Summary
Det kliniska mikrofluidiska chipet är en viktig biomedicinsk analysteknik som förenklar förbehandling av blodprov från kliniska patienter och immunofluorescerande fläckar cirkulerande tumörceller (CTC) in situ på chipet, vilket möjliggör snabb upptäckt och identifiering av en enda CTC.
Abstract
Cirkulerande tumörceller (CTC) är signifikanta i cancerprognos, diagnos och anti-cancerbehandling. CTC-uppräkning är avgörande för att bestämma patientens sjukdom eftersom CTC är sällsynta och heterogena. CTC lossnar från den primära tumören, går in i blodcirkulationssystemet och växer potentiellt på avlägsna platser, vilket metastaserar tumören. Eftersom CTC bär liknande information som den primära tumören kan CTC-isolering och efterföljande karakterisering vara avgörande för övervakning och diagnos av cancer. Räkning, affinitetsmodifiering och klinisk immunofluorescensfärgning av sällsynta CTC är kraftfulla metoder för CTC-isolering eftersom de ger de nödvändiga elementen med hög känslighet. Mikrofluidiska chips erbjuder en flytande biopsimetod som är fri från smärta för patienterna. I detta arbete presenterar vi en lista över protokoll för kliniska mikrofluidikchips, en mångsidig CTC-isoleringsplattform, som innehåller en uppsättning funktioner och tjänster som krävs för CTC-separation, analys och tidig diagnos, vilket underlättar biomolekylär analys och cancerbehandling. Programmet inkluderar sällsynt tumörcellräkning, klinisk förbehandling av patientblod, vilket inkluderar rödblodslys och isolering och igenkänning av CTC in situ på mikrofluidiska chips. Programmet möjliggör exakt uppräkning av tumörceller eller CTC. Dessutom innehåller programmet ett verktyg som innehåller CTC-isolering med mångsidiga mikrofluidiska chips och immunofluorescensidentifiering in situ på chipsen, följt av biomolekylär analys.
Introduction
Cirkulerande tumörceller (CTC) är signifikanta i cancerprognos, diagnos och anti-cancerbehandling. CTC-uppräkning är avgörande eftersom CTC är sällsynta och heterogena. Räkning, affinitetsmodifiering och klinisk immunofluorescensfärgning av sällsynta CTC är kraftfulla tekniker för CTC-isolering eftersom de erbjuder de nödvändiga elementen med hög känslighet1. Sällsynt antal tumörceller blandade med normalt blod efterliknar nära riktigt patientblod eftersom 2-3 ml verkligt patientblod endast innehåller 1-10 CTC. För att lösa ett kritiskt experimentellt problem, istället för att använda ett stort antal tumörceller införda i PBS eller blandat med normalt blod, ger användningen av sällsynt antal tumörceller oss ett lågt antal blodkroppar, vilket är närmare verkligheten när man utför ett experiment.
Cancer är den främsta dödsorsaken i världen2. CTC är tumörceller som kastas från den ursprungliga tumören som cirkulerar i blodet och lymfcirkulationssystemen3. När CTC flyttar till en ny överlevnadsmiljö växer de som en andra tumör. Detta kallas metastaser och är ansvarig för 90% av dödsfallen hos cancerpatienter4. CTC är avgörande för prognos, tidig diagnos och för att förstå mekanismerna för cancer. CTC är dock extremt sällsynta och heterogena i patientblod 5,6.
