre de cellules capturées/(Nombre de cellules capturées + nombre de cellules sortantes) × 100 %
    2. Répétez pour obtenir l’efficacité de capture pour différents nombres de cellules tumorales de 10 à 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
  3. Tester et valider la puce microfluidique pour un nombre rare de cellules tumorales. Injectez ces 10 suspensions d’échantillons dans les puces microfluidiques à l’aide d’une aiguille creuse fabriquée avec un extracteur de micropipette pour aspirer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 cellules tumorales diluées dans 1 mL de PBS. Détecter et énumérer le nombre de cellules tumorales pour chaque échantillon après leur capture sur la puce.
    REMARQUE: L’aiguille creuse mesure environ 3 cm de long avec un diamètre externe de 1 mm.
  4. Effectuer des tests cliniques pré-expérimentaux pour les cellules tumorales enrichies dans des échantillons de sang normaux.
    1. Colorer les cellules tumorales avec de la calcéine AM, puis énumérer 100 cellules tumorales dans 5 μL de PBS. Ajoutez ces cellules à 1 mL d’échantillons de sang entier normal. Introduisez ces cellules dans la puce et énumérez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce avec une immunofluorescence verte. Effectuer un dénombrement in vivo sur la puce comme décrit ci-dessus et calculer l’efficacité de capture après la capture.
    2. Répétez l’étape 1.4.1 pour neuf concentrations supplémentaires de nombre de cellules tumorales de 10 à 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
    3. Énumérer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 cellules tumorales comme décrit à l’étape 1.3 sans coloration, augmenter dans 1 mL de sang total normal, introduire ces échantillons dans la puce microfluidique et capturer les cellules tumorales sur la puce.
    4. Coloration sur la puce avec Hoechst, CK-FITC et CD45-PE. Mettez 3-5 μL de colorant fluorescent dans 20-30 μL de PBS, puis introduisez cette solution sur la puce microfluidique avec une seringue. Énumérer le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce avec une immunofluorescence bleue et verte pour déterminer l’efficacité de capture.
  5. Effectuer une modification de la puce microfluidique pour la capture basée sur l’affinité de l’anti-EpCAM.
    REMARQUE : Étant donné que la puce d’onde combine à la fois une isolation basée sur l’affinité et une isolation basée sur les propriétés physiques, modifiez la puce avec des agents.
    1. Modifier la surface de la puce avec 100 μL de triméthoxysilane 3-mercaptopropylique à 4 % (v/v) dans de l’éthanol à température ambiante pendant 45 min. Introduisez cette solution dans la puce avec précaution et lentement au cas où elle détruirait la structure interne de la puce, en particulier le collage de la surface supérieure et du verre du substrat.
      REMARQUE: La surface de la puce est modifiée à l’aide de mercaptosilane. Les interactions qui se produisent sur la puce sont déterminées par des liaisons chimiques. Des liaisons chimiques sont établies pour réaliser la liaison de l’anticorps modifié avec l’antigène. Divers réactifs sont modifiés à l’intérieur de la puce pour établir des liaisons chimiques qui se connectent les unes aux autres. Le dernier réactif à être modifié est une molécule d’adhésion anti-épithéliale (anti-EpCAM). L’antigène de surface des cellules tumorales de l’EpCAM se combine avec l’anti-EpCAM à l’intérieur de la puce pour réaliser la capture des CTC.
    2. Laver à l’éthanol 3x. Ajouter 100 μL de l’agent de couplage N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS, 1 μM) sur la puce et laisser interagir pendant 30 min.
    3. Laver avec PBS 3x. Utilisez une seringue pour introduire 1 mL de PBS sur la puce à laver.
    4. Traiter la puce avec 30-40 μL de 10 μg/mL de Neutravidine à température ambiante pendant 30 min, conduisant à l’immobilisation des cellules sur le GMBS, puis rincer avec du PBS pour éliminer l’excès d’avidine.
    5. Modifier la puce avec 3 μL d’anticorps EpCAM anti-biotinylés à une concentration de 10 μg/mL dans 100 μL de PBS avec 1 % (p/v) de BSA. Gardez ceci toute la nuit.

