Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Klinisk mikrofluidisk chipplattform for isolering av allsidige sirkulerende tumorceller

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/64674
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4
1School of Microelectronics and Data Science, Anhui University of Technology, 2Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Normal University, 3School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, 4Department of Medical Oncology, Changzheng Hospital

Summary

Den kliniske mikrofluidbrikken er en viktig biomedisinsk analyseteknikk som forenkler preprosessering av blodprøver fra kliniske pasienter og immunfluorescerende flekker sirkulerende tumorceller (CTC) in situ på brikken, noe som muliggjør rask deteksjon og identifisering av en enkelt CTC.

Abstract

Sirkulerende tumorceller (CTC) er signifikante i kreftprognose, diagnose og kreftbehandling. CTC-opplisting er viktig for å bestemme pasientens sykdom siden CTC er sjeldne og heterogene. CTC løsnes fra primærtumoren, går inn i blodsirkulasjonssystemet og vokser potensielt på fjerne steder, og metastaserer dermed svulsten. Siden CTC bærer lignende informasjon til den primære svulsten, kan CTC-isolasjon og påfølgende karakterisering være kritisk for overvåking og diagnostisering av kreft. Oppregning, affinitetsmodifisering og klinisk immunfluorescensfarging av sjeldne CTC er kraftige metoder for CTC-isolering fordi de gir de nødvendige elementene med høy følsomhet. Mikrovæskebrikker tilbyr en flytende biopsimetode som er fri for smerter for pasientene. I dette arbeidet presenterer vi en liste over protokoller for kliniske mikrofluidiske chips, en allsidig CTC-isolasjonsplattform, som inneholder et sett med funksjoner og tjenester som kreves for CTC-separasjon, analyse og tidlig diagnose, og dermed letter biomolekylær analyse og kreftbehandling. Programmet inkluderer sjeldne tumorceller, klinisk pasientblodforbehandling, som inkluderer røde blodlegemer, og isolering og anerkjennelse av CTCs in situ på mikrofluidiske chips. Programmet tillater presis oppregning av tumorceller eller CTC. I tillegg inkluderer programmet et verktøy som inkorporerer CTC-isolasjon med allsidige mikrofluidiske chips og immunfluorescensidentifikasjon in situ på brikkene, etterfulgt av biomolekylær analyse.

Introduction

Sirkulerende tumorceller (CTC) er signifikante i kreftprognose, diagnose og kreftbehandling. CTC-opplisting er viktig siden CTC-er er sjeldne og heterogene. Oppregningen, affinitetsmodifikasjonen og klinisk immunfluorescensfarging av sjeldne CTC-er er kraftige teknikker for CTC-isolasjon fordi de tilbyr de nødvendige elementene med høy følsomhet1. Sjeldent antall tumorceller blandet med normalt blod etterligner ekte pasientblod siden 2-3 ml ekte pasientblod bare inneholder 1-10 CTC. For å løse et kritisk eksperimentelt problem, i stedet for å bruke et stort antall tumorceller introdusert i PBS eller blandet med normalt blod, gir bruken av sjeldent antall tumorceller oss et lavt antall blodceller, noe som er nærmere virkeligheten når vi utfører et eksperiment.

Kreft er den ledende dødsårsaken i verden2. CTC er tumorceller utgytt fra den opprinnelige svulsten som sirkulerer i blodet og lymfatiske sirkulasjonssystemer3. Når CTC flytter til et nytt overlevelsesmiljø, vokser de som en annen svulst. Dette kalles metastase og er ansvarlig for 90% av dødsfallene hos kreftpasienter4. CTC er avgjørende for prognose, tidlig diagnose og for å forstå mekanismene for kreft. CTC er imidlertid ekstremt sjeldne og heterogene i pasientblod 5,6.