Mikrofluidiska chips erbjuder en flytande biopsi som inte invaderar tumören. De har fördelen av att vara bärbara, låga kostnader och ha en cellmatchad skala. Isoleringen av CTC med mikrofluidiska chips klassificeras huvudsakligen i två typer: affinitetsbaserad, som bygger på antigen-antikroppsbindning 7,8,9 och är den ursprungliga och mest använda metoden för CTC-isolering; och fysikaliskt baserade chips, som utnyttjar storleks- och deformerbarhetsskillnader mellan tumörceller och blodceller 10,11,12,13,14,15, är etikettfria och är lätta att använda. Fördelen med mikrofluidiska chips jämfört med alternativa tekniker är att det fysikaliska tillvägagångssättet för stora ellipsmikrofilter fångar CTC med hög infångningseffektivitet. Anledningen till detta är att ellipsmikrostolpar är organiserade i smala tunnlar av linjelinjegap. Linjelinjegapen skiljer sig från de traditionella punktpunktsgapen som bildas av mikrostolpar som rombmikrostolpar. Vågchipbaserad infångning av CTC kombinerar både fysisk egenskapsbaserad och affinitetsbaserad isolering. Vågchipbaserad fångst involverar 30 vågformade matriser med antikroppen av anti-EpCAM belagd på cirkulära mikrostolpar. CTC: erna fångas upp av de små luckorna, och de stora luckorna används för att påskynda flödeshastigheten. De missade CTC: erna måste passera de små luckorna i nästa matris och fångas av den affinitetsbaserade isoleringen integrerad inuti chip16.
Målet med protokollet är att demonstrera räkning av sällsynt antal tumörceller och klinisk analys av CTC med mikrofluidiska chips. Protokollet beskriver CTC-isoleringsstegen, hur man erhåller ett lågt antal tumörceller, den kliniska fysiska separationen av små ellipsfilter, stora ellipsfilter och trapetsfilter, affinitetsmodifiering och anrikning17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientens blodprover levererades av Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Medical University.Protokollet följer riktlinjerna från Peking University Third Hospital's human research ethics committee. Informerat samtycke erhölls från patienterna för att använda proverna för forskningsändamål.
1. Förexperiment för att kontrollera infångningseffektiviteten med odlade tumörceller
- Odla tumörcellerna MCF-7, MDA-MB-231 och HeLa för att bestämma infångningseffektiviteten. Späd tumörcellssuspensionen, räkna antalet tumörceller och upprepa tills önskat antal celler i 1 ml PBS erhålls.
- Odla cellerna i en cellodlingskolv med ett startcellantal på ~ 1 x 105 celler i 1 ml av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin. Inkubera i befuktad atmosfär vid 37 °C med 5 %CO2-atmosfär .
- När cellinjerna växer som vidhäftande monolager till 95% sammanflöde, lossa dem från odlingsskålarna med 0,25% trypsinlösning i 2 minuter enligt beskrivningen i Chen et al.16.
- Färga tumörcellerna med calcein AM. Lägg 3 μL calcein AM i odlingsskålen och förvara skålen i inkubatorn i 30 minuter. Sedan,smälta alla celler med trypsin.
- Räkna de odlade tumörcellerna i PBS med en cellräkningskammare och späd tills 100 tumörceller per 1 ml PBS erhålls.
OBS: För att exakt räkna upp cellnummer, ta 50 μL av den erhållna cellsuspensionen för att se om antalet tumörceller i den är fem eller inte med ett mikroskop. Bestäm volymen av cellsuspension som måste tas för att erhålla 100 tumörceller enligt det faktiska antalet tumörceller i 50 μL cellsuspension.
- För in cellsuspensionen innehållande 100 tumörceller per 1 ml PBS i mikrofluidikchipet med en spruta med en sprutpump vid varierande flödeshastigheter på 0,5 ml / h, 1 ml / h, 2 ml / h, 3 ml / h, 4 ml / h och 5 ml / h. Erhåll infångningseffektiviteten för de olika flödeshastigheterna och bestäm den optimala flödeshastigheten.
- Räkna antalet tumörceller som fångas på chipet och strömmar ut från utloppet. Beräkna fångsteffektiviteten enligt nedan:
Fångsteffektivitet = Antal fångade celler / (Antal fångade celler + antal celler som flyter ut) × 100% - Upprepa för att få fångsteffektiviteten för olika antal tumörceller från 10 till 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
- Räkna antalet tumörceller som fångas på chipet och strömmar ut från utloppet. Beräkna fångsteffektiviteten enligt nedan:
- Testa och validera det mikrofluidiska chipet för sällsynt antal tumörceller. Injicera dessa 10 provsuspensioner i mikrofluidikchipsen med en ihålig nål gjord med en mikropipettdragare för att aspirera 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10 tumörceller utspädda i 1 ml PBS. Upptäck och räkna upp antalet tumörceller för varje prov efter att de fångats på chipet.