2. Expérience clinique sur la puce pour énumérer les cellules tumorales circulantes (CTC)

  1. Prétraiter les échantillons de sang cliniques de patients atteints de cancer à l’aide d’une solution de lyse des globules rouges (RBCL) ou introduire 2 à 3 mL de l’échantillon de sang directement sur la puce microfluidique à l’aide d’une seringue.
    1. Effectuez le prétraitement, qui prend environ 30 min. Prélever des échantillons de sang total dans des tubes anticoagulants. Ajouter 6 à 9 mL de solution de lyse RBS dans 2 à 3 mL de sang. Centrifuger à 111 x g pendant 5-8 min à température ambiante et jeter la couche supérieure de liquide clair rouge.
  2. Capturez, colorez, reconnaissez et énumérez les cellules de la puce comme décrit ci-dessous.
    1. Capturez les cellules de la puce comme décrit à l’étape 1.Colorez la puce pour les CTC capturés à l’aide de Hoechst, CK-FITC et CD45-PE. CK-FITC est une coloration spécifique pour les cellules tumorales, et CD45-PE est pour les globules blancs.
    2. Ajouter 3 μL de CK-FITC à 20 μL de PBS. Introduisez-le dans la seringue et pompez le CK-FITC dilué sur la puce. Laisser tacher pendant 30 min. Introduisez 300 μL de PBS sur la puce pour laver la puce.
    3. Ajouter 3 μL de CD45-PE à 20 μL de PBS. Introduisez-le dans la seringue et pompez le CD45-PE dilué sur la puce. Laisser reposer pendant 30 min. Introduisez 300 μL de PBS sur la puce pour laver la puce.
    4. Identifier les CTC à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée à un grossissement de 20x ou 40x. Les CTC émettent à la fois une fluorescence bleue et verte, et les globules blancs (GB) émettent à la fois une fluorescence bleue et rouge. Identifier les CTC avec fluorescence bleue et verte et les globules blancs avec fluorescence bleue et rouge.
    5. À partir des images d’immunofluorescence, énumérez le nombre de CTC capturés sur la puce. Énumérez les CTC comme Hoechst+/CK-FITC+/CD45− et les WBC comme Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
  3. Enrichir les CTC capturés en rinçant avec du PBS à travers la seringue dans le sens inverse sur la puce microfluidique pour recueillir les CTC capturés sur la puce à partir de l’entrée. Utilisez une seringue contenant 1 mL de PBS, introduisez-la à partir de la prise pour enrichir les CTC capturés sur la puce en 2-3 minutes, et récupérez-les à l’entrée. Utilisez 1 mL de PBS pour chaque étape de lavage et répétez 3x.
  4. Colorer les cellules tumorales ou CTC capturés sur la puce microfluidique comme décrit ci-dessous.
    1. Coloration à l’aide de calcéine AM. Ajouter 5 μL de calcéine AM à 20 μL de PBS, colorer les cellules pendant 30 min, puis centrifuger à 111 x g pendant 2 min à température ambiante pour obtenir des cellules tumorales, et suspendre dans 1 mL de PBS.
    2. Pour identifier les noyaux cellulaires, ajouter 20 μL de solution DAPI (10 μL de réactif DAPI dans 20 μL de PBS) à la puce au débit optimal de 1 mL/h pour les microfiltres à grosses ellipses et de 1,5 mL/h pour les microfiltres trapézoïdaux. Passez à travers 20 μL de solution mère d’anti-cytokératine (3 μL d’anticorps anti-cytokératine dans 20 μL de PBS) pour réagir avec la puce pendant 30 min.
    3. Tachez les WBC capturés sur la puce. Une fois les CTC capturés sur la puce, ajoutez 25 μL de solution d’anticorps anti-CD45 (5 μL de solution anti-CD45 dans 20 μL de PBS) à la puce et laissez colorer pendant 30 minutes. Laver avec du PBS et identifier les cellules épithéliales avec une fluorescence bleue et verte.
  5. Effectuer l’identification par immunofluorescence par microscopie à fluorescence comme décrit ci-dessous.
    1. Utilisez un microscope à fluorescence et excitez l’échantillon avec le laser bleu. Trouvez les cellules émettant une fluorescence bleue, qui sont des cellules nucléées. Utilisez l’un des grossissements suivants : 10x, 20x ou 40x. Trouvez un champ clair pour la cellule tumorale. Pour la source laser bleue, utilisez une longueur d’onde de plaque d’excitation de 420-485 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 515 nm.
    2. Sans déplacer les échantillons, utilisez une autre source laser. Faites pivoter le microscope à fluorescence et excitez l’échantillon avec le laser vert. Trouvez les cellules émettant une fluorescence verte, ce qui indique des cellules tumorales. Prenez des images du même champ avec le même grossissement avec cette source laser verte. Les cellules qui émettent à la fois une fluorescence bleue et verte sont reconnues comme des cellules tumorales. Pour la source laser verte, utilisez une longueur d’onde de plaque d’excitation de 460-550 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 590 nm
    3. Sans déplacer les échantillons, utilisez une autre source laser. Faites pivoter le microscope à fluorescence et excitez l’échantillon avec le laser rouge. Trouvez les cellules émettant une fluorescence rouge. Prenez des images du même champ avec le même grossissement avec cette source laser rouge. Les cellules qui émettent à la fois une fluorescence bleue et rouge sont reconnues comme des globules blancs.
    4. Enregistrez l’image obtenue en utilisant chacune des sources laser ci-dessus. Prenez plusieurs images du même champ avec des lumières de couleurs différentes.
    5. Utilisez la lumière ultraviolette avec une longueur d’onde de plaque d’excitation de 330-400 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 425 nm. Utilisez la lumière violette avec une longueur d’onde de plaque d’excitation de 395-415 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 455 nm.
  6. Calculez l’efficacité de capture comme à l’étape 1.2.1.

