Summary
De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.
Abstract
Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang bij het bepalen van de ziekte van de patiënt, omdat CTC's zeldzaam en heterogeen zijn. CTC's worden losgemaakt van de primaire tumor, komen in het bloedcirculatiesysteem en groeien mogelijk op verre plaatsen, waardoor de tumor wordt uitgezaaid. Aangezien CTC's vergelijkbare informatie bevatten als de primaire tumor, kunnen CTC-isolatie en daaropvolgende karakterisering van cruciaal belang zijn bij het monitoren en diagnosticeren van kanker. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC's zijn krachtige methoden voor CTC-isolatie omdat ze de noodzakelijke elementen met een hoge gevoeligheid bieden. Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsiemethode die vrij is van pijn voor de patiënten. In dit werk presenteren we een lijst met protocollen voor klinische microfluïdische chips, een veelzijdig CTC-isolatieplatform, dat een reeks functionaliteiten en diensten bevat die nodig zijn voor CTC-scheiding, analyse en vroege diagnose, waardoor biomoleculaire analyse en kankerbehandeling worden vergemakkelijkt. Het programma omvat het tellen van zeldzame tumorcellen, klinische bloedvoorbewerking van patiënten, waaronder rode bloedcellyse, en de isolatie en herkenning van CTC's in situ op microfluïdische chips. Het programma maakt de precieze inventarisatie van tumorcellen of CTC's mogelijk. Daarnaast bevat het programma een tool die CTC-isolatie bevat met veelzijdige microfluïdische chips en immunofluorescentie-identificatie in situ op de chips, gevolgd door biomoleculaire analyse.
Introduction
Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang omdat CTC's zeldzaam en heterogeen zijn. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC's zijn krachtige technieken voor CTC-isolatie omdat ze de nodige elementen met een hoge gevoeligheid bieden1. Zeldzaam aantal tumorcellen gemengd met normaal bloed bootst echt patiëntenbloed nauw na, omdat 2-3 ml echt patiëntenbloed slechts 1-10 CTC's bevat. Om een kritisch experimenteel probleem op te lossen, in plaats van een groot aantal tumorcellen te gebruiken die in PBS zijn geïntroduceerd of gemengd met normaal bloed, biedt het gebruik van een zeldzaam aantal tumorcellen ons een laag aantal bloedcellen, wat dichter bij de realiteit ligt bij het uitvoeren van een experiment.
Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld2. CTC's zijn tumorcellen die worden afgestoten van de oorspronkelijke tumor en die circuleren in het bloed en lymfecirculatiesystemen3. Wanneer CTC's naar een nieuwe overlevingsomgeving verhuizen, groeien ze als een tweede tumor. Dit wordt metastase genoemd en is verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen bij kankerpatiënten4. CTC's zijn van vitaal belang voor de prognose, vroege diagnose en voor het begrijpen van de mechanismen van kanker. CTC's zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed van de patiënt 5,6.
Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsie die de tumor niet binnendringt. Ze hebben het voordeel dat ze draagbaar zijn, goedkoop zijn en een op cellen afgestemde schaal hebben. De isolatie van CTC's met microfluïdische chips wordt voornamelijk ingedeeld in twee soorten: affiniteitsgebaseerd, dat afhankelijk is van antigeen-antilichaambinding 7,8,9 en de oorspronkelijke en meest gebruikte methode van CTC-isolatie is; en fysieke chips, die gebruik maken van grootte- en vervormbaarheidsverschillen tussen tumorcellen en bloedcellen 10,11,12,13,14,15, zijn labelvrij en eenvoudig te bedienen. Het voordeel van microfluïdische chips ten opzichte van alternatieve technieken is dat de fysische benadering van big-ellips microfilters CTC's stevig vangt met een hoge opname-efficiëntie. De reden hiervoor is dat ellipsmicroposten zijn georganiseerd in slanke tunnels van lijnspleten. De lijnspleten verschillen van de traditionele puntpuntspleten gevormd door microposten zoals ruitmicroposten. Wave-chip-gebaseerde opname van CTC's combineert zowel fysieke eigenschapsgebaseerde als affiniteitsgebaseerde isolatie. Golfchip-gebaseerde opname omvat 30 golfvormige arrays met het antilichaam van anti-EpCAM gecoat op cirkelvormige microposts. De CTC's worden opgevangen door de kleine openingen en de grote openingen worden gebruikt om het debiet te versnellen. De gemiste CTC's moeten de kleine openingen in de volgende array passeren en worden opgevangen door de op affiniteit gebaseerde isolatie die in de chip16 is geïntegreerd.