OBS: Den ihåliga nålen är cirka 3 cm lång med en ytterdiameter på 1 mm. - Utför klinisk pre-experimentell testning för tumörceller spikade i normala blodprover.
- Färga tumörcellerna med calcein AM och räkna sedan upp 100 tumörceller i 5 μL PBS. Spike dessa celler i 1 ml av hela normala blodprover. Introducera dessa celler i chipet och räkna upp antalet tumörceller som fångats på chipet med grön immunofluorescens. Utför in vivo-uppräkning på chipet enligt beskrivningen ovan och beräkna infångningseffektiviteten efter fångst.
- Upprepa steg 1.4.1 för ytterligare nio koncentrationer av tumörcellnummer från 10 till 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- Räkna upp 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10 tumörceller som beskrivs i steg 1.3 utan färgning, spika i 1 ml helt normalt blod, introducera dessa prover i mikrofluidikchipet och fånga tumörcellerna på chipet.
- Fläck på chipet med Hoechst, CK-FITC och CD45-PE. Sätt 3-5 μL fluorescerande färgämne i 20-30 μL PBS och inför sedan denna lösning på mikrofluidikchipet med en spruta. Räkna upp antalet tumörceller som fångats på chipet med både blå och grön immunofluorescens för att bestämma infångningseffektiviteten.
- Utför modifiering av mikrofluidikchipet för affinitetsbaserad infångning av anti-EpCAM.
Eftersom wave-chipet kombinerar både affinitetsbaserad och fysisk egenskapsbaserad isolering ändrar du chipet med agenter.- Ändra ytan på chipet med 100 μL 4% (v/v) 3-merkaptopropyltrimetoxisilan i etanol vid rumstemperatur i 45 min. För in denna lösning i chipet försiktigt och långsamt om det förstör chipets inre struktur, särskilt bindningen av toppytan och substratglaset.
Spånytan modifieras med merkaptosilan. Interaktionerna som uppstår på chipet bestäms av kemiska bindningar. Kemiska bindningar upprättas för att realisera bindningen av antikroppen modifierad med antigenet. Olika reagens modifieras inuti chipet för att upprätta kemiska bindningar som förbinder med varandra. Det sista reagenset som modifieras är en antiepitelial adhesionsmolekyl (anti-EpCAM). Tumörcellytantigenet för EpCAM kombineras med anti-EpCAM inuti chipet för att realisera fångsten av CTC. - Tvätta med etanol 3x. Tillsätt 100 μl av kopplingsmedlet N-y-maleimidobutyryloxisuccinimidester (GMBS, 1 μM) på chipet och låt det verka i 30 minuter.
- Tvätta med PBS 3x. Använd en spruta för att införa 1 ml PBS på chipet för att tvätta.
- Behandla chipet med 30-40 μL 10 μg/ml neutravidin vid rumstemperatur i 30 minuter, vilket leder till immobilisering av cellerna på GMBS, och spola sedan med PBS för att avlägsna överskott av avidin.
- Ändra chipet med 3 μL antibiotinylerad EpCAM-antikropp vid en koncentration av 10 μg/ml i 100 μL PBS med 1% (w/v) BSA. Håll detta över natten.
- Ändra ytan på chipet med 100 μL 4% (v/v) 3-merkaptopropyltrimetoxisilan i etanol vid rumstemperatur i 45 min. För in denna lösning i chipet försiktigt och långsamt om det förstör chipets inre struktur, särskilt bindningen av toppytan och substratglaset.