Mikrofluidiske chips tilbyr en flytende biopsi som ikke invaderer svulsten. De har fordelen av å være bærbare, lave kostnader og ha en celletilpasset skala. Isoleringen av CTC med mikrofluidiske chips klassifiseres hovedsakelig i to typer: affinitetsbasert, som er avhengig av antigen-antistoffbinding 7,8,9 og er den opprinnelige og mest brukte metoden for CTC-isolasjon; og fysisk-baserte chips, som utnytter størrelse og deformabilitetsforskjeller mellom tumorceller og blodceller 10,11,12,13,14,15, er etikettfrie og er enkle å betjene. Fordelen med mikrofluidbrikker over alternative teknikker er at den fysisk-baserte tilnærmingen til stor-ellipse mikrofiltre fanger CTC fast med høy fangsteffektivitet. Årsaken til dette er at ellipsemikroposter er organisert i slanke tunneler av linjelinjegap. Linjelinjegapene er forskjellige fra de tradisjonelle punktpunktgapene dannet av mikroposter som rombemikroposter. Bølgebrikkebasert fangst av CTC-er kombinerer både fysisk eiendomsbasert og affinitetsbasert isolasjon. Bølgebrikkebasert fangst involverer 30 bølgeformede arrays med antistoffet av anti-EpCAM belagt på sirkulære mikroposter. CTC-ene fanges opp av de små hullene, og de store hullene brukes til å akselerere strømningshastigheten. De tapte CTC-ene må passere de små hullene i neste rekke og fanges opp av den affinitetsbaserte isolasjonen som er integrert i brikken16.

Målet med protokollen er å demonstrere telling av sjeldne antall tumorceller og klinisk analyse av CTC med mikrofluidiske chips. Protokollen beskriver CTC-isolasjonstrinnene, hvordan man oppnår et lavt antall tumorceller, den kliniske fysiske separasjonen av små ellipsefiltre, big-ellipsefiltre og trapesfiltre, affinitetsmodifisering og anrikning17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Pasientblodprøver ble levert av Longhua Hospital tilknyttet Shanghai Medical University.Protokollen følger retningslinjene til Peking University Third Hospitals humane forskningsetiske komité. Det ble innhentet informert samtykke fra pasientene til å bruke prøvene til forskningsformål.