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Representative Results

L’ensemble de la configuration comprend une pompe à seringue, une seringue et une puce microfluidique. La suspension cellulaire dans la seringue est connectée à la pompe à seringue, et la suspension de cellule est introduite dans la puce microfluidique pour capturer les cellules. L’efficacité de capture pour toutes les puces microfluidiques utilisées était d’environ 90% ou plus. Pour la puce à onde, nous avons conçu des microstructures avec des lacunes variées. Les petits espaces sont utilisés pour capturer les CTC, et les grands espaces sont utilisés pour accélérer le débit. La suspension cellulaire s’écoule rapidement dans les grandes zones d’écart. Les CTC manqués ont tendance à être capturés par les petites lacunes dans le tableau suivant16. Pour les puces d’ellipse, nous avons conçu des espaces de ligne au lieu d’espaces ponctuels pour former un tunnel mince afin d’améliorer la capture. Par conséquent, une efficacité de capture élevée a été atteinte1. Nous avons conçu une structure d’ellipse pour éviter les bords et les coins afin de maintenir la viabilité. Les filtres trapézoïdaux ont deux canaux circulaires en spirale avec des barrières trapézoïdales et des micropoteaux circulaires intégrés. Pour les filtres trapézoïdaux, les rendements de capture pour MCF-7, MDA-MB-231 et HeLa étaient respectivement de 94 %, 95 % et 93 %18.