2. Kliniskt experiment på chipet för att räkna upp cirkulerande tumörceller (CTC)
- Förbehandla kliniska cancerpatientblodprover med hjälp av röda blodkroppar lys (RBCL) lösning, eller införa 2-3 ml av blodprovet direkt på mikrofluidikchipet med hjälp av en spruta.
- Utför förbehandling, vilket tar cirka 30 min. Samla hela blodprover i antikoagulationsrör. Tillsätt 6-9 ml RBS-lyslösning i 2-3 ml blod. Centrifugera vid 111 x g i 5-8 minuter vid rumstemperatur och kassera det övre lagret av röd klar vätska.
- Fånga, färga, känna igen och räkna upp cellerna på chipet enligt beskrivningen nedan.
- Fånga cellerna på chipet enligt beskrivningen i steg 1.Färga chipet för CTC: erna som fångats med Hoechst, CK-BITC och CD45-PE. CK-FITC är en specifik fläck för tumörceller, och CD45-PE är för vita blodkroppar.
- Tillsätt 3 μL CK-FITC till 20 μL PBS. För in detta i sprutan och pumpa den utspädda CK-FITC på chipet. Låt färga i 30 min. För in 300 μL PBS på chipet för att tvätta chipet.
- Tillsätt 3 μL CD45-PE till 20 μL PBS. För in detta i sprutan och pumpa den utspädda CD45-PE på chipet. Låt stå i 30 min. För in 300 μL PBS på chipet för att tvätta chipet.
- Identifiera CTC: erna med ett inverterat fluorescensmikroskop vid 20x eller 40x förstoring. CTC avger både blå och grön fluorescens, och vita blodkroppar (WBC) avger både blå och röd fluorescens. Identifiera CTC med både blå och grön fluorescens och WBC med både blå och röd fluorescens.
- Från immunofluorescensbilderna räknar du upp antalet CTC som fångats på chipet. Räkna upp CTC: erna som Hoechst + / CK-FIT + / CD45 − och WBC: erna som Hoechst + / CK-FITC − / CD45 +.
- Berika de fångade CTC: erna genom att spola med PBS genom sprutan i omvänd riktning på mikrofluidikchipet för att samla CTC: erna som fångats på chipet från inloppet. Använd en spruta med 1 ml PBS, för in den från utloppet för att berika CTC: erna som fångas på chipet inom 2-3 minuter och samla dem från inloppet. Använd 1 ml PBS för varje tvättsteg och upprepa 3x.
- Färga tumörcellerna eller CTC som fångas på det mikrofluidiska chipet som beskrivs nedan.
- Färga med calcein AM. Tillsätt 5 μL kalcstein AM till 20 μL PBS, färga cellerna i 30 minuter, centrifugera sedan vid 111 x g i 2 minuter vid rumstemperatur för att erhålla tumörceller och suspendera i 1 ml PBS.
- För att identifiera cellkärnorna, tillsätt 20 μL DAPI-lösning (10 μL DAPI-reagens i 20 μL PBS) till chipet vid den optimala flödeshastigheten 1 ml / h för stora ellipsmikrofilter och 1,5 ml / h för trapetsformade. Passera genom 20 μL anti-cytokeratin stamlösning (3 μL anti-cytokeratinantikropp i 20 μL PBS) för att reagera med chipet i 30 minuter.
- Fläcka WBC: erna som fångats på chipet. Efter att CTC: erna har fångats på chipet, tillsätt 25 μL anti-CD45-antikroppslösning (5 μL anti-CD45-lösning i 20 μL PBS) till chipet och låt färga i 30 minuter. Tvätta med PBS och identifiera epitelcellerna med både blå och grön fluorescens.
- Utför immunofluorescensidentifiering med fluorescensmikroskopi enligt beskrivningen nedan.
- Använd ett fluorescensmikroskop och excitera provet med den blå lasern. Hitta cellerna som avger blå fluorescens, som är kärnceller. Använd någon av följande förstoringar: 10x, 20x eller 40x. Hitta ett tydligt fält för tumörcellen. För den blå laserkällan, använd en excitationsplatta våglängd på 420-485 nm och en emissionsplatta våglängd på 515 nm.