Het doel van het protocol is om het tellen van zeldzame aantallen tumorcellen en de klinische analyse van CTC's met microfluïdische chips aan te tonen. Het protocol beschrijft de CTC-isolatiestappen, hoe een laag aantal tumorcellen te verkrijgen, de klinische fysieke scheiding van kleine ellipsfilters, grote-ellipsfilters en trapeziumfilters, affiniteitsmodificatie en verrijking17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloedmonsters van patiënten werden geleverd door Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Medical University.The protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het Peking University Third Hospital. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten voor het gebruik van de monsters voor onderzoeksdoeleinden.
1. Pre-experiment om de vangstefficiëntie met gekweekte tumorcellen te controleren
- Kweek de tumorcellen MCF-7, MDA-MB-231 en HeLa voor het bepalen van de vangstefficiëntie. Verdun de tumorcelsuspensie, tel het aantal tumorcellen en herhaal dit totdat het gewenste aantal cellen in 1 ml PBS is verkregen.
- Kweek de cellen in een celkweekkolf met een startcelnummer van ~ 1 x 105 cellen in 1 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C met een 5% CO 2-atmosfeer.
- Wanneer de cellijnen groeien als hechtende monolagen tot 95% samenvloeiing, maak ze dan los van de kweekschalen met 0,25% trypsine-oplossing gedurende 2 minuten zoals beschreven in Chen et al.16.
- Kleuring de tumorcellen met calceïne AM. Doe 3 μL calceïne AM in de kweekschaal en bewaar de schaal 30 minuten in de couveuse. Verwerk vervolgens alle cellen met trypsine.
- Tel de gekweekte tumorcellen in PBS met een celtelkamer en verdun tot 100 tumorcellen per 1 ml PBS zijn verkregen.
OPMERKING: Om het celnummer nauwkeurig op te sommen, neemt u 50 μL van de verkregen celsuspensie om te zien of het aantal tumorcellen daarin vijf is of niet met een microscoop. Bepaal het volume van de celsuspensie dat moet worden genomen om 100 tumorcellen te verkrijgen op basis van het werkelijke aantal tumorcellen in 50 μL celsuspensie.
- Breng de celsuspensie met 100 tumorcellen per 1 ml PBS in de microfluïdische chip met behulp van een spuit met een spuitpomp met verschillende stroomsnelheden van 0,5 ml / h, 1 ml / h, 2 ml / h, 3 ml / h, 4 ml / h en 5 ml / h. Verkrijg de opvangefficiëntie voor de verschillende stroomsnelheden en bepaal het optimale debiet.
- Tel het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen en uit de uitlaat stroomt. Bereken de opname-efficiëntie zoals hieronder:
Capture efficiency = Aantal gevangen cellen/(Aantal gevangen cellen + aantal cellen dat uitstroomt) × 100% - Herhaal dit om de vangstefficiëntie te verkrijgen voor verschillende aantallen tumorcellen van 10 tot 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
- Tel het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen en uit de uitlaat stroomt. Bereken de opname-efficiëntie zoals hieronder:
- Test en valideer de microfluïdische chip op zeldzame aantallen tumorcellen. Injecteer deze 10 monstersuspensies in de microfluïdische chips met behulp van een holle naald gemaakt met een micropipettrekker om 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 tumorcellen verdund in 1 ml PBS te zuigen. Detecteer en inventariseer het aantal tumorcellen voor elk monster na hun vangst op de chip.
OPMERKING: De holle naald is ongeveer 3 cm lang met een uitwendige diameter van 1 mm. - Voer klinische pre-experimentele tests uit voor tumorcellen die in normale bloedmonsters zijn geprikt.