1. Pre-eksperiment for å kontrollere fangsteffektiviteten med dyrkede tumorceller

  1. Kultur tumorcellene MCF-7, MDA-MB-231 og HeLa for å bestemme fangsteffektiviteten. Fortynn tumorcellesuspensjonen, telle antall tumorceller, og gjenta til ønsket antall celler i 1 ml PBS er oppnådd.
    1. Kultur cellene i en cellekulturkolbe med et startcellenummer på ~ 1 x 105 celler i 1 ml Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 10% fosterbovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Inkuber i en fuktet atmosfære ved 37 °C med en 5 % CO2 atmosfære.
    2. Når cellelinjene vokser som adherente monolayers til 95% samløp, løsne dem fra kulturskålene med 0,25% trypsinløsning i 2 minutter som beskrevet i Chen et al.16.
    3. Flekk tumorcellene med calcein AM. Sett 3 μL calcein AM i kulturfatet, og hold parabolen i inkubatoren i 30 min. Deretter,fordøye alle cellene med trypsin.
    4. Telle de dyrkede tumorcellene i PBS med et celletellingskammer, og fortynn til 100 tumorceller per 1 ml PBS er oppnådd.
      MERK: For å nøyaktig oppsummere cellenummer, ta 50 μL av den oppnådde cellesuspensjonen for å se om antall tumorceller i den er fem eller ikke med et mikroskop. Bestem volumet av cellesuspensjon som må tas for å oppnå 100 tumorceller i henhold til det faktiske antall tumorceller i 50 μL cellesuspensjon.
  2. Før cellesuspensjonen inneholdende 100 tumorceller per 1 ml PBS inn i mikrofluidbrikken ved hjelp av en sprøyte med sprøytepumpe ved varierte strømningshastigheter på 0,5 ml / t, 1 ml / h, 2 ml / h, 3 ml / h, 4 ml / t og 5 ml / h. Oppnå fangsteffektivitet for de ulike strømningshastighetene, og bestem den optimale strømningshastigheten.
    1. Telle antall tumorceller fanget på brikken og strømmer ut fra utløpet. Beregn fangsteffektiviteten som nedenfor:
      Fangsteffektivitet = Antall celler fanget / (Antall celler fanget + antall celler som strømmer ut) × 100%
    2. Gjenta for å oppnå fangsteffektiviteten for forskjellige antall tumorceller fra 10 til 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
  3. Test og valider mikrofluidbrikken for sjeldne antall tumorceller. Injiser disse 10 prøvesuspensjonene i mikrofluidbrikkene ved hjelp av en hul nål laget med en mikropipettetrekker for å aspirere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller fortynnet i 1 ml PBS. Oppdag og oppregn antall tumorceller for hver prøve etter fangst på brikken.
    MERK: Den hule nålen er rundt 3 cm lang med en ytre diameter på 1 mm.
  4. Utfør klinisk pre-eksperiment testing for tumorceller pigget inn i normale blodprøver.
    1. Flekk tumorcellene med calcein AM, og oppregn deretter 100 tumorceller i 5 μL PBS. Spike disse cellene i 1 ml av hele normale blodprøver. Introduser disse cellene i brikken, og list opp antall tumorceller fanget på brikken med grønn immunfluorescens. Utfør in vivo-opptelling på brikken som beskrevet ovenfor, og beregn fangsteffektiviteten etter fangst.
    2. Gjenta trinn 1.4.1 for ni ytterligere konsentrasjoner av tumorcelletall fra 10 til 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
    3. List opp 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller som beskrevet i trinn 1.3 uten farging, pigg i 1 ml helt normalt blod, introduser disse prøvene i mikrofluidbrikken, og fang tumorcellene på brikken.
    4. Beis på brikken med Hoechst, CK-FITC og CD45-PE. Sett 3-5 μL fluorescerende fargestoff i 20-30 μL PBS, og introduser deretter denne løsningen på mikrofluidbrikken med en sprøyte. Oppregn antall tumorceller fanget på brikken med både blå og grønn immunfluorescens for å bestemme fangsteffektiviteten.
  5. Utfør modifikasjon av mikrofluidbrikken for affinitetsbasert fangst av anti-EpCAM.
    MERK: Siden bølgebrikken kombinerer både affinitetsbasert og fysisk egenskapsbasert isolasjon, må du modifisere brikken med agenter.
    1. Endre overflaten på brikken med 100 μL 4 % (v/v) 3-merkaptopropyltrimetoksysilan i etanol ved romtemperatur i 45 minutter. Introduser denne løsningen i brikken forsiktig og sakte i tilfelle den ødelegger den indre strukturen til brikken, spesielt limingen av toppoverflaten og underlagsglasset.
      MERK: Chipoverflaten modifiseres ved hjelp av merkaptosilan. Samspillet som skjer på brikken bestemmes av kjemiske bindinger. Kjemiske bindinger etableres for å realisere bindingen av antistoffet modifisert med antigenet. Ulike reagenser modifiseres inne i brikken for å etablere kjemiske bindinger som forbinder med hverandre. Det siste reagenset som skal modifiseres er et anti-epitelial adhesjonsmolekyl (anti-EpCAM). Tumorcelleoverflateantigenet til EpCAM kombineres med anti-EpCAM inne i brikken for å realisere fangsten av CTC-ene.
    2. Vask med etanol 3x. Tilsett 100 μL av koblingsmiddelet N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS, 1 μM) på brikken, og la den samhandle i 30 minutter.
    3. Vask med PBS 3x. Bruk en sprøyte for å introdusere 1 ml PBS på brikken for å vaske.
    4. Behandle brikken med 30-40 μL av 10 μg / ml nøytraridin ved romtemperatur i 30 minutter, noe som fører til immobilisering av cellene på GMBS, og skyll deretter med PBS for å fjerne overflødig avidin.
    5. Endre brikken med 3 μL anti-biotinylert EpCAM-antistoff i en konsentrasjon på 10 μg / ml i 100 μL PBS med 1% (w / v) BSA. Hold dette over natten.