- Utan att flytta proverna, använd en annan laserkälla. Rotera fluorescensmikroskopet och excitera provet med den gröna lasern. Hitta cellerna som avger grön fluorescens, vilket indikerar tumörceller. Ta bilder av samma fält med samma förstoring med denna gröna laserkälla. De celler som avger både blå och grön fluorescens känns igen som tumörceller. För den gröna laserkällan, använd en excitationsplatta våglängd på 460-550 nm och en emissionsplatta våglängd på 590 nm
- Utan att flytta proverna, använd en annan laserkälla. Rotera fluorescensmikroskopet och excitera provet med den röda lasern. Hitta cellerna som avger röd fluorescens. Ta bilder av samma fält med samma förstoring med denna röda laserkälla. De celler som avger både blå och röd fluorescens känns igen som vita blodkroppar.
- Spara bilden för erhållen genom att använda var och en av laserkällorna ovan. Ta flera bilder av samma fält med olika färgade lampor.
- Använd ultraviolett ljus med en excitationsplattvåglängd på 330-400 nm och en emissionsplatta våglängd på 425 nm. Använd lila ljus med en excitationsplatta våglängd på 395-415 nm och en emissionsplatta våglängd på 455 nm.
- Beräkna infångningseffektiviteten enligt steg 1.2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela installationen inkluderar en sprutpump, en spruta och ett mikrofluidiskt chip. Cellsuspensionen i sprutan är ansluten till sprutpumpen och cellsuspensionen införs i mikrofluidikchipet för att fånga cellerna. Infångningseffektiviteten för alla mikrofluidiska chips som användes var cirka 90% eller högre. För vågchipet designade vi mikrostrukturer med olika luckor. De små luckorna används för att fånga CTC: erna, och de stora luckorna används för att påskynda flödeshastigheten. Cellsuspensionen flyter snabbt i de stora gapområdena. De missade CTC: erna tenderar att fångas av de små luckorna i den efterföljande matrisen16. För ellipschips utformade vi linjeluckor istället för punktpunktsluckor för att bilda en tunn tunnel för att förbättra fångsten. Därför uppnåddes hög fångsteffektivitet1. Vi designade en ellipsstruktur för att undvika kanter och hörn för att bibehålla livskraften. Trapetsfiltren har två cirkulära spiralkanaler med inbäddade trapetsformade och cirkulära mikropostbarriärer. För trapetsfilter var infångningseffektiviteten för MCF-7, MDA-MB-231 och HeLa 94%, 95% respektive 93%,18.
Figur 1 visar att alla tumörceller fångades upp av vågchipet. Eftersom alla tumörceller koncentrerades runt vågmikropostmatrisen, indikerar detta hög infångningseffektivitet för detta mikrofluidiska chip, vilket demonstreras av antalet tumörceller som fångades. Därför gör denna inställning det mycket lättare att fånga sällsynta tumörceller; Faktum är att chipet är tillverkat för att fånga ett stort antal tumörceller såväl som sällsynt antal tumörceller. Till exempel, om chipet är fast eller reproducerbart nog för att fånga 10 000 tumörceller, är det lätt för chipet att fånga 10-100 celler. Video 1 visar hur sällsynt antal tumörceller erhölls för förexperimentet. En ihålig nål tillverkad med hjälp av en mikropipettdragare användes för att aspirera 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10 tumörceller från en odlingsskål med utspädda tumörceller färgade med calcein AM i PBS. Cellerna absorberades av kiselgelröret som var anslutet till den ihåliga nålen. En tumörcell med grön immunofluorescens sugs in i den ihåliga nålen. Blåsning i det ihåliga röret ledde till att tumörcellen inuti den ihåliga nålen släpptes ut i ett mikrocentrifugrör1. Detta är förfarandet för att erhålla sällsynta tumörceller. Figur 2 visar CTC från en magcancerpatient fångad med hjälp av mikrofilter med liten ellips. Figur 3 visar CTC från en kolorektal cancerpatient fångad med trapetsformade mikrofilter och avger både blå och grön fluorescens. Figur 4 visar tumörceller som odlas på chipet efter fångst, som är redo att behandlas med läkemedel mot cancer. Dessa fynd illustrerar att mikrofilter med stor ellips inte har några negativa effekter på cellviabiliteten.