La figure 1 montre que toutes les cellules tumorales ont été capturées par la puce d’onde. Étant donné que toutes les cellules tumorales étaient concentrées autour du réseau de micropostes à ondes, cela indique une efficacité de capture élevée pour cette puce microfluidique, comme le démontre le nombre de cellules tumorales capturées. Par conséquent, cette configuration facilite grandement la capture de cellules tumorales rares; En effet, la puce est fabriquée pour capturer un grand nombre de cellules tumorales ainsi qu’un nombre rare de cellules tumorales. Par exemple, si la puce est suffisamment solide ou reproductible pour capturer 10 000 cellules tumorales, il est facile pour la puce de capturer 10 à 100 cellules. La vidéo 1 montre comment un nombre rare de cellules tumorales ont été obtenues pour la pré-expérience. Une aiguille creuse fabriquée à l’aide d’un extracteur de micropipettes a été utilisée pour aspirer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 cellules tumorales d’une boîte de culture avec des cellules tumorales diluées colorées avec de la calcéine AM dans PBS. Les cellules ont été absorbées par le tube de gel de silice relié à l’aiguille creuse. Une cellule tumorale avec une immunofluorescence verte a été aspirée dans l’aiguille creuse. Le soufflage dans le tube creux a conduit à la décharge de la cellule tumorale à l’intérieur de l’aiguille creuse dans un tube microcentrifuge1. C’est la procédure pour obtenir des cellules tumorales rares. La figure 2 montre les CTC d’un patient atteint d’un cancer gastrique capturés à l’aide de microfiltres à petites ellipses . La figure 3 montre les CTC d’un patient atteint d’un cancer colorectal capturé à l’aide de microfiltres trapézoïdaux et émettant à la fois une fluorescence bleue et verte. La figure 4 montre les cellules tumorales cultivées sur la puce après capture, qui sont prêtes à être traitées avec des médicaments anticancéreux. Ces résultats montrent que les microfiltres à grosses ellipses n’ont aucun effet négatif sur la viabilité cellulaire.

La figure 5 montre l’analyse clinique d’immunofluorescence des CTC colorectaux capturés sur la puce microfluidique. Ceux-ci sont vus en fond clair et colorés avec des taches Hoechst, CK-FITC et CD45-PE. Les CTC ont été reconnus comme DAPI+/CK+/CD45−, et les WBC ont été identifiés comme DAPI+/CK−/CD45+. La figure 6 montre des cellules tumorales colorectales cultivées sur la puce à grosse ellipse après capture. La figure 7 montre les cellules tumorales colorectales capturées sur les microfiltres à grosses ellipses . Cliniquement, les CTC dans le sang des patients ont été capturés par des puces à vagues, des microfiltres trapézoïdaux et des microfiltres à grosses ellipses indiquant que ces trois puces réussissent à capturer les CTC. Potentiellement, ils pourraient être appliqués dans les produits CTC, tels que les produits d’isolation CTC, avec une efficacité élevée.