2. Klinisk eksperiment på brikken for å oppregne sirkulerende tumorceller (CTC)

  1. Forbehandle blodprøver fra kliniske kreftpasienter ved hjelp av RBCL-løsning (røde blodlegemer), eller introdusere 2-3 ml av blodprøven direkte på mikrovæskebrikken ved hjelp av en sprøyte.
    1. Utfør forbehandling, som tar rundt 30 min. Samle hele blodprøver i antikoagulasjonsrør. Tilsett 6-9 ml RBS lysisoppløsning i 2-3 ml blod. Sentrifuger ved 111 x g i 5-8 min ved romtemperatur, og kast det øvre laget av rød klar væske.
  2. Ta opp, flekker, gjenkjenn og list opp cellene på brikken som beskrevet nedenfor.
    1. Fang cellene på brikken som beskrevet i trinn 1.Flekk brikken for CTC-ene som er fanget med Hoechst, CK-FITC og CD45-PE. CK-FITC er en spesifikk flekk for tumorceller, og CD45-PE er for hvite blodlegemer.
    2. Tilsett 3 μL CK-FITC til 20 μL PBS. Før dette inn i sprøyten, og pump den fortynnede CK-FITC på brikken. La beise i 30 min. Innfør 300 μL PBS på brikken for å vaske brikken.
    3. Tilsett 3 μL CD45-PE til 20 μL PBS. Før dette inn i sprøyten, og pump den fortynnede CD45-PE på brikken. La stå i 30 min. Innfør 300 μL PBS på brikken for å vaske brikken.
    4. Identifiser CTCene med et invertert fluorescensmikroskop ved 20x eller 40x forstørrelse. CTC avgir både blå og grønn fluorescens, og hvite blodlegemer (WBC) avgir både blå og rød fluorescens. Identifiser CTC-ene med både blå og grønn fluorescens og WBC-ene med både blå og rød fluorescens.
    5. Fra immunfluorescensbildene registrerer du antall CTC-er som er fanget på brikken. List opp CTC-ene som Hoechst+/CK-FITC+/CD45− og WBC-ene som Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
  3. Berik de fangede CTC-ene ved å skylle med PBS gjennom sprøyten i motsatt retning på mikrofluidbrikken for å samle CTC-ene som er fanget på brikken fra innløpet. Bruk en sprøyte med 1 ml PBS, før den fra utløpet for å berike CTC-ene som er fanget på brikken innen 2-3 minutter, og samle dem fra innløpet. Bruk 1 ml PBS for hvert vasketrinn, og gjenta 3x.
  4. Flekk tumorcellene eller CTCene som er fanget på mikrofluidbrikken som beskrevet nedenfor.
    1. Beis med calcein AM. Tilsett 5 μL kalcein AM til 20 μL PBS, flekk cellene i 30 minutter, sentrifuge deretter ved 111 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å oppnå tumorceller, og suspender i 1 ml PBS.
    2. For å identifisere de cellulære kjernene, tilsett 20 μL DAPI-oppløsning (10 μL DAPI-reagens i 20 μL PBS) til brikken ved optimal strømningshastighet på 1 ml / t for mikrofiltre med stor ellipse og 1,5 ml / t for trapesformede. Pass gjennom 20 μL anti-cytokeratin stamløsning (3 μL anti-cytokeratin antistoff i 20 μL PBS) for å reagere med brikken i 30 minutter.
    3. Flekk WBC-ene som er fanget på brikken. Etter at CTCene er fanget på brikken, tilsett 25 μL anti-CD45 antistoffoppløsning (5 μL anti-CD45-løsning i 20 μL PBS) til brikken, og la flekker i 30 minutter. Vask med PBS, og identifiser epitelcellene med både blå og grønn fluorescens.
  5. Utfør immunfluorescensidentifikasjon med fluorescensmikroskopi som beskrevet nedenfor.
    1. Bruk et fluorescensmikroskop og opphiss prøven med den blå laseren. Finn cellene som sender ut blå fluorescens, som er nukleatceller. Bruk en av følgende forstørrelser: 10x, 20x eller 40x. Finn et klart felt for tumorcellen. For den blå laserkilden, bruk en eksitasjonsplatebølgelengde på 420-485 nm og en emisjonsplatebølgelengde på 515 nm.
    2. Uten å flytte prøvene, bruk en annen laserkilde. Roter fluorescensmikroskopet og opphiss prøven med den grønne laseren. Finn cellene som avgir grønn fluorescens, som indikerer tumorceller. Ta bilder av det samme feltet med samme forstørrelse med denne grønne laserkilden. Cellene som avgir både blå og grønn fluorescens blir anerkjent som tumorceller. For den grønne laserkilden, bruk en eksitasjonsplatebølgelengde på 460-550 nm og en emisjonsplatebølgelengde på 590 nm
    3. Uten å flytte prøvene, bruk en annen laserkilde. Roter fluorescensmikroskopet og opphiss prøven med den røde laseren. Finn cellene som sender ut rød fluorescens. Ta bilder av det samme feltet med samme forstørrelse med denne røde laserkilden. Cellene som avgir både blå og rød fluorescens er anerkjent som hvite blodlegemer.
    4. Lagre bildet for oppnådd ved å bruke hver av laserkildene ovenfor. Ta flere bilder av samme felt med forskjellig farget lys.
    5. Bruk ultrafiolett lys med en eksitasjonsplatebølgelengde på 330-400 nm og en emisjonsplatebølgelengde på 425 nm. Bruk lilla lys med en eksitasjonsplatebølgelengde på 395-415 nm og en emisjonsplatebølgelengde på 455 nm.
  6. Beregn fangsteffektiviteten som i trinn 1.2.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele oppsettet inkluderer en sprøytepumpe, en sprøyte og en mikrofluidbrikke. Cellesuspensjonen i sprøyten er koblet til sprøytepumpen, og cellesuspensjonen føres inn i den mikrofluidiske brikken for å fange opp cellene. Fangsteffektiviteten for alle mikrofluidbrikkene som ble brukt var rundt 90% eller høyere. For bølgebrikken designet vi mikrostrukturer med varierte hull. De små hullene brukes til å fange CTC-ene, og de store hullene brukes til å akselerere strømningshastigheten. Celleopphenget flyter raskt i de store gapområdene. De tapte CTC-ene har en tendens til å bli fanget opp av de små hullene i den påfølgende matrisen16. For ellipsebrikker designet vi linjelinjegap i stedet for punktpunktgap for å danne en slank tunnel for å forbedre fangsten. Derfor ble høy fangsteffektivitet oppnådd1. Vi designet en ellipsestruktur for å unngå kanter og hjørner for å opprettholde levedyktighet. De trapesformede filtrene har to sirkulære spiralkanaler med innebygde trapesformede og sirkulære mikropostbarrierer. For trapesfiltre var fangsteffektiviteten for MCF-7, MDA-MB-231 og HeLa henholdsvis 94 %, 95 % og 93 %18.