Figur 5 visar den kliniska immunofluorescensanalysen av kolorektala CTC fångade på mikrofluidikchipet. Dessa ses i ljusfält och färgas med Hoechst, CK-FITC och CD45-PE-färgning. CTC: erna erkändes som DAPI + / CK + / CD45 −, och WBC: erna identifierades som DAPI + / CK − / CD45 +. Figur 6 visar kolorektala tumörceller odlade på storellipschipet efter fångst. Figur 7 visar kolorektala tumörceller fångade på mikrofiltren med stor ellips. Kliniskt fångades CTC i patientblod av vågchips, trapetsformade mikrofilter och mikrofilter med stor ellips, vilket indikerar att dessa tre chips är framgångsrika i att fånga CTC. Potentiellt kan de tillämpas i CTC-produkter, såsom CTC-isoleringsprodukter, med hög effektivitet.
Figur 1: Vågchipsfångst. Alla tumörceller i MCF-7 fångades runt vågchipets matris utan att några celler saknades. Eftersom det inte fanns några tumörceller i något annat område förutom matrisen, indikerar detta chipets höga infångningseffektivitet. Ett stort antal tumörceller fångades. Därför kan sällsynta tumörceller också lätt fångas. Tumörceller av MCF-7 fångades med vågchip och (A) färgades med Hoechst och (B) färgades med calcein AM. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kliniskt prov för CTC som fångats av mikrofilter med liten ellips. Kliniska CTC hos en magcancerpatient fångad av mikrofilter med liten ellips. CTC:erna identifierades i ljusfält och med både blå och grön fluorescens. Den blå cirkeln i (A) indikerar en CTC av en magcancerpatient fångad inuti chipet. Från de tagna bilderna kan man se att det inte fanns några andra celler i några andra områden, vilket indikerar att fångstrenheten var hög för detta chip. Tumörceller av MCF-7 fångades av mikrofilter med liten ellips och sågs i (A) ljusfält, (B) färgade med Hoechst och (C) färgade med CK-FITC. Skalstapel: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kliniskt prov av CTC fångade med trapetsformade mikrofilter. Kliniska CTC från en kolorektal cancerpatient fångades av trapetsformade mikrofilter. I dessa bilder kan man se att sex CTC fångades, vilket indikerar att fångsteffektiviteten var hög i det lilla fältet. Dessutom uppträdde inga andra celler, vilket indikerar att fångstrenheten var extremt hög för detta chip. Tumörceller av MCF-7 fångades av trapetsformade mikrofilter och sågs i (A) ljusfält, (B) färgade med Hoechst och (C) färgade med CK-FITC. Skalstång: 20 μm Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kultur av CTC fångad av mikrofilter med stor ellips. Tumörceller av MCF-7 fångades av mikrofilter med stor ellips framför en stor-ellipsmikropostuppsättning. Inga tumörceller passerade genom matrisen, vilket indikerar hög infångningseffektivitet för detta chip. Efter fångst växte tumörcellerna i 24-48 h. Detta indikerar att både infångningseffektiviteten och livskraften var mycket hög för mikrofiltren med stor ellips. De odlade tumörcellerna i MCF-7 fångades upp av mikrofilter med stor ellips och sågs vid (A) 0 timmar efter fångst, (B) 24 timmar efter fångst och (C) 48 timmar efter fångst. Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempel på ett kliniskt prov som används för CTC-infångning med trapetsformade mikrofilter. Kliniska CTC från en kolorektal cancerpatient fångades av trapetsformade mikrofilter. I dessa bilder kan man se att två CTC fångades, vilket indikerar hög fångsteffektivitet. Det fanns ingen annan cellstörning förutom rester av röda blodkroppar i chipet. För klinisk förbehandling av CTC-infångning är det således bättre att inte använda lys av röda blodkroppar. CTC av kolorektal cancer fångades av trapetsformade mikrofilter och sågs i (A) ljusfält, (B) färgat med Hoechst, (C) färgat med CK-FITC och (D) sett i sammanslagna bilder. Skalstapel: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exempel på odlade CTC:er som fångats upp av ett storellipschip. Tumörcellkulturer av MCF-7-celler framför storellipsmikropostmatrisen och bakom de stora ellipsmikrofiltren. Tumörcellerna färgade med kalcein AM som avger grön fluorescens växte som önskat, vilket indikerar att cellviabiliteten för detta chip var mycket hög. Totalt fanns det 15 matriser, med olika luckor för varje matris organiserad av stora ellipsmikroposter. MCF-7-tumörceller odlades på storellipschipet efter fångst (A) i en matris och (B) i en annan matris. Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Exempel på ett kliniskt prov som används för CTC-infångning med mikrofilter med stor ellips. Kliniska CTC från en kolorektal cancerpatient fångades av mikrofilter med stor ellips. Från bilderna kan man se att det fanns RBC-förorening. Detta indikerar att hela patientens blodprov måste spädas och att chipet måste spolas efter fångst. CTC av blodprover från patienter med klinisk kolorektal cancer fångades på storellipschipet och sågs i (A) ljusfält, (B) färgat med Hoechst och (C) färgat med CK-FITC. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prognosen och tidig diagnos av cancer har en signifikant effekt på cancerbehandling1. CTC-isolering med mikrofluidiska chips erbjuder en flytande biopsi utan invasion. CTC är dock extremt sällsynta och heterogena i blodet1, vilket gör det utmanande att isolera CTC. CTC har liknande egenskaper som de ursprungliga tumörkällorna från vilka de härstammar. Således spelar CTC en viktig roll vid cancermetastaser1.
Det föreslagna protokollet möjliggör en fullständig analys av CTC-isolering med det mikrofluidiska chipet. Protokollet innehåller alla viktiga procedurer relaterade till CTC-isolering. Till exempel inkluderar detta protokoll RBCL-analyser, som registreras noggrant och organiseras i olika paket, sällsynt tumörcellförvärv, optimal flödeshastighetsbestämning, fångsteffektivitet, klinisk karakterisering och uppräkning. Den noggranna hanteringen av operationerna underlättar den kliniska behandlingen av patientprovet. Protokollet möjliggör förbehandling och behandling av kliniska patientprover och erbjuder viktiga tjänster för kliniker.
För CTC-isolering är förbehandlingen av sällsynta tumörceller extremt svår att utföra. Denna svårighet löstes genom att använda en ihålig nål som drogs genom en nåldragare för att suga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10 tumörceller efter önskemål. Därefter preparerades ett nära verkligt kliniskt patientblodprov med önskat antal tumörceller blandade i normalt blod, vilket efterliknade ett patientblodprov. Med dessa konstgjorda patientblodprover genomfördes ett nära verkligt experiment. Denna metod har löst ett svårt problem som vanligtvis möts i CTC-isolering för förexperiment. Detta tillvägagångssätt är inte lätt att utföra och har aldrig rapporterats någon annanstans. Det är dock ett användbart tillvägagångssätt innan du utför ett verkligt kliniskt experiment.
CTC-isolering med mikrofluidiska chips klassificeras i tre typer: affinitetsbaserad, fysiskbaserad och immunomagnetisk. För affinitetsbaserad isolering måste mikrofluidikchipet modifieras. De specifika modifieringsprocedurerna har inkluderats för modifiering med anti-EpCAM. CTC: erna identifierades genom immunofluorescensfärgning med Hoechst, CK-FITC och CD45-PE. Eftersom många tumörceller uttrycker EpCAM är anti-EpCAM en viktig antikropp för att fånga CTC i patientens blod. Anti-EpCAM är dock mycket dyrt; Således har många aptamerer utvecklats för att lösa detta problem. Vi använder främst fysikaliska mikrofluidiska chips som mikrofilter med liten ellips och trapetsformade mikrofilter för att fånga CTC eftersom de är enkla, lätta att använda och effektiva.