Figure 1
Figure 1 : Capture des puces d’onde. Toutes les cellules tumorales de MCF-7 ont été capturées autour du réseau de la puce d’onde sans aucune cellule manquante. Comme il n’y avait pas de cellules tumorales dans une autre zone que le réseau, cela indique l’efficacité de capture élevée de la puce. Un grand nombre de cellules tumorales ont été capturées. Par conséquent, les cellules tumorales rares peuvent également être facilement capturées. Les cellules tumorales de MCF-7 ont été capturées par puce à ondes et (A) colorées avec Hoechst et (B) colorées avec de la calcéine AM. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Échantillon clinique de CTC capturé par des microfiltres à petites ellipses CTC cliniques d’un patient atteint d’un cancer gastrique capturé par des microfiltres à petites ellipses Les CTC ont été identifiés en fond clair et avec une fluorescence bleue et verte. Le cercle bleu en (A) indique un CTC d’un patient atteint d’un cancer gastrique capturé à l’intérieur de la puce. D’après les images prises, on peut voir qu’il n’y avait pas d’autres cellules dans d’autres zones, ce qui indique que la pureté de capture était élevée pour cette puce. Les cellules tumorales de MCF-7 ont été capturées par des microfiltres à petites ellipses et observées dans (A) le fond clair, (B) coloré avec Hoechst et (C) coloré avec CK-FITC. Barre d’échelle: 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Échantillon clinique de CTC capturés par des microfiltres trapézoïdaux. Les CTC cliniques d’un patient atteint d’un cancer colorectal ont été capturés par des microfiltres trapézoïdaux. Sur ces images, on peut voir que six CTC ont été capturés, ce qui indique que l’efficacité de la capture était élevée dans le petit champ. De plus, aucune autre cellule n’est apparue, ce qui indique que la pureté de capture était extrêmement élevée pour cette puce. Les cellules tumorales de MCF-7 ont été capturées par des microfiltres trapézoïdaux et observées dans (A) le fond clair, (B) colorées avec Hoechst et (C) colorées avec CK-FITC. Barre d’échelle : 20 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Culture de CTC capturés par des microfiltres à grosses ellipses Les cellules tumorales de MCF-7 ont été capturées par des microfiltres à grande ellipse devant un réseau de micropostes à grandes ellipses . Aucune cellule tumorale n’a traversé le réseau, ce qui indique une efficacité de capture élevée pour cette puce. Après capture, les cellules tumorales se sont développées pendant 24 à 48 heures. Cela indique que l’efficacité de capture et la viabilité étaient très élevées pour les microfiltres à grosses ellipses . Les cellules tumorales cultivées de MCF-7 ont été capturées par des microfiltres à grosses ellipses et observées à (A) 0 h après la capture, (B) 24 h après la capture et (C) 48 h après la capture. Barre d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Exemple d’échantillon clinique utilisé pour la capture de CTC par des microfiltres trapézoïdaux. Les CTC cliniques d’un patient atteint d’un cancer colorectal ont été capturés par des microfiltres trapézoïdaux. Dans ces images, on peut voir que deux CTC ont été capturés, ce qui indique une efficacité de capture élevée. Il n’y avait pas d’autre perturbation cellulaire que des résidus de globules rouges dans la puce. Ainsi, pour le prétraitement clinique de la capture de CTC, il est préférable de ne pas utiliser la lyse des globules rouges. Les CTC du cancer colorectal ont été capturés par des microfiltres trapézoïdaux et observés dans (A) le fond clair, (B) coloré avec Hoechst, (C) coloré avec CK-FITC, et (D) vu dans les images fusionnées. Barre d’échelle: 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Exemple de CTC cultivés capturés par une puce à grosse ellipse. Cultures de cellules tumorales de cellules MCF-7 devant le réseau de micropostes à grandes ellipses et derrière les microfiltres à grande ellipse. Les cellules tumorales colorées avec de la calcéine AM émettant une fluorescence verte se sont développées comme souhaité, indiquant que la viabilité cellulaire de cette puce était très élevée. Au total, il y avait 15 réseaux, avec des écarts variés pour chaque réseau organisés par des micropoteaux à grandes ellipses . Les cellules tumorales MCF-7 ont été cultivées sur la puce à grosse ellipse après capture (A) dans un réseau et (B) dans un autre réseau. Barre d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Exemple d’échantillon clinique utilisé pour la capture de CTC par des microfiltres à grosses ellipses Les CTC cliniques d’un patient atteint d’un cancer colorectal ont été capturés par des microfiltres à grosses ellipses . D’après les images, on peut voir qu’il y avait une contamination par les globules rouges. Cela indique que l’échantillon de sang entier du patient doit être dilué et que la puce doit être rincée après la capture. Les CTC d’échantillons de sang de patients atteints de cancer colorectal clinique ont été capturés sur la puce à grosse ellipse et vus dans (A) un fond clair, (B) coloré avec Hoechst et (C) coloré avec CK-FITC. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le pronostic et le diagnostic précoce du cancer ont un effet significatif sur le traitement du cancer1. L’isolement CTC avec des puces microfluidiques offre une biopsie liquide sans invasion. Cependant, les CTC sont extrêmement rares et hétérogènes dans le sang1, ce qui rend difficile l’isolement des CTC. Les CTC ont des propriétés similaires aux sources tumorales d’origine d’où ils proviennent. Ainsi, les CTC jouent un rôle essentiel dans les métastases cancéreuses1.