Figur 1 viser at alle tumorcellene ble fanget opp av bølgebrikken. Siden alle tumorcellene var konsentrert rundt bølgemikropostmatrisen, indikerer dette høy fangsteffektivitet for denne mikrofluidiske brikken, som demonstrert av antall tumorceller som ble fanget. Derfor gjør dette oppsettet det mye lettere å fange sjeldne tumorceller; Faktisk er brikken fabrikkert for å fange et stort antall tumorceller, så vel som sjeldent antall tumorceller. For eksempel, hvis brikken er solid eller reproduserbar nok til å fange 10.000 tumorceller, er det enkelt for brikken å fange 10-100 celler. Video 1 viser hvor sjeldent antall tumorceller ble oppnådd for pre-eksperimentet. En hul nål laget ved hjelp av en mikropipettetrekker ble brukt til å aspirere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller fra en kulturskål med fortynnede tumorceller farget med kalcein AM i PBS. Cellene ble absorbert av silikagelrøret forbundet med den hule nålen. En tumorcelle med grønn immunfluorescens ble sugd inn i den hule nålen. Blåsing inn i hulrøret førte til at tumorcellen inne i den hule nålen ble sluppet ut i et mikrosentrifugerør1. Dette er prosedyren for å oppnå sjeldne tumorceller. Figur 2 viser CTC fra en magekreftpasient fanget med mikrofilter med små ellipser. Figur 3 viser CTC fra en kolorektal kreftpasient fanget med trapesformede mikrofilter og avgir både blå og grønn fluorescens. Figur 4 viser tumorceller dyrket på brikken etter fangst, som er klare til å behandles med kreftmedisin. Disse funnene illustrerer at stor-ellipse mikrofiltre ikke har noen negative effekter på cellens levedyktighet.

Figur 5 viser den kliniske immunfluorescensanalysen av kolorektale CTC fanget på mikrofluidbrikken. Disse er sett i brightfield og farget med Hoechst, CK-FITC og CD45-PE-farging. CTC-ene ble anerkjent som DAPI+/CK+/CD45−, og WBC-ene ble identifisert som DAPI+/CK−/CD45+. Figur 6 viser kolorektale tumorceller dyrket på storellipsebrikken etter fangst. Figur 7 viser kolorektale tumorceller fanget på storellipsemikrofilterne. Klinisk ble CTC i pasientblod fanget opp av bølgebrikker, trapesformede mikrofiltre og big-ellipse-mikrofiltre, noe som indikerer at disse tre brikkene lykkes med å fange CTC. Potensielt kan de brukes i CTC-produkter, for eksempel CTC-isolasjonsprodukter, med høy effektivitet.