Fördelen med denna teknik jämfört med alternativa tekniker är att det fysikaliskt baserade chipet av stora ellipsmikrofilter fångar CTC med hög infångningseffektivitet. Anledningen till detta är att det finns smala tunnlar av linjegap. Vågchips fångar CTC genom att kombinera både fysisk egenskapsbaserad och affinitetsbaserad isolering. CTC: erna fångas upp av de små luckorna, och de stora luckorna kan användas för att påskynda flödeshastigheten. De missade CTC:erna måste passera genom de små luckorna i följande matriser och fångas också upp av den affinitetsbaserade isoleringen.
Protokollet har löst flera stora problem vid CTC-isolering, särskilt för kliniska experiment. Det är dock omöjligt att inkludera varje detaljerat steg i CTC-isolering, till exempel när det gäller nanopartiklarnas och nanostrukturernas roll och aptamermodifiering. Dessa aspekter spelar också en viktig roll vid CTC-isolering. De är dock inte kritiska för att lösa problem som att förbättra fångsteffektiviteten. Istället berikar dessa aspekter CTC-isoleringen med nytt innehåll.
Detta arbete koncentrerar sig på klinisk isolering av CTC med det designade mikrofluidiska chipet. De flesta mikrofluidiska chips som används är huvudsakligen fysikaliskt baserade, såsom stora ellipsfilter och små ellipsfilter. Vågchips tillverkas genom att kombinera både affinitetsbaserade och fysikaliska baserade chipegenskaper1. Mikrostolparna i stora ellipsfilter utformades för att vara kortare för att förbättra infångningsrenheten i detta arbete. De små ellipsfiltren kan också förbättras genom att designa dem med olika mikropoststorlekar för olika matriser. Vågchips kan utformas bättre genom att lägga till fler matriser för att förbättra fångsten.
Storellipsfilter är organiserade med långa elliptiska mikrostolpar för att bilda linjetunnlar som uppnår hög infångningseffektivitet. Begränsningen av denna fångst är dock att fångstrenheten inte är tillräckligt hög eller hög fångstrenhet inte lätt erhålls. För vågchip används de små luckorna för att fånga CTC: erna, och de missade CTC: erna fångas av följande matriser. De stora luckorna används för att påskynda flödeshastigheten och eliminera störningar från RBC, vilket förbättrar fångstens renhet; Infångningseffektiviteten är dock solid på över 90% och är reproducerbar.
Klinisk validering är signifikant vid CTC-isolering med mikrofluidiska chips. Detta arbete presenterar den kliniska isoleringen av CTC från kolorektala patienter med stora ellipsfilter, små ellipsfilter och vågchips. Syftet med de designade mikrofluidiska chipen är att kliniskt räkna upp CTC. För de befintliga metoderna i vissa andra system eller plattformar är infångningseffektiviteten låg, eller infångningseffektiviteten är inte tillräckligt hög för att metoden ska kunna användas effektivt i kliniska tillämpningar.
Baserat på de kliniska resultaten hos dessa tre mikrofluidiska chips, som har hög infångningseffektivitet, kan de potentiellt appliceras i CTC-produkter, särskilt efter modifiering. Styrkan i vårt protokoll är att det visar uppräkningen av sällsynt antal tumörceller för att efterlikna verkliga kliniska prover. Dessutom är det kliniska experimentella förfarandet genomförbart och praktiskt. Denna metod kan separera CTC från helpatientblod. Därför är metoden lämplig för kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta forskningsarbete stöddes av Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), National Natural Science Foundation of China (21904003), Tianjins utbildningskommissions vetenskapliga forskningsprojekt (2018KJ154), Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) och Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Bearbetning, East China Normal University (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