Le protocole proposé permet une analyse complète de l’isolement CTC avec la puce microfluidique. Le protocole comprend toutes les procédures clés liées à l’isolement CTC. Par exemple, ce protocole comprend des analyses RBCL, qui sont enregistrées méticuleusement et organisées en différents paquets, l’acquisition de cellules tumorales rares, la détermination du débit optimal, l’efficacité de capture, la caractérisation clinique et le dénombrement. La gestion minutieuse des opérations facilite le traitement des échantillons cliniques des patients. Le protocole permet le prétraitement et le traitement des échantillons cliniques de patients et offre des services vitaux aux cliniciens.

Pour l’isolement CTC, le prétraitement des cellules tumorales rares est extrêmement difficile à réaliser. Cette difficulté a été résolue en utilisant une aiguille creuse tirée à travers un extracteur d’aiguille pour aspirer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 cellules tumorales comme souhaité. Ensuite, un échantillon de sang clinique proche de la réalité a été préparé avec le nombre souhaité de cellules tumorales mélangées dans du sang normal, imitant un échantillon de sang de patient. Avec ces échantillons de sang artificiels de patients, une expérience proche de la réalité a été réalisée. Cette méthode a résolu un problème difficile habituellement rencontré dans l’isolement CTC pour les pré-expériences. Cette approche n’est pas facile à mettre en œuvre et n’a jamais été rapportée ailleurs; Cependant, c’est une approche utile avant de réaliser une véritable expérience clinique.

L’isolement CTC avec des puces microfluidiques est classé en trois types: basé sur l’affinité, basé sur la physique et basé sur l’immunomagnétique. Pour l’isolation basée sur l’affinité, la puce microfluidique doit être modifiée. Les procédures de modification spécifiques ont été incluses pour la modification avec anti-EpCAM. Les CTC ont été identifiés par coloration par immunofluorescence avec Hoechst, CK-FITC et CD45-PE. Étant donné que de nombreuses cellules tumorales expriment EpCAM, l’anti-EpCAM est un anticorps important pour capturer les CTC dans le sang des patients. Cependant, l’anti-EpCAM est très coûteux; Ainsi, de nombreux aptamères ont été développés pour résoudre ce problème. Nous utilisons principalement des puces microfluidiques physiques telles que des microfiltres à petites ellipses et des microfiltres trapézoïdaux pour capturer les CTC, car ils sont simples, faciles à utiliser et efficaces.

L’avantage de cette technique par rapport aux techniques alternatives est que la puce physique de microfiltres à grosses ellipses capture fermement les CTC avec une efficacité de capture élevée. La raison en est qu’il existe de minces tunnels d’espaces linéaires. Les puces d’onde capturent les CTC en combinant à la fois l’isolation basée sur les propriétés physiques et l’isolation basée sur l’affinité. Les CTC sont capturés par les petits espaces, et les grands écarts peuvent être utilisés pour accélérer le débit. Les CTC manqués doivent passer à travers les petites lacunes dans les tableaux suivants et sont également capturés par l’isolement basé sur l’affinité.

Le protocole a résolu plusieurs problèmes majeurs d’isolement des CTC, en particulier pour les expériences cliniques. Cependant, il est impossible d’inclure toutes les étapes détaillées de l’isolation CTC, par exemple en ce qui concerne le rôle des nanoparticules et des nanostructures et la modification des aptamères. Ces aspects jouent également un rôle essentiel dans l’isolement des CTC. Cependant, ils ne sont pas essentiels pour résoudre des problèmes tels que l’amélioration de l’efficacité de la capture. Au lieu de cela, ces aspects enrichissent l’isolement CTC avec de nouveaux contenus.