Figure 1
Figur 1: Fangst av bølgebrikker. Alle tumorcellene i MCF-7 ble fanget rundt bølgebrikken uten at noen celler manglet. Siden det ikke var noen tumorceller i noe annet område enn matrisen, indikerer dette den høye fangsteffektiviteten til brikken. Et stort antall tumorceller ble fanget. Derfor kan sjeldne tumorceller også lett fanges. Tumorceller av MCF-7 ble fanget av bølgebrikke og (A) farget med Hoechst og (B) farget med calcein AM. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Klinisk prøve for CTC fanget opp av mikrofilter med små ellipser. Kliniske CTC av en gastrisk kreftpasient fanget av mikrofiltre med liten ellipse. CTC-ene ble identifisert i brightfield og med både blå og grønn fluorescens. Den blå sirkelen i (A) indikerer en CTC av en magekreftpasient fanget inne i brikken. Fra bildene som ble tatt, kan det sees at det ikke var andre celler i noen andre områder, noe som indikerer at fangstrenheten var høy for denne brikken. Tumorceller av MCF-7 ble fanget av mikrofiltre med liten ellipse og sett i (A) brightfield, (B) farget med Hoechst og (C) farget med CK-FITC. Skala bar: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Klinisk prøve av CTC fanget opp av trapesformede mikrofiltre. Kliniske CTC fra en kolorektal kreftpasient ble fanget opp av trapesformede mikrofiltre. På disse bildene kan man se at seks CTC-er ble tatt, noe som indikerer at fangsteffektiviteten var høy i det lille feltet. I tillegg dukket det ikke opp andre celler, noe som indikerte at fangstrenheten var ekstremt høy for denne brikken. Tumorceller av MCF-7 ble fanget av trapesformede mikrofiltre og sett i (A) brightfield, (B) farget med Hoechst, og (C) farget med CK-FITC. Skala bar: 20 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Dyrkning av CTC fanget av stor-ellipse mikrofilter. Tumorceller av MCF-7 ble fanget av big-ellipse mikrofiltre foran en big-ellipse micropost array. Ingen tumorceller passerte gjennom matrisen, noe som indikerer høy fangsteffektivitet for denne brikken. Etter fangst vokste tumorcellene i 24-48 timer. Dette indikerer at både fangsteffektiviteten og levedyktigheten var svært høy for de store ellipsemikrofiltrene. De dyrkede tumorcellene til MCF-7 ble fanget opp av stor-ellipse mikrofiltre og sett ved (A) 0 timer etter fangst, (B) 24 timer etter fangst og (C) 48 timer etter fangst. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på klinisk prøve brukt til CTC-fangst med trapesformede mikrofilter. Kliniske CTC fra en kolorektal kreftpasient ble fanget opp av trapesformede mikrofiltre. På disse bildene kan man se at to CTC-er ble tatt, noe som indikerer høy fangsteffektivitet. Det var ingen annen celleforstyrrelse bortsett fra rester av RBC i brikken. For den kliniske forbehandlingen av CTC-fangst er det derfor bedre å ikke bruke røde blodlegemer. CTC av kolorektal kreft ble fanget av trapesformede mikrofiltre og sett i (A) brightfield, (B) farget med Hoechst, (C) farget med CK-FITC, og (D) sett i sammenslåtte bilder. Skala bar: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på dyrkede CTC-er fanget av en stor ellipsebrikke. Tumorcellekulturer av MCF-7-celler foran big-ellipse micropost-arrayet og bak de store ellipsemikrofiltrene. Tumorcellene farget med kalcein AM som avgir grønn fluorescens vokste som ønsket, noe som indikerer at cellens levedyktighet for denne brikken var veldig høy. Totalt var det 15 arrays, med varierte hull for hver array organisert av big-ellipse mikroposter. MCF-7-tumorceller ble dyrket på big-ellipse-brikken etter fangst (A) i en matrise og (B) i en annen matrise. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Eksempel på klinisk prøve brukt til CTC-fangst med storellipsemikrofilter. Kliniske CTCer fra en kolorektal kreftpasient ble fanget av big-ellipse mikrofiltre. Fra bildene kan man se at det var RBC-forurensning. Dette indikerer at hele blodprøven må fortynnes og at brikken må skylles etter fangst. CTC av blodprøver fra kliniske kolorektal kreftpasienter ble tatt på big-ellipse-brikken og sett i (A) brightfield, (B) farget med Hoechst og (C) farget med CK-FITC. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prognosen og tidlig diagnose av kreft har en betydelig effekt på kreftbehandling1. CTC-isolasjon med mikrofluidiske chips gir en flytende biopsi uten invasjon. CTC er imidlertid ekstremt sjeldne og heterogene i blodet1, noe som gjør det utfordrende å isolere CTC. CTC har lignende egenskaper som de opprinnelige tumorkildene de kommer fra. Dermed spiller CTC en viktig rolle i kreftmetastase1.