- Kleurt de tumorcellen met calceïne AM en inventariseer vervolgens 100 tumorcellen in 5 μL PBS. Spike deze cellen in 1 ml van hele normale bloedmonsters. Introduceer deze cellen in de chip en noteer het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen met groene immunofluorescentie. Voer in vivo opsomming uit op de chip zoals hierboven beschreven en bereken de opname-efficiëntie na het vastleggen.
- Herhaal stap 1.4.1 voor negen extra concentraties van tumorcelnummers van 10 tot 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- Som 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 tumorcellen op zoals beschreven in stap 1.3 zonder kleuring, piek in 1 ml volledig normaal bloed, breng deze monsters in de microfluïdische chip en vang de tumorcellen op de chip.
- Beits op de chip met Hoechst, CK-FITC en CD45-PE. Doe 3-5 μL fluorescerende kleurstof in 20-30 μL PBS en breng deze oplossing vervolgens met een spuit op de microfluïdische chip in. Inventariseer het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen met zowel blauwe als groene immunofluorescentie om de vangstefficiëntie te bepalen.
- Voer modificatie van de microfluïdische chip uit voor de op affiniteit gebaseerde opname van anti-EpCAM.
OPMERKING: Aangezien de golfchip zowel op affiniteit gebaseerde als op fysieke eigenschappen gebaseerde isolatie combineert, moet u de chip aanpassen met agents.- Wijzig het oppervlak van de chip met 100 μL van 4% (v/v) 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan in ethanol bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Breng deze oplossing voorzichtig en langzaam in de chip in voor het geval het de interne structuur van de chip vernietigt, met name de verlijming van het bovenoppervlak en het substraatglas.
OPMERKING: Het chipoppervlak wordt aangepast met mercaptosilaan. De interacties die op de chip plaatsvinden, worden bepaald door chemische bindingen. Chemische bindingen worden vastgesteld om de binding van het antilichaam gemodificeerd met het antigeen te realiseren. Verschillende reagentia worden in de chip gemodificeerd om chemische bindingen tot stand te brengen die met elkaar verbinden. Het laatste reagens dat moet worden gemodificeerd is een anti-epitheliaal adhesiemolecuul (anti-EpCAM). Het antigeen van het tumorceloppervlak van EpCAM combineert met anti-EpCAM in de chip om de vangst van de CTC's te realiseren. - Wassen met ethanol 3x. Voeg 100 μL van het koppelmiddel N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide-ester (GMBS, 1 μM) toe aan de chip en laat het gedurende 30 minuten interageren.
- Wassen met PBS 3x. Gebruik een spuit om 1 ml PBS op de chip te brengen om te wassen.
- Behandel de chip met 30-40 μL van 10 μg / ml neutravidine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, wat leidt tot immobilisatie van de cellen op de GMBS, en spoel vervolgens met PBS om overtollig avidine te verwijderen.
- Wijzig de chip met 3 μL anti-gebiotinyleerd EpCAM-antilichaam in een concentratie van 10 μg/ml in 100 μL PBS met 1% (w/v) BSA. Bewaar dit een nacht.
- Wijzig het oppervlak van de chip met 100 μL van 4% (v/v) 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan in ethanol bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Breng deze oplossing voorzichtig en langzaam in de chip in voor het geval het de interne structuur van de chip vernietigt, met name de verlijming van het bovenoppervlak en het substraatglas.
2. Klinisch experiment op de chip om de circulerende tumorcellen (CTC's) op te sommen
- Voorverwerk klinische bloedmonsters van kankerpatiënten met behulp van red blood cells lysis (RBCL) -oplossing, of breng 2-3 ml van het bloedmonster rechtstreeks op de microfluïdische chip met behulp van een spuit.
- Voer voorbewerking uit, die ongeveer 30 minuten duurt. Verzamel volbloedmonsters in antistollingsbuizen. Voeg 6-9 ml RBS-lysisoplossing toe aan 2-3 ml bloed. Centrifugeer op 111 x g gedurende 5-8 minuten bij kamertemperatuur en gooi de bovenste laag rode heldere vloeistof weg.
- Vang, beits, herken en inventariseer de cellen op de chip zoals hieronder beschreven.
- Leg de cellen op de chip vast zoals beschreven in stap 1.Beits de chip voor de CTC's die zijn vastgelegd met Hoechst, CK-FITC en CD45-PE. CK-FITC is een specifieke kleuring voor tumorcellen en CD45-PE is voor witte bloedcellen.
- Voeg 3 μL CK-FITC toe aan 20 μL PBS. Breng dit in de spuit en pomp de verdunde CK-FITC op de chip. Laat 30 minuten inkoken. Breng 300 μL PBS op de chip om de chip te wassen.
- Voeg 3 μL CD45-PE toe aan 20 μL PBS. Breng dit in de spuit en pomp de verdunde CD45-PE op de chip. Laat 30 min staan. Breng 300 μL PBS op de chip om de chip te wassen.
- Identificeer de CTC's met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 20x of 40x. CTC's zenden zowel blauwe als groene fluorescentie uit en witte bloedcellen (WBC's) zenden zowel blauwe als rode fluorescentie uit. Identificeer de CTC's met zowel blauwe als groene fluorescentie en de WBC's met zowel blauwe als rode fluorescentie.
- Van de immunofluorescentiebeelden wordt het aantal CTC's opgesomd dat op de chip is vastgelegd. Somt de CTC's op als Hoechst+/CK-FITC+/CD45− en de WBC's als Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
- Verrijk de opgevangen CTC's door met PBS door de spuit in omgekeerde richting op de microfluïdische chip te spoelen om de CTC's die op de chip zijn gevangen uit de inlaat te verzamelen. Gebruik een spuit met 1 ml PBS, breng deze uit de uitlaat om de CTC's die op de chip zijn vastgelegd binnen 2-3 minuten te verrijken en verzamel ze uit de inlaat. Gebruik 1 ml PBS voor elke wasstap en herhaal dit 3x.
- Kleuring de tumorcellen of CTC's gevangen op de microfluïdische chip zoals hieronder beschreven.
- Beits met calceïne AM. Voeg 5 μL calceïne AM toe aan 20 μL PBS, kleurt de cellen gedurende 30 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten bij 111 x g bij kamertemperatuur om tumorcellen te verkrijgen en suspensie in 1 ml PBS.
- Om de cellulaire kernen te identificeren, voegt u 20 μL DAPI-oplossing (10 μL DAPI-reagens in 20 μL PBS) toe aan de chip met een optimale stroomsnelheid van 1 ml / h voor microfilters met grote ellips en 1,5 ml / h voor trapezoïde microfilters. Passeer 20 μL anti-cytokeratine stockoplossing (3 μL anti-cytokeratine antilichaam in 20 μL PBS) om gedurende 30 minuten met de chip te reageren.
- Bevlek de WBC's die op de chip zijn vastgelegd. Nadat de CTC's op de chip zijn vastgelegd, voegt u 25 μL anti-CD45-antilichaamoplossing (5 μL anti-CD45-oplossing in 20 μL PBS) toe aan de chip en laat u deze gedurende 30 minuten kleuren. Was met PBS en identificeer de epitheelcellen met zowel blauwe als groene fluorescentie.
- Voer immunofluorescentie-identificatie uit met fluorescentiemicroscopie zoals hieronder beschreven.
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop en prikkel het monster met de blauwe laser. Zoek de cellen die blauwe fluorescentie uitzenden, die nucleaatcellen zijn. Gebruik een van de volgende vergrotingen: 10x, 20x of 40x. Zoek een duidelijk veld voor de tumorcel. Gebruik voor de blauwe laserbron een excitatieplaatgolflengte van 420-485 nm en een emissieplaatgolflengte van 515 nm.
- Gebruik zonder de monsters te verplaatsen een andere laserbron. Draai de fluorescentiemicroscoop en prikkel het monster met de groene laser. Zoek de cellen die groene fluorescentie uitzenden, wat wijst op tumorcellen. Maak foto's van hetzelfde veld met dezelfde vergroting met deze groene laserbron. De cellen die zowel blauwe als groene fluorescentie uitzenden, worden herkend als tumorcellen. Gebruik voor de groene laserbron een excitatieplaatgolflengte van 460-550 nm en een emissieplaatgolflengte van 590 nm
- Gebruik zonder de monsters te verplaatsen een andere laserbron. Draai de fluorescentiemicroscoop en prikkel het monster met de rode laser. Zoek de cellen die rode fluorescentie uitzenden. Maak foto's van hetzelfde veld met dezelfde vergroting met deze rode laserbron. De cellen die zowel blauwe als rode fluorescentie uitzenden, worden herkend als witte bloedcellen.