Ce travail se concentre sur l’isolement clinique des CTC avec la puce microfluidique conçue. La plupart des puces microfluidiques utilisées sont principalement physiques, telles que les filtres à grosses ellipses et les filtres à petites ellipses et les filtres à petites ellipses Les puces d’onde sont fabriquées en combinant à la fois des propriétés de puce basées sur l’affinité et sur la base physique1. Les micropoteaux des filtres à grandes ellipses ont été conçus pour être plus courts afin d’améliorer la pureté de capture dans ce travail. Les filtres à petites ellipses peuvent également être améliorés en les concevant avec des tailles de micropoteaux variées pour différents tableaux. Les puces Wave peuvent être mieux conçues en ajoutant plus de réseaux pour améliorer la capture.

Les filtres à grandes ellipses sont organisés avec de longs micropoteaux elliptiques pour former des tunnels linéaires qui permettent d’obtenir une efficacité de capture élevée. Cependant, la limite de cette capture est que la pureté de capture n’est pas assez élevée ou qu’une pureté de capture élevée n’est pas facile à obtenir. Pour la puce d’onde, les petits espaces sont utilisés pour capturer les CTC, et les CTC manqués sont capturés par les réseaux suivants. Les grands espaces sont utilisés pour accélérer le débit et éliminer les perturbations causées par les globules rouges, améliorant ainsi la pureté de capture; Cependant, l’efficacité de capture est solide à plus de 90% et est reproductible.

La validation clinique est significative dans l’isolement CTC avec des puces microfluidiques. Ce travail présente l’isolement clinique des CTC chez les patients colorectaux avec des filtres à grosses ellipses et des filtres à petites ellipses et des puces à vagues. L’objectif des puces microfluidiques conçues est de dénombrer cliniquement les CTC. Pour les méthodes existantes de certains autres systèmes ou plates-formes, l’efficacité de capture est faible, ou l’efficacité de capture n’est pas assez élevée pour que la méthode soit utilisée efficacement dans des applications cliniques.

Sur la base des performances cliniques de ces trois puces microfluidiques, qui ont une efficacité de capture élevée, elles peuvent potentiellement être appliquées dans les produits CTC, en particulier après modification. La force de notre protocole est qu’il démontre le dénombrement d’un nombre rare de cellules tumorales pour imiter des échantillons cliniques réels. De plus, la procédure expérimentale clinique est faisable et pratique. Cette méthode peut séparer les CTC du sang total du patient. Par conséquent, la méthode est appropriée pour les applications cliniques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail de recherche a été soutenu par la Fondation chinoise des sciences naturelles de l’Anhui (1908085MF197, 1908085QB66), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21904003), le Projet de recherche scientifique de la Commission de l’éducation de Tianjin (2018KJ154), le Programme provincial de recherche en sciences naturelles des établissements d’enseignement supérieur de la province de l’Anhui (KJ2020A0239) et le Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Transformation, Université normale de Chine orientale (MIP20221).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein AM BIOTIUM 80011
calibrated microcapillary pipettes Sigma- Aldrich P0799
CD45-PE BD Biosciences 560975
CK-FITC BD Biosciences 347653 cytokeratin monoclonal antibody
DMEM HyClone SH30081.05
fetal bovine serum (FBS) GIBCO,USA 26140
Hoechst 33342 Molecular Probes, Solarbio Corp., China C0031
penicillin-streptomycin Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL) Solarbio, Beijing R1010

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References

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Bioengineering numéro 200 Puce microfluidique cellules tumorales circulantes (CTC) identification par immunofluorescence
Plateforme de puces microfluidiques cliniques pour l’isolement de cellules tumorales circulantes polyvalentes
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Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y.,… More

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y., Wang, S., Jiao, X. Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (200), e64674, doi:10.3791/64674 (2023).

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