Den foreslåtte protokollen tillater en fullstendig analyse av CTC-isolasjon med mikrofluidbrikken. Protokollen inneholder alle de viktigste prosedyrene knyttet til CTC-isolasjon. For eksempel inkluderer denne protokollen RBCL-analyser, som registreres omhyggelig og organiseres i forskjellige pakker, sjeldne tumorcelleoppkjøp, optimal strømningshastighetsbestemmelse, fangsteffektivitet, klinisk karakterisering og oppregning. Den forsiktige styringen av operasjonene letter behandlingen av kliniske pasientprøver. Protokollen tillater forhåndsbehandling og behandling av kliniske pasientprøver og tilbyr viktige tjenester for klinikere.

For CTC-isolasjon er forbehandling av sjeldne tumorceller ekstremt vanskelig å utføre. Denne vanskeligheten ble løst ved å bruke en hul nål trukket gjennom en nåletrekker for å suge 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tumorceller etter ønske. Deretter ble en nær ekte klinisk pasientblodprøve fremstilt med ønsket antall tumorceller blandet inn i normalt blod, som etterlignet en pasientblodprøve. Med disse kunstige pasientblodprøvene ble det utført et nær ekte eksperiment. Denne metoden har løst et vanskelig problem som vanligvis møtes i CTC-isolasjon for pre-eksperimenter. Denne tilnærmingen er ikke lett å utføre og har aldri blitt rapportert andre steder; Det er imidlertid en nyttig tilnærming før du utfører et ekte klinisk eksperiment.

CTC-isolasjon med mikrofluidiske brikker er klassifisert i tre typer: affinitetsbasert, fysisk basert og immunomagnetisk-basert. For affinitetsbasert isolasjon må den mikrofluidiske brikken modifiseres. De spesifikke modifikasjonsprosedyrene er inkludert for modifikasjon med anti-EpCAM. CTCene ble identifisert gjennom immunfluorescensfarging med Hoechst, CK-FITC og CD45-PE. Siden mange tumorceller uttrykker EpCAM, er anti-EpCAM et viktig antistoff for å fange CTC i pasientblod. Imidlertid er anti-EpCAM veldig dyrt; Dermed har mange aptamers blitt utviklet for å løse dette problemet. Vi bruker hovedsakelig fysisk-baserte mikrofluidiske brikker som små ellipsemikrofiltre og trapesformede mikrofiltre for å fange CTC-er, siden de er enkle, enkle å betjene og effektive.

Fordelen med denne teknikken fremfor alternative teknikker er at den fysisk-baserte brikken med store ellipsemikrofiltre fanger CTC med høy fangsteffektivitet. Årsaken til dette er at det er slanke tunneler av linjegap. Bølgebrikker fanger CTC-er ved å kombinere både fysisk eiendomsbasert og affinitetsbasert isolasjon. CTC-ene fanges opp av de små hullene, og de store hullene kan brukes til å akselerere strømningshastigheten. De ubesvarte CTC-ene må passere gjennom de små hullene i de følgende matrisene og fanges også opp av den affinitetsbaserte isolasjonen.