- Sla de afbeelding op voor verkregen met behulp van elk van de bovenstaande laserbronnen. Maak verschillende foto's van hetzelfde veld met verschillende gekleurde lichten.
- Gebruik ultraviolet licht met een excitatieplaatgolflengte van 330-400 nm en een emissieplaatgolflengte van 425 nm. Gebruik paars licht met een excitatieplaatgolflengte van 395-415 nm en een emissieplaatgolflengte van 455 nm.
- Bereken de opname-efficiëntie zoals in stap 1.2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hele installatie omvat een spuitpomp, een spuit en een microfluïdische chip. De celsuspensie in de spuit is verbonden met de spuitpomp en de celsuspensie wordt in de microfluïdische chip gebracht om de cellen op te vangen. De opname-efficiëntie voor alle gebruikte microfluïdische chips was ongeveer 90% of hoger. Voor de golfchip ontwierpen we microstructuren met gevarieerde openingen. De kleine openingen worden gebruikt om de CTC's op te vangen en de grote openingen worden gebruikt om de stroomsnelheid te versnellen. De celophanging stroomt snel in de grote spleetgebieden. De gemiste CTC's worden meestal opgevangen door de kleine openingen in de volgende array16. Voor ellipschips hebben we lijnspleten ontworpen in plaats van puntpuntopeningen om een slanke tunnel te vormen om de opname te verbeteren. Daarom werd een hoge opname-efficiëntie bereikt1. We hebben een ellipsstructuur ontworpen om randen en hoeken te vermijden om de levensvatbaarheid te behouden. De trapeziumfilters hebben twee cirkelvormige spiraalkanalen met ingebedde trapezium- en cirkelvormige micropostbarrières. Voor trapeziumfilters waren de opname-efficiënties voor MCF-7, MDA-MB-231 en HeLa respectievelijk 94%, 95% en 93%18.
Figuur 1 laat zien dat alle tumorcellen werden opgevangen door de golfchip. Aangezien alle tumorcellen geconcentreerd waren rond de wave micropost array, duidt dit op een hoge vangstefficiëntie voor deze microfluïdische chip, zoals blijkt uit het aantal tumorcellen dat werd gevangen. Daarom maakt deze opstelling het veel gemakkelijker om zeldzame tumorcellen te vangen; Inderdaad, de chip is gefabriceerd om een groot aantal tumorcellen en een zeldzaam aantal tumorcellen te vangen. Als de chip bijvoorbeeld solide of reproduceerbaar genoeg is om 10.000 tumorcellen te vangen, is het gemakkelijk voor de chip om 10-100 cellen te vangen. Video 1 laat zien hoe zeldzaam aantal tumorcellen werd verkregen voor het pre-experiment. Een holle naald gemaakt met behulp van een micropipettrekker werd gebruikt om 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 tumorcellen te aspireren uit een kweekschaal met verdunde tumorcellen gekleurd met calceïne AM in PBS. De cellen werden geabsorbeerd door de silicagelbuis die verbonden was met de holle naald. Een tumorcel met groene immunofluorescentie werd in de holle naald gezogen. Blazen in de holle buis leidde ertoe dat de tumorcel in de holle naald werd geloosd in een microcentrifugebuis1. Dit is de procedure om zeldzame tumorcellen te verkrijgen. Figuur 2 toont CTC's van een maagkankerpatiënt gevangen met behulp van microfilters met kleine ellipvormen. Figuur 3 toont de CTC's van een colorectale kankerpatiënt gevangen met trapeziummicrofilters en die zowel blauwe als groene fluorescentie uitzenden. Figuur 4 toont tumorcellen die na vangst op de chip zijn gegroeid en die klaar zijn om te worden behandeld met geneesmiddelen tegen kanker. Deze bevindingen illustreren dat microfilters met grote ellips geen negatieve effecten hebben op de levensvatbaarheid van cellen.
Figuur 5 toont de klinische immunofluorescentieanalyse van colorectale CTC's gevangen op de microfluïdische chip. Deze worden gezien in brightfield en gekleurd met Hoechst, CK-FITC en CD45-PE kleuring. De CTC's werden herkend als DAPI+/CK+/CD45−, en de WBC's werden geïdentificeerd als DAPI+/CK−/CD45+. Figuur 6 toont colorectale tumorcellen gekweekt op de big-ellipse chip na vangst. Figuur 7 toont colorectale tumorcellen gevangen op de big-ellipse microfilters. Klinisch werden CTC's in het bloed van patiënten opgevangen door golfchips, trapezoïde microfilters en microfilters met grote ellipsen, wat aangeeft dat deze drie chips succesvol zijn in het vangen van CTC's. Mogelijk kunnen ze worden toegepast in CTC-producten, zoals CTC-isolatieproducten, met een hoge efficiëntie.
Figuur 1: Wave chip capture. Alle tumorcellen van MCF-7 werden gevangen rond de array van de golfchip zonder dat er cellen ontbraken. Aangezien er geen tumorcellen in een ander gebied dan de array waren, duidt dit op de hoge opname-efficiëntie van de chip. Een groot aantal tumorcellen werd gevangen. Daarom kunnen zeldzame tumorcellen ook gemakkelijk worden gevangen. Tumorcellen van MCF-7 werden gevangen door golfchip en (A) gekleurd met Hoechst en (B) gekleurd met calceïne AM. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Klinisch monster voor CTC's gevangen door microfilters met kleine ellipsen. Klinische CTC's van een maagkankerpatiënt opgevangen door microfilters met kleine ellipsen. De CTC's werden geïdentificeerd in brightfield en met zowel blauwe als groene fluorescentie. De blauwe cirkel in (A) geeft een CTC aan van een maagkankerpatiënt gevangen in de chip. Uit de gemaakte foto's is te zien dat er geen andere cellen in andere gebieden waren, wat aangeeft dat de opnamezuiverheid hoog was voor deze chip. Tumorcellen van MCF-7 werden gevangen door microfilters met kleine ellips en gezien in (A) brightfield, (B) gekleurd met Hoechst en (C) gekleurd met CK-FITC. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Klinisch monster van CTC's gevangen door trapeziummicrofilters. Klinische CTC's van een colorectale kankerpatiënt werden opgevangen door trapezoïde microfilters. Op deze beelden is te zien dat er zes CTC's zijn vastgelegd, wat aangeeft dat de opname-efficiëntie hoog was in het kleine veld. Bovendien verschenen er geen andere cellen, wat aangeeft dat de vangzuiverheid extreem hoog was voor deze chip. Tumorcellen van MCF-7 werden gevangen door trapeziummicrofilters en gezien in (A) brightfield, (B) gekleurd met Hoechst en (C) gekleurd met CK-FITC. Schaalbalk: 20 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kweek van CTC's gevangen door microfilters met grote ellipsen. Tumorcellen van MCF-7 werden gevangen door big-ellipse microfilters voor een big-ellipse micropost array. Er zijn geen tumorcellen door de array gegaan, wat wijst op een hoge opname-efficiëntie voor deze chip. Na vangst groeiden de tumorcellen gedurende 24-48 uur. Dit geeft aan dat zowel de afvangefficiëntie als de levensvatbaarheid zeer hoog waren voor de microfilters met grote ellipsen. De gekweekte tumorcellen van MCF-7 werden gevangen door big-ellipse microfilters en gezien op (A) 0 h na vangst, (B) 24 h na vangst en (C) 48 h na vangst. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeld van een klinisch monster dat wordt gebruikt voor CTC-vangst door trapeziummicrofilters. Klinische CTC's van een colorectale kankerpatiënt werden opgevangen door trapezoïde microfilters. Op deze afbeeldingen is te zien dat er twee CTC's zijn vastgelegd, wat wijst op een hoge opname-efficiëntie. Er was geen andere celverstoring behalve residuen van RBC's in de chip. Voor de klinische voorbewerking van CTC-vangst is het dus beter om geen rode bloedcellyse te gebruiken. CTC's van colorectale kanker werden gevangen door trapeziummicrofilters en gezien in (A) brightfield, (B) gekleurd met Hoechst, (C) gekleurd met CK-FITC en (D) gezien in samengevoegde afbeeldingen. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeld van gekweekte CTC's gevangen door een big-ellipse chip. Tumorcelculturen van MCF-7-cellen voor de big-ellipse micropost array en achter de big-ellipse microfilters. De tumorcellen gekleurd met calceïne AM die groene fluorescentie uitzenden, groeiden naar wens, wat aangeeft dat de levensvatbaarheid van de cel voor deze chip zeer hoog was. In totaal waren er 15 arrays, met gevarieerde openingen voor elke array georganiseerd door big-ellipse microposts. MCF-7 tumorcellen werden gekweekt op de big-ellipse chip na vangst (A) in de ene array en (B) in een andere array. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Voorbeeld van een klinisch monster dat wordt gebruikt voor CTC-vangst door microfilters met grote ellipsen. Klinische CTC's van een colorectale kankerpatiënt werden opgevangen door microfilters met grote ellipsen. Op de beelden is te zien dat er sprake was van RBC-besmetting. Dit geeft aan dat het bloedmonster van de hele patiënt moet worden verdund en dat de chip na het vangen moet worden gespoeld. CTC's van bloedmonsters van klinische colorectale kankerpatiënten werden gevangen op de big-ellipse chip en gezien in (A) brightfield, (B) gekleurd met Hoechst en (C) gekleurd met CK-FITC. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De prognose en vroege diagnose van kanker hebben een significant effect op de behandeling van kanker1. CTC-isolatie met microfluïdische chips biedt een vloeibare biopsie zonder invasie. CTC's zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed1, wat het een uitdaging maakt om CTC's te isoleren. CTC's hebben vergelijkbare eigenschappen als de oorspronkelijke tumorbronnen waaruit ze afkomstig zijn. CTC's spelen dus een vitale rol bij kankermetastase1.
Het voorgestelde protocol maakt een volledige analyse van CTC-isolatie met de microfluïdische chip mogelijk. Het protocol bevat alle belangrijke procedures met betrekking tot CTC-isolatie. Dit protocol omvat bijvoorbeeld RBCL-analyses, die zorgvuldig worden vastgelegd en georganiseerd in verschillende pakketten, zeldzame tumorcelacquisitie, optimale stroomsnelheidsbepaling, opname-efficiëntie, klinische karakterisering en inventarisatie. Het zorgvuldige beheer van de operaties vergemakkelijkt de verwerking van klinische patiëntmonsters. Het protocol maakt de voorbewerking en verwerking van klinische patiëntmonsters mogelijk en biedt essentiële diensten voor clinici.
Voor CTC-isolatie is de voorbewerking van zeldzame tumorcellen uiterst moeilijk uit te voeren. Dit probleem werd opgelost door met behulp van een holle naald die door een naaldtrekker werd getrokken om 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 tumorcellen naar wens te zuigen. Vervolgens werd een bijna echt klinisch bloedmonster van de patiënt voorbereid met het gewenste aantal tumorcellen gemengd in normaal bloed, waarbij een bloedmonster van een patiënt werd nagebootst. Met deze kunstmatige bloedmonsters van patiënten werd een bijna echt experiment uitgevoerd. Deze methode heeft een moeilijk probleem opgelost dat meestal wordt ondervonden in CTC-isolatie voor pre-experimenten. Deze aanpak is niet eenvoudig uit te voeren en is nooit elders gemeld; het is echter een nuttige aanpak voordat u een echt klinisch experiment uitvoert.
CTC-isolatie met microfluïdische chips is ingedeeld in drie typen: affiniteitsgebaseerd, fysiek gebaseerd en immunomagnetisch. Voor op affiniteit gebaseerde isolatie moet de microfluïdische chip worden aangepast. De specifieke wijzigingsprocedures zijn opgenomen voor wijziging met anti-EpCAM. De CTC's werden geïdentificeerd door immunofluorescentiekleuring met Hoechst, CK-FITC en CD45-PE. Omdat veel tumorcellen EpCAM tot expressie brengen, is anti-EpCAM een belangrijk antilichaam om CTC's in het bloed van de patiënt te vangen. Anti-EpCAM is echter erg duur; Er zijn dus veel aptameren ontwikkeld om dit probleem op te lossen. We gebruiken voornamelijk fysiek gebaseerde microfluïdische chips zoals microfilters met kleine ellips en trapeziummicrofilters om CTC's op te vangen, omdat ze eenvoudig, gemakkelijk te bedienen en effectief zijn.
Het voordeel van deze techniek ten opzichte van alternatieve technieken is dat de fysieke chip van big-ellipse microfilters CTC's stevig vangt met een hoge opname-efficiëntie. De reden hiervoor is dat er smalle tunnels van lijnspleten zijn. Golfchips vangen CTC's op door zowel op fysieke eigenschappen gebaseerde als op affiniteit gebaseerde isolatie te combineren. De CTC's worden opgevangen door de kleine openingen en de grote openingen kunnen worden gebruikt om de stroomsnelheid te versnellen. De gemiste CTC's moeten door de kleine openingen in de volgende arrays en worden ook opgevangen door de op affiniteit gebaseerde isolatie.
Het protocol heeft een aantal grote problemen in CTC-isolatie opgelost, vooral voor klinische experimenten. Het is echter onmogelijk om elke gedetailleerde stap in CTC-isolatie op te nemen, zoals met betrekking tot de rol van nanodeeltjes en nanostructuren en aptamermodificatie. Deze aspecten spelen ook een essentiële rol bij CTC-isolatie. Ze zijn echter niet van cruciaal belang bij het oplossen van problemen zoals het verbeteren van de opname-efficiëntie. In plaats daarvan verrijken deze aspecten de CTC-isolatie met nieuwe inhoud.
Dit werk concentreert zich op de klinische isolatie van CTC's met de ontworpen microfluïdische chip. De meeste microfluïdische chips die worden gebruikt, zijn voornamelijk fysiek gebaseerd, zoals filters met grote ellips en filters met kleine ellipsen. Golfchips worden gemaakt door zowel op affiniteit gebaseerde als op fysica gebaseerde chipeigenschappen te combineren1. De microposten van filters met grote ellips zijn ontworpen om korter te zijn om de opnamezuiverheid in dit werk te verbeteren. De filters met kleine ellips kunnen ook worden verbeterd door ze te ontwerpen met verschillende micropostformaten voor verschillende arrays. Wave-chips kunnen beter worden ontworpen door meer arrays toe te voegen om de opname te verbeteren.
Big-ellipsfilters zijn georganiseerd met lange elliptische microposten om lijntunnels te vormen die een hoge opname-efficiëntie bereiken. De beperking van deze vangst is echter dat de vangzuiverheid niet hoog genoeg is of dat een hoge vangzuiverheid niet gemakkelijk te verkrijgen is. Voor golfchips worden de kleine openingen gebruikt om de CTC's vast te leggen en de gemiste CTC's worden opgevangen door de volgende arrays. De grote openingen worden gebruikt om de stroomsnelheid te versnellen en verstoring door RBC's te elimineren, waardoor de vangzuiverheid wordt verbeterd; De opname-efficiëntie is echter solide met meer dan 90% en is reproduceerbaar.
Klinische validatie is significant in CTC-isolatie met microfluïdische chips. Dit werk presenteert de klinische isolatie van CTC's van colorectale patiënten met grote-ellipsfilters, kleine ellipsfilters en golfchips. Het doel van de ontworpen microfluïdische chips is om CTC's klinisch op te sommen. Voor de bestaande methoden van sommige andere systemen of platforms is de opname-efficiëntie laag of is de afvangefficiëntie niet hoog genoeg om de methode effectief te gebruiken in klinische toepassingen.
Op basis van de klinische prestaties van deze drie microfluïdische chips, die een hoge opname-efficiëntie hebben, kunnen ze mogelijk worden toegepast in CTC-producten, vooral na modificatie. De kracht van ons protocol is dat het de opsomming van een zeldzaam aantal tumorcellen aantoont om echte klinische monsters na te bootsen. Bovendien is de klinische experimentele procedure haalbaar en praktisch. Deze methode kan CTC's scheiden van het bloed van de patiënt. Daarom is de methode geschikt voor klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), de National Natural Science Foundation of China (21904003), het Scientific Research Project van Tianjin Education Commission (2018KJ154), het Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) en het Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Verwerking, East China Normal University (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