Protokollen har løst flere store problemer i CTC-isolasjon, spesielt for kliniske eksperimenter. Det er imidlertid umulig å inkludere alle detaljerte trinn i CTC-isolasjon, for eksempel angående rollen til nanopartikler og nanostrukturer og aptamermodifikasjon. Disse aspektene spiller også en viktig rolle i CTC-isolasjon. De er imidlertid ikke kritiske for å løse problemer som å forbedre fangsteffektiviteten. I stedet beriker disse aspektene CTC-isolasjonen med nytt innhold.

Dette arbeidet konsentrerer seg om klinisk isolering av CTC med den designede mikrofluidbrikken. De fleste mikrofluidbrikker som brukes er hovedsakelig fysisk-baserte, for eksempel big-ellipse filtre og små-ellipse filtre. Wave chips er laget ved å kombinere både affinitetsbaserte og fysisk-baserte chipegenskaper1. Mikropostene til store ellipsefiltre ble designet for å være kortere for å forbedre fangstrenheten i dette arbeidet. De små ellipsefiltrene kan også forbedres ved å designe dem med varierte mikropoststørrelser for forskjellige arrays. Wave chips kan bedre utformes ved å legge til flere arrays for å forbedre fangsten.

Big-ellipse filtre er organisert med lange elliptiske mikroposter for å danne linjelinjetunneler som oppnår høy fangsteffektivitet. Begrensningen ved denne fangsten er imidlertid at fangstrenheten ikke er høy nok, eller at høy fangstrenhet ikke er lett å oppnå. For bølgebrikke brukes de små hullene til å fange CTC-ene, og de tapte CTC-ene fanges opp av følgende matriser. De store hullene brukes til å akselerere strømningshastigheten og eliminere forstyrrelser fra RBC, og dermed forbedre fangstrenheten; Fangsteffektiviteten er imidlertid solid på over 90% og er reproduserbar.

Klinisk validering er signifikant ved CTC-isolering med mikrovæskebrikker. Dette arbeidet presenterer klinisk isolering av CTC fra kolorektale pasienter med store ellipsefiltre, små ellipsefiltre og bølgebrikker. Målet med de designede mikrofluidiske brikkene er å klinisk oppregne CTC. For eksisterende metoder i enkelte andre systemer eller plattformer er fangsteffektiviteten lav, eller fangsteffektiviteten er ikke høy nok til at metoden kan brukes effektivt i kliniske applikasjoner.

Basert på de kliniske egenskapene til disse tre mikrofluidiske brikkene, som har høy fangsteffektivitet, kan de potensielt brukes i CTC-produkter, spesielt etter modifikasjon. Styrken til protokollen vår er at den demonstrerer oppregningen av sjeldent antall tumorceller for å etterligne virkelige kliniske prøver. I tillegg er den kliniske eksperimentelle prosedyren mulig og praktisk. Denne metoden kan skille CTC fra hele pasientblodet. Derfor er metoden egnet for kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette forskningsarbeidet ble støttet av Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), National Natural Science Foundation of China (21904003), det vitenskapelige forskningsprosjektet til Tianjin Education Commission (2018KJ154), det provinsielle naturvitenskapelige forskningsprogrammet for høyere utdanningsinstitusjoner i Anhui-provinsen (KJ2020A0239), og Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Information Processing Prosessering, East China Normal University (MIP20221).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein AM BIOTIUM 80011
calibrated microcapillary pipettes Sigma- Aldrich P0799
CD45-PE BD Biosciences 560975
CK-FITC BD Biosciences 347653 cytokeratin monoclonal antibody
DMEM HyClone SH30081.05
fetal bovine serum (FBS) GIBCO,USA 26140
Hoechst 33342 Molecular Probes, Solarbio Corp., China C0031
penicillin-streptomycin Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL) Solarbio, Beijing R1010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
  2. World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
  4. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  5. Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
  6. Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
  7. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  8. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  9. Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
  10. Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
  11. Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
  12. Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
  13. Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
  14. Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
  15. Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
  16. Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
  17. Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
  18. Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).

Tags

Bioengineering utgave 200 Mikrofluidisk chip sirkulerende tumorceller (CTC) immunfluorescensidentifikasjon
Klinisk mikrofluidisk chipplattform for isolering av allsidige sirkulerende tumorceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y.,… More

Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y., Wang, S., Jiao, X. Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (200), e64674, doi:10.3791/64674 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter